潘昕瑤 李婷 吳耀彬 李嚴(yán)兵 黃文華，2

1南方醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院醫(yī)學(xué)生物力學(xué)廣東省重點驗室，人體解剖學(xué)國家重點學(xué)科廣東省醫(yī)學(xué)3D打印應(yīng)用轉(zhuǎn)化工程研究中心（廣州 510515）；2南方醫(yī)科大學(xué)第三附屬醫(yī)院3D打印應(yīng)用翻譯廣東醫(yī)療創(chuàng)新平臺（廣州 515510）

骨骼?。╯keletal muscle）約占人體質(zhì)量的45%[1]，通過對骨骼收縮牽拉參與骨骼的運動與支持。骨骼肌有著豐富的血管與神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)，調(diào)節(jié)肌肉的物質(zhì)交換營養(yǎng)代謝活動，常因疾病或創(chuàng)傷等受損導(dǎo)致部分功能障礙，較小損傷骨骼肌組織可自行修復(fù)再生，但大面積損傷超過肌組織再生能力需手術(shù)介入治療[2]。大面積骨骼肌損傷（volumetric muscle loss，VML）是一種由于創(chuàng)傷、骨折固定或退行性疾病等病因[3]，導(dǎo)致其損傷超出組織自身修復(fù)再生能力的慢性功能損害[4]，嚴(yán)重可導(dǎo)致終生的功能缺陷。目前臨床促進骨骼肌再生的治療主要有手術(shù)介入、納米技術(shù)等[5]，然而上述方法無法產(chǎn)生完整的血管及神經(jīng)連接使組織完全再生及功能恢復(fù)[6]。

骨骼肌組織工程（skeleton muscle tissue engineering，SMTE）旨在修復(fù)缺損重建骨骼肌結(jié)構(gòu)與功能[7]，為目前的臨床治療提供一種組織修復(fù)再生的新方案。3D生物打印技術(shù)作為一種增材制造技術(shù)，基于三維數(shù)字模型設(shè)計，采用活性生物材料可以在特定的條件下以微米級的精確度對細(xì)胞或生物材料進行有序排列。生物3D打印可模擬組織復(fù)雜的微觀結(jié)構(gòu)并精確控制細(xì)胞材料沉積及細(xì)胞的排列分布[8]，在骨骼肌組織工程應(yīng)用中有得天獨厚的優(yōu)勢，已廣泛應(yīng)用于SMTE骨骼肌構(gòu)建[9-10]。此外，3D打印技術(shù)分辨率在10～10 000 μm，能夠構(gòu)建更精細(xì)的仿生結(jié)構(gòu)[11]。體內(nèi)外骨骼肌構(gòu)建工程方法已被應(yīng)用于骨骼肌再生策略，體外通常包括肌原細(xì)胞分化成肌管并在植入體內(nèi)前通過生物反應(yīng)器進行預(yù)處理，生成分化成熟的功能性收縮骨骼肌[12]。此外，通常使用細(xì)胞或多能誘導(dǎo)干細(xì)胞分化后共培養(yǎng)來促進血管網(wǎng)絡(luò)和神經(jīng)肌肉接頭的形成。體內(nèi)多移植黏附在支架上的細(xì)胞，并在移植部位刺激體內(nèi)肌組織和血管神經(jīng)的再生及與宿主的整合。此外，骨骼肌組織功能恢復(fù)需要血管及神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)進行物質(zhì)交換，在體內(nèi)骨骼肌血管化可通過刺激現(xiàn)有血管向內(nèi)生長形成新的毛細(xì)血管，目前常用血管生長因子（VEGF）[10]釋放支架或具有特定結(jié)構(gòu)及化學(xué)成分的支架來構(gòu)建血管網(wǎng)絡(luò)。

本文首先介紹主要的生物3D打印技術(shù)，并回顧了近年來生物3D打印技術(shù)和組織工程在VML中的研究進展，其中重點探討了3D打印骨骼肌組織在臨床中的應(yīng)用進展，最后進行了生物3D打印骨骼肌組織工程修復(fù)VML的未來展望，以期為骨骼肌再生修復(fù)提供具有臨床潛力的創(chuàng)新成果。

1 生物3D打印技術(shù)

