張義偉，蘇紫薇，李其龍，陳 冉，姜 寧

(重要家畜疫病研究教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 沈陽(yáng)農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)與醫(yī)學(xué)學(xué)院，沈陽(yáng) 110866)

瘧疾是由瘧原蟲引起的世界上危害最嚴(yán)重的疾病之一。據(jù)WHO報(bào)告統(tǒng)計(jì)，自青蒿素的普及以來(lái)，全球瘧疾控制取得了前所未有的成功，但每年仍有超過(guò)40萬(wàn)人死于瘧疾。一方面和最近幾年出現(xiàn)的抗青蒿素蟲株有關(guān)[1-3]；另一方面，和瘧原蟲復(fù)雜且精密的免疫逃避方式有關(guān)。這表明，尋找有效的藥物靶標(biāo)及開(kāi)發(fā)瘧疾疫苗迫在眉睫。已有研究表明，針對(duì)抗瘧原蟲免疫反應(yīng)方面設(shè)計(jì)的藥物，可以有效地控制瘧原蟲在所有發(fā)育階段的感染[4]。因此，研究瘧原蟲感染引起宿主的免疫反應(yīng)過(guò)程尤為重要。

瘧原蟲在宿主體內(nèi)寄生可引起強(qiáng)烈的免疫應(yīng)答反應(yīng)，免疫機(jī)制復(fù)雜多樣。T細(xì)胞是清除機(jī)體瘧原蟲的重要組成部分[5-6]，可通過(guò)直接產(chǎn)生如IFN-γ和TNF-α等促炎細(xì)胞因子，引發(fā)巨噬細(xì)胞和其他組分的抗寄生蟲免疫應(yīng)答[7]，或激活產(chǎn)生抗瘧原蟲抗體的特異性B細(xì)胞從而介導(dǎo)間接的抗寄生蟲免疫反應(yīng)[8]。NK細(xì)胞可通過(guò)細(xì)胞毒性和產(chǎn)生促炎細(xì)胞因子來(lái)破壞受損、功能失調(diào)或被感染的宿主細(xì)胞，從而控制感染的進(jìn)程[9]。在機(jī)體的免疫清除進(jìn)程中，T細(xì)胞免疫球蛋白黏蛋白3(T-cell immunoglobulin and mucin-domain containing molecule 3, Tim-3)作為一種免疫檢查點(diǎn)分子，對(duì)T細(xì)胞和NK均具有負(fù)性調(diào)節(jié)功能[10-12]，在腫瘤以及一些病原體的免疫逃避進(jìn)程中發(fā)揮著重要作用。

在所有人類瘧原蟲感染中，惡性瘧原蟲引起的疾病是導(dǎo)致死亡的主要因素，感染后常出現(xiàn)腦型瘧的癥狀。而可以感染小鼠的伯氏瘧原蟲ANKA株是一種致命的強(qiáng)毒力蟲株，已有的研究表明，在惡性瘧原蟲感染的患者和伯氏瘧原蟲ANKA株感染的C57BL/6小鼠的體內(nèi)，關(guān)鍵免疫細(xì)胞表面Tim-3表達(dá)均升高[13]，但整個(gè)感染進(jìn)程中Tim-3的表達(dá)變化及相關(guān)細(xì)胞因子的變化還未可知。一項(xiàng)在昆明小鼠體內(nèi)的研究顯示：利用熒光定量PCR檢測(cè)技術(shù)，發(fā)現(xiàn)感染伯氏瘧原蟲ANKA株后，小鼠脾Tim-3、IFN-γ、TNF-α、IL-4、IL-10和TGF-β的轉(zhuǎn)錄水平均升高[14]，但這些僅是在轉(zhuǎn)錄水平上的變化情況，此外，不同品系小鼠感染瘧原蟲引起的病理和免疫反應(yīng)也存在差異[15-16]。伯氏瘧原蟲ANKA株感染C57BL/6小鼠后也常會(huì)引起腦型瘧發(fā)生，故已被廣泛用作研究人類惡性瘧疾疾病的試驗(yàn)?zāi)Ｐ?。因此，本研究以伯氏瘧原蟲ANKA株和C57BL/6小鼠為試驗(yàn)材料，對(duì)瘧原蟲感染引起的宿主免疫應(yīng)答特點(diǎn)進(jìn)行了分析。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與蟲株 SPF級(jí)雌性C57BL/6小鼠(N型)，鼠齡6～8周齡，體重20～22 g，購(gòu)自遼寧本溪長(zhǎng)生生物技術(shù)有限公司。

