王明 薩如拉 王超奇 燕貞

內(nèi)蒙古民族大學附屬醫(yī)院1生殖醫(yī)學中心，2男科實驗室，3泌尿外科（內(nèi)蒙古 通遼 028000）；4海南醫(yī)學院（?？?571199）

精子的形成是哺乳動物生殖系統(tǒng)中一個復雜的發(fā)育過程，由精原干細胞（spermatogonial stem cells，SSCs）分化而成[1]。SSCs能夠維持干細胞池的自我更新使精子連續(xù)分化分裂，表現(xiàn)在嚙齒動物生精上皮細胞克隆排列，通過分子標記（例如，ID4、GFRa1、PLZF、SALL4等）可評估睪丸SSCs維持精子發(fā)生的水平[2]。SSCs對精子發(fā)生至關重要，但僅占成年小鼠睪丸總細胞的0.02%～0.03%[3]。由于它是唯一能夠?qū)⑦z傳信息傳遞給下一代的干細胞。因此，它們是基因改造實驗的有前途的資源。其次，生命過程中的自我更新和SSCs的分化能力可用于闡明導致精子發(fā)生的信號通路。最后，SSCs的全能性可分化為所有細胞系[2，4]。因此，SSCs可用于生殖醫(yī)學中治療不孕癥以及非免疫排斥性疾病[5]。

最近有研究[6]表明，微小 RNA（microRNA，miRNA）是一類內(nèi)源性單鏈RNA分子（18-25個核苷酸），參與不同的細胞過程，包括自我更新、增殖、分化和凋亡。它們與靶mRNA的3'非翻譯區(qū)（untranslated region，UTR）結(jié)合，導致靶mRNA的核酸內(nèi)切裂解或翻譯抑制[7]。多項研究發(fā)現(xiàn)miRNA可以調(diào)節(jié)SSCs增殖和分化之間的平衡，認為miRNAs是精子發(fā)生的重要調(diào)控元件[8-9]。例如，在SSCs中miRNA-100的高表達通過STAT3促進其增殖[9]。此外，SSCs的自我更新受miRNA-10b 和miRNA-322 的調(diào)節(jié)[2，10]。miRNA-202 對細胞周期調(diào)節(jié)因子和RNA結(jié)合蛋白的抑制導致精原干細胞的存活[11]。有研究指出miR-let-7家族與精原細胞自我更新相關的基因的調(diào)控相關[12]。但是，單個miRNA對于調(diào)節(jié)SSCs的功能和分子機制的必要性值得進一步研究。

1 材料與方法

1.1 主要耗材和儀器氯胺酮、注射用環(huán)磷酰胺（美國Sigma-Aldrich公司）；青霉素和鏈霉素、PBS、DNase（美國Sigma-Aldrich公司）；Ⅳ型膠原酶（美國Gibco公司）；透明質(zhì)酸酶、臺盼藍（美國Sigma-Aldrich公司）；一抗ID4和Thy1、二抗FITC山羊抗兔IgG H&L（美國CST公司）；白血病抑制因子（美國Sigma公司）；堿性成纖維細胞生長因子（美國Peprotech公司）；β-巰基乙醇、神經(jīng)膠質(zhì)細胞系衍生神經(jīng)營養(yǎng)因子、miR-let-7c抑制劑（美國Sigma-Aldrich公司）；Lipofectamine 2000、Opti-MEM（美國Invitrogen公司）；TRIzol試劑（美國Invitrogen公司）；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（日本Takara公司）；GoTaq qPCR Master Mix（美國Promega公司）；ABI7500 PCR擴增儀（美國Applied Biosystems公司）；倒置顯微鏡（日本Olympus公司）；4%多聚甲醛、Triton X-100、山羊血清（美國Sigma-Aldrich公司）；cKit、FITC、DAPI（英國Abcam公司）；熒光顯微鏡（日本Olympus公司）；TriPure Isolation試劑（德國Roche公司）；SDS-PAGE（美國BioRad Laboratories公司）；PVDF膜（德國Roche公司）；GAPDH、GFRα1、PLZF和ID4一抗、HRP偶聯(lián)山羊抗兔二抗（英國Abcam公司）。