目前常用于骨骼肌組織工程的生物3D打印工藝主要為擠出成型打印（extrusion-based bioprinting）、立體噴墨打?。╯tereoscopic inkjet printing）及激光輔助打?。╨aser-based bioprinting）[11]（圖1）。表1總結(jié)了三種主要技術(shù)，并對比了三種技術(shù)的生物性能、打印性等各種優(yōu)缺點。

表1 常用的3D生物打印技術(shù)比較[16]Tab.1 Common 3D Bioprinting techniques[16]

1.1 擠出成型打?。╡xtrusion-based bioprinting）擠出成型打印技術(shù)廣泛應(yīng)用于骨骼肌組織工程，采用氣動或機械動力擠壓生物材料或生物墨水，并逐層沉積打印[13]，可兼容多種材料多梯度打印以及粘性范圍廣泛的生物材料（＜ 6 × 107mPas）[7]，然而較強壓力會影響細(xì)胞活性且低粘度的生物墨水打印的其結(jié)構(gòu)仿真度有限。FAN等[14]采用氣動擠壓打印技術(shù)，構(gòu)建不同直徑骨骼肌肌束，采用MHC抗體染色、低溫電子顯微鏡和phalloidin染色等方式直觀地顯示了纖維蛋白水凝膠系統(tǒng)中的骨骼肌組織三維構(gòu)建的動態(tài)變化過程，并進行了小鼠成肌細(xì)胞（C2C12）的空間排列及分化的力學(xué)測試與數(shù)據(jù)分析。結(jié)果顯示高壓作用下，肌束較厚的細(xì)胞成熟度小于薄束的細(xì)胞成熟度，每單位面積較細(xì)的骨骼肌肌束纖維可承受更大的力，這種3D打印策略為體外3D骨骼肌組織的構(gòu)建提供了理論參照。KIM等[15]開發(fā)神經(jīng)-骨骼肌整合結(jié)構(gòu)，旨在治療大面積骨骼肌損傷及功能恢復(fù)，他們利用氣動擠壓打印含人類肌肉祖細(xì)胞（human muscle progenitor cells，hMPCs）和人類神經(jīng)干細(xì)胞（human neural stem cells，hNSCs）骨骼肌結(jié)構(gòu)并分析了神經(jīng)細(xì)胞對肌肉細(xì)胞的活性、增殖及分化的影響，評估肌源性及神經(jīng)元的分化和體外結(jié)構(gòu)中神經(jīng)骨骼肌肌肉接頭（neuromuscular junctions，NMJs）的形成。結(jié)果表明，神經(jīng)營養(yǎng)因子和神經(jīng)遞質(zhì)在預(yù)形成的NMJs中釋放，增加了細(xì)胞肌源性分化并誘導(dǎo)NMJ的形成，促進TA缺陷小鼠模型骨骼肌功能快速恢復(fù)，從而印證了hMPCs和hNSCs細(xì)胞間相互作用可促進肌肉的成熟和發(fā)育以及體內(nèi)與宿主神經(jīng)的快速整合以增加骨骼肌細(xì)胞的增殖和分化。

1.2 立體噴墨打?。╯tereoscopic inkjet printing）立體噴墨打印也可兼容多材料梯度打印，與擠出成型打印不同的是，立體噴墨打印設(shè)備簡單、成本低廉，可采用噴墨噴射打印流體材料（通常使用低粘度＜15 mPas生物墨水）進行打印，獲得較高（＞85%）的細(xì)胞活力，且在打印速度上更勝一籌（1～10 000滴/s）[16]。然而，打印結(jié)構(gòu)分辨率和精確度受到不同噴嘴噴射形態(tài)及生物材料特性[17]的限制，在打印過程中生物墨水需作為具有適當(dāng)?shù)恼扯鹊囊后w狀態(tài)。此外，這種打印技術(shù)還存在生物墨水噴濺現(xiàn)象。

1.3 激光輔助打印（laser-assisted bioprinting）激光輔助打印是利用激光脈沖誘導(dǎo)金屬薄膜（如金、鈦）汽化，形成高壓氣泡，將生物墨水推向基地，需要粘度（＜300 mPas）的生物墨水，成本高、速度快（＜ 1 600 mm/s），打印細(xì)胞活性高（95%）[18]。