伯氏瘧原蟲ANKA株由沈陽(yáng)農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)與醫(yī)學(xué)學(xué)院人畜共患病重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室保存。

1.1.2 抗體 Pacific BlueTManti-mouse CD45 Antibody、APC anti-mouse CD3 Antibody、FITC anti-mouse CD8a Antibody、APC/FireTM750 anti-mouse CD4 Antibody、FITC anti-mouse NK1.1 Antibody、PE anti-mouse CD366 (Tim-3) Antibody、Pacific BlueTMRat IgG2b, κ Isotype Ctrl Antibody、APC/FireTM750 Rat IgG2b, κ Isotype Ctrl Antibody、APC Rat IgG2b, κ Isotype Ctrl Antibody、FITC Rat IgG2a, κ Isotype Ctrl Antibody、PE Rat IgG2a, κ Isotype Ctrl Antibody、LEAFTMPurified anti-mouse CD16/32 Antibody、7-AAD Viability Staining Solution和Mouse Th Cytokine Panel (5-plex)細(xì)胞因子檢測(cè)試劑盒購(gòu)自北京達(dá)科為生物技術(shù)有限公司。

1.2 方法

1.2.1 試驗(yàn)設(shè)計(jì) 以感染伯氏瘧原蟲強(qiáng)毒株ANKA株的C57BL/6小鼠為研究對(duì)象，分別于感染后0、4、7、9、11、13、16和19 d采集小鼠脾及外周血免疫細(xì)胞，利用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)小鼠主要免疫細(xì)胞亞群及Tim-3的表達(dá)水平的變化，同時(shí)檢測(cè)血清中細(xì)胞因子水平的變化(圖1)。

圖1 試驗(yàn)分組及試驗(yàn)流程

1.2.2 蟲株的準(zhǔn)備 將伯氏瘧原蟲ANKA株從液氮罐中復(fù)蘇，離心洗滌后將蟲體迅速腹腔注射至C57BL/6小鼠體內(nèi)。大約3 d后采取尾尖血制作血涂片，Giemsa染色檢測(cè)染蟲情況。約5 d后采集尾尖血至預(yù)冷的1×PBS中準(zhǔn)備接種下一批小鼠，這批小鼠為第二代染蟲小鼠。如此反復(fù)傳三代，待蟲株毒力穩(wěn)定后，即可用于后續(xù)感染模型建立試驗(yàn)。

1.2.3 伯氏瘧原蟲ANKA株感染模型的建立 第三代染蟲小鼠體內(nèi)染蟲率到達(dá)2%～3%時(shí)，取小鼠外周全血準(zhǔn)備攻蟲：64只雌性C57BL/6小鼠隨機(jī)分為8組：0 d組、4 d組、7 d組、9 d組、11 d組、13 d組、16 d組和19 d組，每組8只。除8只健康小鼠(即0 d組)外，其余小鼠每只腹腔注射 2×105個(gè)染蟲紅細(xì)胞，在相同的環(huán)境中飼養(yǎng)。

1.2.4 樣本的采集 利用眼球采血的方法采集小鼠外周血，其中一部分放于抗凝管中用于免疫細(xì)胞的流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)，一部分用于血清的分離。小鼠斷頸處死，采取脾并稱重。分離的血清置于-80 ℃冰箱保存，用于檢測(cè)細(xì)胞因子。