1.2 SSCs分離SPF級Balb/c雄性（3～6 d齡）和Balb/c雄性裸鼠（5～6周齡，體質(zhì)量20～22 g）各40只購自北京華阜康生物科技股份有限公司，合格證號：SYXK（京）2019-0022，倫理審查編號：NM-LL-2022-07-19-1。參照之前的方法[13]，進行SSC的分離。簡而言之，Balb/c小鼠使用0.05 mg/kg氯胺酮麻醉；然后取出的睪丸立即轉(zhuǎn)移到含有PBS的培養(yǎng)皿中。在無菌條件下，用1%青霉素和鏈霉素的PBS洗滌樣品。切碎的睪丸轉(zhuǎn)移到含有5 μg/mL DNase、1 mg/mLⅣ型膠原酶和1 mg/mL透明質(zhì)酸酶的消化培養(yǎng)基中。然后在37℃和5%CO2下孵育20 min。每5分鐘輕輕移去上層懸浮液。以1 500g離心5 min。使用相同的消化培養(yǎng)基純化細胞沉淀15 min。最后，使用血細胞計數(shù)器，0.04%臺盼藍評估細胞的活力。

1.3 SSCs純度測定參照之前的方法[14]，使用ID4和Thy1標記細胞，使用流式細胞術進行純度測定。簡而言之，將1×105個細胞在100 μL PBS/FBS和10 μL一抗（ID4和Thy1）中4℃孵育1 h。用PBS洗滌兩次后，將細胞在100 μL PBS/FBS和10 μL二抗中4℃孵育1 h。FITC山羊抗兔IgG H&L用作ID4和Thy1的二抗。對照組細胞不與抗體一起溫育。最后，細胞保存在冰上的暗室中，通過流式細胞術測定純度百分比。

1.4 SSCs培養(yǎng)使用含有DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)純化后的細胞（2×105細胞/cm2），在培養(yǎng)基中加入成分：10%FBS、10 ng/mL白血病抑制因子、10 ng/mL堿性成纖維細胞生長因子、0.1 mmol/L β-巰基乙醇、10 ng/mL神經(jīng)膠質(zhì)細胞系衍生神經(jīng)營養(yǎng)因子、1%青霉素和鏈霉素。所有培養(yǎng)物在37℃下在5%CO2的加濕培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，培養(yǎng)基每2～3 d更換一次。

1.5 細胞轉(zhuǎn)染培養(yǎng)的SSC分為4組：（1）未轉(zhuǎn)染組；（2）miR-let-7c抑制劑組；（3）抑制劑對照組；（4）轉(zhuǎn)染組。處理方式分別為：（1）未轉(zhuǎn)染組：SSC細胞不接受轉(zhuǎn)染處理，正常培養(yǎng)基培養(yǎng)；（2）miR-let-7c抑制劑組：lipofectamine 2000在Opti-MEM轉(zhuǎn)染培養(yǎng)基中將含有miR-let-7c抑制劑的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至SSC細胞，轉(zhuǎn)染后換正常培養(yǎng)基培養(yǎng)；（3）抑制劑對照組：lipofectamine 2000在Opti-MEM轉(zhuǎn)染培養(yǎng)基中將含有miRNA抑制劑對照物的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至SSC細胞，轉(zhuǎn)染后換正常培養(yǎng)基培養(yǎng)；（4）轉(zhuǎn)染組：lipofectamine 2000在Opti-MEM轉(zhuǎn)染培養(yǎng)基中處理SSC細胞，后換正常培養(yǎng)基培養(yǎng)。具體的轉(zhuǎn)染方法參照文獻[15]收集細胞用于評估蛋白表達的變化。1周后通過平板克隆實驗評估SSC的增殖能力。