2 3D生物材料/生物墨水在骨骼肌組織工程中的應(yīng)用

在3D生物打印過程中，用于封裝細(xì)胞的一種或幾種生物材料的混合物稱為生物墨水，可進行交聯(lián)生成仿生組織結(jié)構(gòu)[16]。GROLL等[19]提出生物墨水的新定義：“一種具有生物活性成分的、能夠使用于生物制造技術(shù)的細(xì)胞墨水”，即適用于所有生物制造技術(shù)，如細(xì)胞打印、組織或器官構(gòu)建、體外模型構(gòu)建等。生物墨水主要根據(jù)細(xì)胞類型和生物打印技術(shù)等決定，理想的生物墨水應(yīng)與組織結(jié)構(gòu)、機械等特性相似或相同[7]。細(xì)胞是生物墨水中必不可少的組成部分，基于細(xì)胞的生物墨水的研究與開發(fā)是目前研究的重要領(lǐng)域[20]。

2.1 海藻酸鹽（Alginate）海藻酸鹽得益于良好的親水性和生物相容性，可與大多天然和人工合成的聚合物及生物活性物質(zhì)混合，創(chuàng)造出細(xì)胞生長的適宜環(huán)境，也可快速離子凝膠化并根據(jù)需要調(diào)節(jié)流變性及力學(xué)性能，較適用于擠壓生物打印。目前，海藻酸鹽已被用作肌細(xì)胞載體生物打印的主要生物墨水材料[21-23]，常與明膠、纖維蛋白等結(jié)合，將其應(yīng)用于3D生物打印[24]。DISTLER等[22]使用氧化藻酸明膠（oxidized alginate-gelatin，ADAGEL）水凝膠包裹C2C12細(xì)胞并調(diào)節(jié)噴嘴尺寸和擠壓力，擠壓C2C12細(xì)胞所產(chǎn)生剪切力可促進細(xì)胞定向排列并在細(xì)胞密度高的區(qū)域分化為有序的肌管段，研究表明ADA-GEL生物墨水成本低、可降解。此外，海藻酸鹽常作為溶液增稠劑或結(jié)構(gòu)穩(wěn)定劑來調(diào)節(jié)生物墨水流變性，構(gòu)建復(fù)雜結(jié)構(gòu)，但配置過程中常因濃度過高而對細(xì)胞活性產(chǎn)生負(fù)面影響[7]。BOLíVAR-MONSALVE 等[25]提出一種連續(xù)混合打印概念的擠壓打印技術(shù)，結(jié)合明膠-甲基丙烯酰-海藻酸鹽與成肌細(xì)胞，打印出仿生肌肉模型并展示出整齊排列的分層肌管結(jié)構(gòu)，打印后顯示高細(xì)胞活性（＞85%）且打印后28 d仍保持高細(xì)胞活性。