1.2.5 脾單細(xì)胞懸液的制備 將脾放置于200目細(xì)胞篩，置于50 mL離心管上，邊加PBS邊用注射器尾部充分研磨；研磨好的細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移至15 mL離心管中，1 500 r·min-1離心7 min，棄上清，根據(jù)沉淀體積加入3～10 mL的紅細(xì)胞裂解液，充分震蕩混勻，冰上孵育3～5 min；1 500 r·min-1離心7 min后棄掉上清，沉淀用10 mL的1×PBS 重懸，重復(fù)2次。顯微鏡下計(jì)算細(xì)胞數(shù)量。

1.2.6 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)不同免疫細(xì)胞亞群 從每只小鼠采取的抗凝血中取出100 μL加入離心管中，之后加入相應(yīng)的抗體組合，充分混勻；4 ℃避光孵育30 min后，加入紅細(xì)胞裂解液裂解紅細(xì)胞，冰上孵育3 min，1 500 r·min-1離心7 min后棄上清；加入1 mL 1×PBS重懸細(xì)胞，離心，棄上清；加入300 μL 1×PBS重懸細(xì)胞，將細(xì)胞懸液通過(guò)200目濾網(wǎng)，準(zhǔn)備上機(jī)檢測(cè)。

將脾細(xì)胞懸液調(diào)整每管細(xì)胞的終濃度為每100 μL含1×106個(gè)細(xì)胞；加入CD16/32抗體，冰上孵育10 min封閉Fc位點(diǎn)；將上述細(xì)胞每管取100 μL加入離心管中；加入相應(yīng)的抗體組合，充分震蕩混勻；4 ℃避光孵育30 min，離心，清洗3遍。最終，加入300 μL 1×PBS重懸細(xì)胞，細(xì)胞懸液通過(guò)200目濾網(wǎng)，上機(jī)檢測(cè)。

1.2.7 血清中細(xì)胞因子(IFN-γ、TNF-α、IL-2、IL-6和IL-10)的檢測(cè) 按照試劑盒說(shuō)明書方法進(jìn)行操作。

1.2.8 統(tǒng)計(jì)與分析 所有分析均使用GraphPad Prism 6進(jìn)行。多組間比較時(shí)，采用雙尾t檢驗(yàn)或方差分析對(duì)結(jié)果進(jìn)行分析。結(jié)果使用Excel進(jìn)行計(jì)算，以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差(Mean±SD)”表示。P值小于0.05被認(rèn)為具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 感染伯氏瘧原蟲不同時(shí)期小鼠脾指數(shù)變化

如圖2所示，感染伯氏瘧原蟲后小鼠的脾指數(shù)(脾指數(shù)=脾重量(mg)/體重(g)×10)在0～13 d逐漸升高(P<0.001)；16～19 d小鼠脾指數(shù)不再繼續(xù)升高，感染19 d小鼠與16 d小鼠相比，脾指數(shù)降低(P<0.05)，但仍顯著高于健康對(duì)照組(0 d組)(P<0.001)。