1.6 qRT-PCR為了驗證miR-let-7c轉(zhuǎn)染在SSC中的有效表達，使用qRT-PCR在轉(zhuǎn)染后48 h檢測miR-let-7c的表達量。TRIzol試劑用于總RNA提取。然后使用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒用于合成cDNA。Go-Taq qPCR Master Mix為模板擴增試劑，ABI7500 PCR擴增儀用于檢測miR-let-7c擴增表達量。U6 snRNA作為內(nèi)參基因，通過2-ΔΔCT方法計算miR-let-7c表達量。引物序列如下：miR-let-7c F：5'-AATTCAAAAATGAGGTAGTAGGTTGTATGGTT-3'；R：5'-CCGGAACCATACAACCTACTACCTCATTTTTG-3'。U6 F：5'-CTCGCTTCGGCAGCACA-3'；R：5'-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3'

1.7 SSCs增殖評估轉(zhuǎn)染后，將2×105細胞/cm2SSCs接種到含有10%FBS、1%青霉素鏈霉素、10 ng/mL白血病抑制因子和10 μg/mL神經(jīng)營養(yǎng)因子的DMEM中培養(yǎng)，存放在5%CO2、37℃存放1周。使用倒置顯微鏡測定集落的直徑和數(shù)量。使用Image J軟件對數(shù)據(jù)進行分析。

1.8 免疫組化SSC用4%多聚甲醛固定、0.1%Triton X-100透化，然后用10%山羊血清封閉1 h。將樣品與C-Kit一起孵育24 h，然后與二抗FITC室溫孵育2 h。細胞核用DAPI染色。熒光顯微鏡用于觀察載玻片。

1.9 Western blotTriPure Isolation試劑用于提取SSC總蛋白。進行電泳以分離樣本蛋白，將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到10%SDS-PAGE和PVDF膜上，并用5%脫脂牛奶封閉。隨后，將樣本與針對GFRα1、PLZF和ID4的一抗在4℃下孵育過夜。加入適當?shù)亩笻RP偶聯(lián)山羊抗兔后，將PVDF膜孵育2 h。最后，使用增強的化學發(fā)光評估蛋白質(zhì)的表達。

1.10 在體實驗Balb/c裸鼠適應性飼養(yǎng)5 d后，隨機分為對照組、模型組、miR-let-7c抑制劑組、抑制劑對照組，每組10只。模型組、miR-let-7c抑制劑組、抑制劑對照組小鼠按照60 mg/（kg·d）腹腔注射環(huán)磷酰胺[16]，連續(xù)5 d，對照組用等量生理鹽水腹腔注射。第6天開始，miR-let-7c抑制劑組、抑制劑對照組小鼠分別給予附睪內(nèi)注射轉(zhuǎn)染miR-let-7c抑制劑的SSC或miRNA抑制劑對照物的SSC。到第30天，不同組小鼠經(jīng)過干預后，頸椎脫臼處死小鼠，取雙側(cè)睪丸和附睪，參照之前的文獻[17]對裸鼠精子濃度、活力及形態(tài)分析。

1.11 統(tǒng)計學方法采用GraphPad Prism 7.0軟件，數(shù)據(jù)表示為均數(shù)±標準差。使用one-way ANOVA和Tukey post-hoc test分析數(shù)據(jù)。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 SSCs的鑒定使用流式細胞術分析未分化精原細胞標記物ID4和Thy1的表達，用于鑒定SSCs。SSCs中標記物的表達百分比分別為84.3%和97.4%（圖1）。

2.2 評估SSC中miR-let-7c的表達miR-let-7c表達在轉(zhuǎn)染前和轉(zhuǎn)染后48 h使用qRT-PCR進行評估。結(jié)果表明，與未轉(zhuǎn)染組相比，miR-let-7c抑制劑組的miR-let-7c表達水平顯著降低（t=28.475，P＜0.05）。在抑制劑對照組和轉(zhuǎn)染組中沒有觀察到顯著變化（P＞0.05，圖2）。