2.2 甲基丙烯?；髂z（gelatin methacrylate，GelMA）GelMA含固有RGD和MMP序列并提供細(xì)胞結(jié)合位點，與骨骼肌生物相容，有巨大研發(fā)潛力，具有可生物降解及可調(diào)節(jié)機械特性等優(yōu)點，可設(shè)計用于控制各種細(xì)胞行為，如黏附、增殖和分化。相較高濃度GelMA，低濃度的GelMA水凝膠（≤5%W/V）更適合用作促進細(xì)胞高存活率、增殖及分化的生物墨水。然而，由于低濃度的GelMA打印性差且堆積能力有限因而限制了應(yīng)用[26]。RONZONI等[27]等選用了三種不同的水凝膠生物墨水：（1）明膠甲基丙烯酸酯和海藻酸鹽加紫外光交聯(lián)；（2）甲基丙烯酸明膠、黃原膠與海藻酸纖維蛋白原；（3）氯化鈣和凝血酶交聯(lián)的納米纖維化纖維素（nanofibrillated cellulose，NFC）/藻酸鹽纖維蛋白原，對比了各自對C2C12細(xì)胞產(chǎn)生的影響。研究顯示使用NFC/海藻酸纖維蛋白原為基礎(chǔ)的水凝膠在培養(yǎng)7～14 d后成肌細(xì)胞開始融合，第21天和第28天在3D生物打印結(jié)構(gòu)內(nèi)形成廣泛排列的多核肌管，研究表明細(xì)胞生長并成熟。此外，GelMA已作為負(fù)載細(xì)胞的水凝膠打印材料，廣泛應(yīng)用于體外血管形成及組織再生，然而GelMA預(yù)聚體原位紫外線交聯(lián)可能會引起體內(nèi)免疫抑制并加速組織老化或癌變[28]。NOSHADI等[29]設(shè)計了一款可注射、光交聯(lián)的GelMA水凝膠：以伊紅Y為光引發(fā)劑，三乙醇胺（TEA）為共引發(fā)劑，n-乙烯基己內(nèi)酰胺（VC）為共單體并光交聯(lián)，用于心肌組織修復(fù)。進一步評估力學(xué)性能、孔隙度及生物相容性的研究顯示，可見光交聯(lián)的GelMA水凝膠可促進細(xì)胞生長和功能恢復(fù)，在心臟、血管等多種軟組織的修復(fù)與臨床轉(zhuǎn)化應(yīng)用有巨大潛力。LEE等[30]使用含有hMPCs肌細(xì)胞外基質(zhì)的生物墨水結(jié)合聚乙烯醇開發(fā)了一種可自我校對肌纖維排列的骨骼肌模型，混合生物墨水共同促進了hMPCs增殖與肌源性分化，且這種自我校對的結(jié)構(gòu)整合了血管與神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)，加速骨骼肌功能恢復(fù)，有效修復(fù)并重建大面積骨骼肌損傷。LUO等[31]提出利用低溫保護生物墨水的技術(shù)：通過冷凍板精確控溫在垂直方向上直接進行擠壓生物打印，3D低溫打印水凝膠結(jié)構(gòu)中的成肌細(xì)胞具有更強的活性、增殖及分化，以期應(yīng)用于組織工程及再生醫(yī)學(xué)方面。

3 生物3D打印技術(shù)制備骨骼肌組織工程支架

三維生物材料支架可為細(xì)胞提供人造ECM并模擬組織特性來誘導(dǎo)組織再生，摻入生長因子和蛋白質(zhì)等生物活性劑可促進細(xì)胞粘附分子和生長因子的釋放來引導(dǎo)細(xì)胞黏附、生長、增殖及分化。目前常用的支架主要有脫細(xì)胞支架、水凝膠、納米/導(dǎo)電支架等[32-33]，國外已有研究證實支架在體外和體內(nèi)均支持成肌細(xì)胞生長成熟[34-35]并促進血管生成[36]。QIU等[37]利用脫細(xì)胞神經(jīng)基質(zhì)水凝膠（decellularized nerve matrix hydrogel，DNMG）和神經(jīng)膠質(zhì)源性神經(jīng)營養(yǎng)因子（glial-derived neurotrophic factor，GDNF）修飾脫細(xì)胞神經(jīng)基質(zhì)支架促進神經(jīng)的修復(fù)。實驗橋接50 mm坐骨神經(jīng)損傷并對修復(fù)結(jié)果進行電生理評估和再生骨骼肌組織檢查等實驗，結(jié)果證實DNMG和GDNF修飾的DNM-S支架增強了神經(jīng)再生和功能恢復(fù)，在移植后的6個約肢體功能、電生理反應(yīng)及組織學(xué)形態(tài)均有所改善，為治療長神經(jīng)缺損提供了有效的參考。

QUINT等[10]采用體內(nèi)交聯(lián)GelMA水凝膠制作支持黏附支架，在體內(nèi)利用Laponite納米黏土控制血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）的釋放，用以打印骨骼肌結(jié)構(gòu)。實驗結(jié)果對比未經(jīng)治療的VML小鼠，打印支架可促進肌細(xì)胞生長及骨骼肌功能恢復(fù)，并增加代謝、減少纖維化的發(fā)生，該支架的外科植入為各種情況下的軟組織損傷提供了快速有效的臨床療法。DU等[38]在支架中加入還原氧化石墨烯RGO以改善其力學(xué)性能及導(dǎo)電性，并借此開發(fā)了一種新型高彈性、可拉伸可降解、具有導(dǎo)電性的聚（檸檬酸-辛二醇-聚乙二醇）-石墨烯（graphene，PCEG）納米復(fù)合材料，用于肌源性分化和骨骼肌再生。研究顯示，不影響親水性的前提下加入RGO石墨烯可顯著提高抗降解及抗腫脹能力，增加了支架的肌纖維和體內(nèi)的毛細(xì)血管密度，PCEG納米復(fù)合材料的拉伸強度和模量均顯著提高，材料保持了良好的彈性和拉伸性能。與PCE聚合物和PLGA相比，PCEG納米復(fù)合材料顯著增強了成肌細(xì)胞的附著、增殖及分化和體內(nèi)骨骼肌組織修復(fù)。該研究為骨骼肌組織工程提供了一種具有良好電活性和生物相容性的高彈性、可吸收的納米復(fù)合材料用以制備支架。

4 生物3D打印骨骼肌組織工程的組織修復(fù)及臨床應(yīng)用

4.1 組織修復(fù)在KIM等[11]的工作中進行了打印骨骼肌結(jié)構(gòu)的體內(nèi)研究，結(jié)果顯示在植入后8周大鼠脛骨前（TA）肌肉缺損模型的3D仿生骨骼肌完成了82%的功能恢復(fù)，并且與宿主的血管和神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)相互整合。其團隊后續(xù)的研究中，更是將神經(jīng)細(xì)胞整合到生物打印的骨骼肌結(jié)構(gòu)中促進其與宿主神經(jīng)快速整合，以及體內(nèi)肌纖維的神經(jīng)肌肉接頭NMJ的形成[15]。盡管選用的大鼠TA模型免疫功能低下，仍需進一步研究炎癥和免疫反應(yīng)等相關(guān)宿主反應(yīng)，但上述研究為功能性仿生骨骼肌植入治療VML提供了成功的參考。骨骼肌功能恢復(fù)需要脈管系統(tǒng)來供應(yīng)營養(yǎng)物質(zhì)，運輸代謝廢物，因此在沒有血管神經(jīng)支持環(huán)境下，難以修復(fù)受損的骨骼肌組織結(jié)構(gòu)，促進功能恢復(fù)，因此構(gòu)建骨骼肌血管化和神經(jīng)支配對SMTE骨骼肌再生及體外肌肉建模至關(guān)重要[6]。目前主要有兩種方式誘導(dǎo)產(chǎn)生血管化及神經(jīng)支配：一是體內(nèi)進行血管化/神經(jīng)連接；二是預(yù)血管化/神經(jīng)連接[6，39]（圖2）?；谇捌趯嶒炑芯縖15]，KIM等[40]開發(fā)了一種由多層肌束和AChR簇組成的3D生物打印骨骼肌結(jié)構(gòu)并對預(yù)形成的功能性AChR簇的作用、體內(nèi)結(jié)構(gòu)及神經(jīng)支配情況進行評估。在大鼠盆底肌損傷模型中，植入預(yù)先制成的AChR簇可促進打印結(jié)構(gòu)中功能性骨骼肌重建，并增加體內(nèi)NMJ形成，為肌間神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)連接以及盆底骨骼肌功能恢復(fù)重建提供了創(chuàng)新療法。近年，脫細(xì)胞細(xì)胞外基質(zhì)（decellularized extracellular matrix，dECM）支架及脫細(xì)胞生物支架已被廣泛應(yīng)用于VML及骨骼肌功能恢復(fù)等相關(guān)研究。組織特異性dECM生物墨水可提供復(fù)雜的相關(guān)微環(huán)境，模擬組織環(huán)境中的特定條件，然而在大型組織結(jié)構(gòu)制作應(yīng)用方面，dECM的機械性能和分辨率受限。LEE等[30]報道3D生物打印采用含有hMPCs的生物墨水仿制了可自動對齊的骨骼肌dECM結(jié)構(gòu)，用于促進骨骼肌缺損的功能恢復(fù)，將hMPCs和聚乙烯醇混合出可光交聯(lián)的骨骼肌細(xì)胞外基質(zhì)dECM-MA生物墨水。體外研究表明，聚乙烯醇（PVA）纖維化或浸出后產(chǎn)生的微拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)可誘導(dǎo)hMPCs進行自排列，生物墨水中的組織特異性生化信號以及聚乙烯醇纖維中獲得排列引導(dǎo)的協(xié)同作用可改善hMPCs的分化，打印結(jié)構(gòu)中顯示宿主神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)加速整合、體內(nèi)血管內(nèi)向生長，促進了骨骼肌功能快速恢復(fù)。dECM-MA結(jié)構(gòu)中自對齊肌纖維顯示出大鼠TA肌肉缺損模型的骨骼肌功能快速恢復(fù)，可促進宿主的血管化及神經(jīng)整合，用以治療VML、加速骨骼肌功能恢復(fù)。國外報道了開發(fā)了一種基于顆粒的打印容器，利用dECM生物墨水制作大體積骨骼肌結(jié)構(gòu)治療VML的新策略[39]。研究顯示，相較于dECM海綿和dECM水凝膠結(jié)構(gòu)，3D打印的骨骼肌結(jié)構(gòu)在細(xì)胞活性、肌管形成及肌纖維重建等方便表現(xiàn)更為突出。此外在探究預(yù)血管化肌肉結(jié)構(gòu)促進功能恢復(fù)方面，他們發(fā)現(xiàn)使用同軸噴墨打印將mdECM、vdECM和人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞（human umbilical vein endothelial cells，HUVEC）摻入不同的生物墨水打印制造預(yù)血管化的骨骼肌結(jié)構(gòu)可防止缺氧并促進VML大鼠模型功能恢復(fù)。實驗顯示，vdECM生物墨水在培養(yǎng)14 d時表現(xiàn)出最好的細(xì)胞增殖及血管生成相關(guān)的基因表達(dá)，植入的預(yù)血管化肌肉組織在VML大鼠模型中促進了骨骼肌新生以及85%的VML損傷的骨骼肌功能恢復(fù)。綜上，骨骼肌結(jié)構(gòu)的血管化和神經(jīng)連接對肌肉打印結(jié)構(gòu)的細(xì)胞活性、肌細(xì)胞成熟以及損傷后骨骼肌的功能恢復(fù)都是必要的。