2.3 miR-let-7c的抑制誘導了小鼠SSCs的增殖轉(zhuǎn)染1周后，倒置顯微鏡拍攝集落圖像（圖3A-F），使用Image J軟件測量集落直徑和數(shù)量。結(jié)果顯示miR-let-7c抑制劑組的集落直徑明顯小于其他組（F=49.781，P＜0.05），而集落數(shù)量與其他組無明顯變化（P＞0.05，圖3G-H）。

2.4 miR-let-7c的抑制誘導了小鼠SSCs的分化c-Kit作為分化標志物在轉(zhuǎn)染后48 h使用免疫細胞化學進行評估。與其他組細胞相比，miR-let-7c抑制劑組中c-Kit分化基因的表達顯著增加（F=165.336，P＜ 0.05，圖4）。這表明miR-let-7c的抑制誘導了小鼠SSCs的分化過程。

2.5 miR-let-7c的抑制下調(diào)了增殖相關蛋白的表達轉(zhuǎn)染48 h后，Western blot用于研究增殖相關蛋白[（膠質(zhì)細胞源性神經(jīng)營養(yǎng)因子a1（glialcelllinederivedneurotrophicfactor a1，GDNFa1）、早幼粒細胞白血病鋅指（PLZF，promyelocytic leukemia zinc finger）和分化抑制因子4（inhibitor of differentiation，ID4）]的表達。結(jié)果顯示，與其他組相比，miR-let-7c抑制劑組中GFRa1、PLZF和ID4的表達顯著降低（F=98.556、78.358、91.249，P＜ 0.05，圖5）。

2.6 miR-let-7c的抑制對小鼠生長及精子質(zhì)量的影響模型組精子質(zhì)量較對照組顯著下降，經(jīng)miR-let-7c抑制劑轉(zhuǎn)染后精子質(zhì)量得到了顯著恢復；精子濃度、精子活力和正常形態(tài)率均有顯著提高（F=27.936、52.417、31.582、47.659，P＜ 0.05，表1）。

表1 不同組小鼠處理后精子質(zhì)量比較Tab.1 Comparison of sperm quality in different groups of mice after treatment ±s

表1 不同組小鼠處理后精子質(zhì)量比較Tab.1 Comparison of sperm quality in different groups of mice after treatment ±s

注：與對照組比較，*P＜0.05；與模型組比較，#P＜0.05

組別對照組模型組miR-let-7c抑制劑組抑制劑對照組例數(shù)10 10 10 10精子濃度（×106/mL）4.30±0.12 2.94±0.16*3.90±0.12#3.12±0.12精子活力前向運動精子（%）15.70±0.79 6.53±0.72*8.76±0.48#6.37±0.34非前向運動精子（%）16.71±0.71 7.77±0.36*12.97±1.19#7.93±0.34正常形態(tài)精子（%）60.38±2.22 30.03±1.65*57.48±1.63#29.09±1.44