4.2 臨床應(yīng)用生物工程所構(gòu)建的3D骨骼肌模型已應(yīng)用于藥物篩選和疾病模型構(gòu)建[41-42]，并模擬組織或器官的正常生理機能在特定的環(huán)境中評估健康和患病狀態(tài)[43]以改善患者的長期預(yù)后。此外還用于評估新研發(fā)的化妝品成分?jǐn)U增肽的功效以驗證打印測試平臺，三維仿生骨骼肌的構(gòu)建為肌肉疾病治療[44]、藥品研發(fā)和化妝品成分檢測等領(lǐng)域提供了創(chuàng)新策略。在長期給藥過程中，藥物注射進肌肉組織并在一定時間內(nèi)緩慢釋放作用于靶組織，而現(xiàn)有的為口服用藥研發(fā)的系統(tǒng)由于缺少復(fù)雜的肌肉組織生理環(huán)境，其結(jié)果往往不能充分反應(yīng)肌肉注射（IM）給藥在體內(nèi)的緩釋及代謝過程。GHOLOBOVA等[45]研發(fā)可預(yù)測肌內(nèi)注射（IM）藥代動力學(xué)及毒性的體外三維骨骼肌模型，人類生物人工肌肉（the human bio-artificial muscle，BAM）是由排列的肌纖維組成的肌肉束，可在電刺激或機械刺激下收縮活動，BAM測試并顯示了熒光化合物5（6）-羧基-2'，7'-二氯熒光素二乙酸酯（CDFDA）和pro-NanoLuc底物在體內(nèi)的水解和還原反應(yīng)，提高了對IM用藥體內(nèi)代謝的可預(yù)測性，降低了藥物研發(fā)成本。然而BAM器官模型僅限于肌肉組織，并無其他器官如肝臟或免疫系統(tǒng)的參與以及血管神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)系統(tǒng)，仍具有一定局限性。對于血管及神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)系統(tǒng)的缺失，可以利用人源誘導(dǎo)多能干細(xì)胞（ihPSCs）衍生的ECs，PC和肌原細(xì)胞共培養(yǎng)，構(gòu)建含有等基因hiPSC衍生的血管內(nèi)皮細(xì)胞和運動神經(jīng)元的多向人工肌肉[46]。

杜氏肌營養(yǎng)不良癥（duchenne muscular dystrophy，DMD）是一種遺傳性肌肉疾病，目前對此疾病研究常用的動物模型是擁有與DMD相同遺傳模型的23號外顯子的無效突變導(dǎo)致肌營養(yǎng)蛋白完全缺失的mdx小鼠系，但仍存在表型差異性且研究成本昂貴等缺點。EBRAHIMI等[47]使用健康來源及DMD患者來源肌細(xì)胞構(gòu)建人類骨骼肌微組織（human skeletal muscle microtissues，hMMTs）可用于研究外顯子跳躍及肌細(xì)胞保護收縮損傷機制等，首次在體外環(huán)境中從頭形成了抗肌萎縮蛋白陽性肌管并概括了DMD部分的病理生理學(xué)特征和功能表型，但可能由于肌管成熟度不足或?qū)嶒灧椒ǖ木窒扌缘仍驔]有再現(xiàn)DMD的肌膜缺損。動物模型的“B計劃”研究導(dǎo)致器官芯片系統(tǒng)（organ-on-a-chip systems，OoC）應(yīng)運而生，得益于其動態(tài)灌注，體積微小，高精度高通量等特性，多已應(yīng)用于構(gòu)建體內(nèi)多器官微生理系統(tǒng)及藥物篩選。AGRAWAL等[41]通過微流體裝置創(chuàng)建了一個可灌注的3D骨骼肌OoC用以評估組織形成和損傷變化，不僅可構(gòu)建健康人源細(xì)胞的仿生生理環(huán)境，更可以通過特定患者的病源細(xì)胞，如DMD干細(xì)胞，來開展個性化藥物研發(fā)及療效評估。

5 前景與展望

VML產(chǎn)生的負(fù)性微環(huán)境可抑制成纖維細(xì)胞的正常凋亡，并伴有慢性炎癥及產(chǎn)生顯著瘢痕組織，嚴(yán)重可導(dǎo)致終生的功能缺陷。目前臨床治療手術(shù)干預(yù)包括瘢痕清創(chuàng)、肌肉移植及假體植入等，盡管自體肌瓣移植可恢復(fù)部分肌肉功能，但常導(dǎo)致供區(qū)病變等因而無法產(chǎn)生完整的血管及神經(jīng)連接使組織完全再生及功能恢復(fù)[7]。當(dāng)前構(gòu)建功能性仿生骨骼肌組織的一個重要的挑戰(zhàn)是血管化和神經(jīng)支配的形成，肌組織需要血管網(wǎng)絡(luò)進行營養(yǎng)物質(zhì)交換，而神經(jīng)元-骨骼肌相互作用的關(guān)鍵是NMJ的形成。對于骨骼肌血管與神經(jīng)的整合，目前研究分別報道了利用神經(jīng)細(xì)胞（PC）和內(nèi)皮細(xì)胞（EC）誘導(dǎo)血管網(wǎng)絡(luò)[48]及神經(jīng)連接[15]的形成，目前鮮有文獻(xiàn)報道生物打印技術(shù)用于血管化或神經(jīng)化骨骼肌構(gòu)建，二者與宿主的整合仍需進行大量的體內(nèi)研究與評估；此外，大量研究顯示導(dǎo)電生物材料可促進電刺激誘導(dǎo)細(xì)胞的增殖與分化[33，49]，對血管形成也有積極影響，然而電刺激尚未應(yīng)用在體外改善肌體的血管化。宿主的免疫反應(yīng)是仿生骨骼肌組織應(yīng)用于臨床的主要挑戰(zhàn)之一，使用免疫原性低的材料，如纖維蛋白、特異性來源的生長因子等[50]，可減少仿生組織植入后產(chǎn)生的不良反應(yīng)。此外，開發(fā)高免疫相容性生物材料并在免疫相容模型中報道應(yīng)用數(shù)據(jù)也將是未來主要研究熱點之一。對于未來研究還應(yīng)研究組織再生狀態(tài)與功能改善之間的相關(guān)性，研究肌管發(fā)育的相關(guān)物理和生化機制。在臨床應(yīng)用方面，VML治療后血管和神經(jīng)再生的潛在協(xié)同效應(yīng)進一步研究以改善臨床治療，最終實現(xiàn)骨骼肌組織的完全修復(fù)再生及功能恢復(fù)。