3 討論

SSCs在形成和促進精子發(fā)生方面發(fā)揮著重要作用。精子形成是一個受到高度調(diào)控化過程，需要在SSCs的增殖和分化之間獲得平衡。這種平衡受內(nèi)在因素和外在信號的調(diào)節(jié)，在決定精子的供應和生育能力方面起著關鍵作用[18]。miRNA對生物過程的調(diào)控至關重要，并且通過與其特定mRNA的3'UTR結(jié)合而發(fā)揮作用。最近的研究表明，多種miRNA可能通過調(diào)節(jié)靶基因表達促進哺乳動物的精子發(fā)生[19]。然而，單個miRNA調(diào)控精子形成機制和靶點大多是未知的。幾項研究報告稱，ID4的表達僅限于精原細胞并且ID4的過表達抑制了干細胞到祖細胞的轉(zhuǎn)變[20]。因此，ID4可用于SSCs的識別和鑒定。Thy-1是Ig超家族的糖基磷脂酰肌醇錨定糖蛋白，已被引入牛、嚙齒動物和靈長類動物中作為SSCs的鑒定標志物[21]。在經(jīng)酶消化和原代培養(yǎng)后，用流式細胞術鑒定了細胞ID4和Thy1的表達比率并檢測了該細胞的miR-let-7c基礎表達水平，結(jié)果表明提取的細胞為SSCs。隨后觀察了miR-let-7c抑制劑處置后SSCs增殖和分化的改變，表現(xiàn)為miR-let-7c抑制劑可導致SSCs集落直徑明顯減小。因為SSCs首次出現(xiàn)在小鼠產(chǎn)后3～6 d。ID4在SSCs自我更新或未分化狀態(tài)的調(diào)節(jié)中起著關鍵作用。ID4的表達僅限于As精原細胞，其過表達抑制了干細胞向祖細胞的轉(zhuǎn)變。這些結(jié)果與其他研究一致[2，4，10]。

研究表明，在小鼠未分化SSCs中主要檢測到GFRα1表達。GFRα1是GDNF的主要受體，被認為是GFRα1/RET信號通路的必要成分[22-23]。GDNF作為維持SSCs不可或缺的因素，通過與GFRα1/RET受體結(jié)合發(fā)揮作用，并調(diào)節(jié)參與促進SSCs自我更新或阻止SSCs分化基因的表達。早幼粒細胞白血病鋅指PLZF的下調(diào)可導致mTORC1激活、GDNF受體（包括GFRa1和RET）的下調(diào)、SSCs對GDNF的反應的抑制以及SSCs增殖的抑制。此外，PLZF還直接和間接抑制分化基因c-Kit的表達[24-25]。在本研究中顯示，細胞轉(zhuǎn)染后48 h GFRα 1、PLZF和ID4蛋白的表達，GFRα1、PLZF和ID4蛋白的表達下調(diào)。這表明miR-let-7c的下調(diào)減少了SSCs的自我更新和增殖。

C-kit是Ⅲ類受體酪氨酸激酶的成員，它僅存在于分化的精原細胞中，被認為是精原細胞分化的良好表征的標志物。SSCs從未分化狀態(tài)到分化狀態(tài)的轉(zhuǎn)變與Kit/Kitl系統(tǒng)的激活一致[26]。在c-kit激活之后，分化的SSCs將進入減數(shù)分裂并開始表達早期減數(shù)分裂標志物，包括STRA8、Dmc1和Scp3[27]。在免疫組化結(jié)果顯示，與其他組相比，轉(zhuǎn)染miR-let-7c抑制劑的SSCs中分化蛋白c-Kit的表達顯著增加。表明miR-let-7c的抑制誘導了小鼠SSCs的分化過程。

根據(jù)既往研究中所述[17]的小鼠少弱精子癥模型，發(fā)現(xiàn)模型制備后出現(xiàn)小鼠的精子數(shù)量減少、精子活力下降等生殖毒性，這是少弱精子癥的具體表現(xiàn)，在此模型的基礎上，研究了miR-let-7c的抑制劑對少弱精子癥動物模型的治療效果。結(jié)果發(fā)現(xiàn)miR-let-7c抑制劑干預30 d后，模型組睪丸組織損傷有所恢復，上述指標均得到了一定程度的改善，這證明轉(zhuǎn)染miR-let-7c抑制劑的SSCs對少弱精子癥具有一定的治療效果。但同時，本研究也存在著局限性，例如應該在更多的鼠源性模型進行試驗和驗證，還應尋找SSCs的增殖和分化標志物進行驗證。

綜上所述，miR-let-7c抑制劑可能促進精原干細胞分化并改善小鼠精子質(zhì)量。在以后的研究中，還會去尋找到類似的miRNA去探索和功能驗證。