&. P<0.05, ***. P<0.001, *代表與0 d組進(jìn)行比較；& 代表19 d組與16 d組進(jìn)行比較

2.2 感染伯氏瘧原蟲不同時(shí)期小鼠脾中T細(xì)胞及T細(xì)胞表面Tim-3的表達(dá)情況

利用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)伯氏瘧原蟲ANKA株感染小鼠后脾T細(xì)胞主要亞群比例及Tim-3的表達(dá)情況的變化，圖3A為細(xì)胞圈門方案。與未感染組(0 d組)相比，感染4 d，小鼠脾CD3+CD4+T細(xì)胞比例顯著降低(P<0.001)，且隨感染時(shí)間的延長(zhǎng)，除7 d外，脾CD3+CD4+T細(xì)胞比例均顯著低于0 d未感染組(圖3B)。與未感染組(0 d組)相比，小鼠脾CD3+CD8+T細(xì)胞比例隨感染時(shí)間的延長(zhǎng)逐漸降低(P<0.001,圖3C)。如圖3D和圖3E所示，隨感染時(shí)間延長(zhǎng)，小鼠脾Tim-3+CD3+CD4+T細(xì)胞和Tim-3+CD3+CD8+T細(xì)胞比例逐漸升高(P<0.001)。為了進(jìn)一步確認(rèn)CD3+CD4+T細(xì)胞和CD3+CD8+T細(xì)胞表面Tim-3的表達(dá)情況，利用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)了這兩種細(xì)胞表面Tim-3分子的平均熒光強(qiáng)度(median fluorescence intensity，MFI)。結(jié)果顯示，Tim-3分子在CD3+CD4+T細(xì)胞(圖3F)和CD3+CD8+T細(xì)胞(圖3G)表面的表達(dá)均逐漸增加。

A. 流式細(xì)胞圈門方案； B. CD3+CD4+ T細(xì)胞比例統(tǒng)計(jì)結(jié)果；C. CD3+CD8+ T細(xì)胞比例統(tǒng)計(jì)結(jié)果；D. Tim-3+CD3+CD4+ T細(xì)胞比例統(tǒng)計(jì)結(jié)果；E. Tim-3+CD3+CD8+ T細(xì)胞比例統(tǒng)計(jì)結(jié)果；F. Tim-3在CD3+CD4+ T細(xì)胞的表達(dá)變化；G. Tim-3在CD3+CD8+ T細(xì)胞的表達(dá)變化。*. P<0.05, **. P<0.01, ***. P<0.001, *代表與0 d組進(jìn)行比較。下圖同

2.3 感染伯氏瘧原蟲不同時(shí)期小鼠外周血中T細(xì)胞及T細(xì)胞表面Tim-3的表達(dá)情況

采用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)伯氏瘧原蟲ANKA株感染小鼠的外周血T細(xì)胞主要亞群比例及Tim-3的表達(dá)情況的變化。結(jié)果顯示：與未感染組(0 d組)相比，感染4 d，小鼠外周血CD3+CD4+T細(xì)胞比例顯著升高(P<0.001)，在感染第7和第9天又逐漸降低(P<0.001)，在感染第16和第19天逐漸升高(P<0.01)，整體呈先降低后升高的趨勢(shì)(圖4A)；與未感染組(0 d組)相比，感染4 d小鼠外周血CD3+CD8+T細(xì)胞比例顯著降低(P<0.001)，在感染的第7和第9天又逐漸升高(P<0.001)，在感染的第16和第19天均發(fā)生降低(P<0.05、P<0.001)，整體呈先升高后降低的趨勢(shì)(圖4B)。如圖4C和圖4D所示，隨感染時(shí)間的延長(zhǎng)，小鼠外周血Tim-3+CD3+CD4+T細(xì)胞和Tim-3+CD3+CD8+T細(xì)胞比例均呈先升高后降低的趨勢(shì)(P<0.01)，但感染末期Tim-3+CD3+CD4+T細(xì)胞和Tim-3+CD3+CD8+T細(xì)胞的比例仍顯著高于未感染組(0 d組)。利用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)的外周血中這兩種細(xì)胞表面Tim-3分子的MFI，如圖4E和圖4F所示：Tim-3分子在CD3+CD4+T細(xì)胞和CD3+CD8+T細(xì)胞表面的表達(dá)均呈先升高后降低的趨勢(shì)，但感染末期Tim-3分子的表達(dá)量也均高于未感染組(0 d組)。

A. CD3+CD4+ T細(xì)胞比例統(tǒng)計(jì)結(jié)果；B. CD3+CD8+ T細(xì)胞比例統(tǒng)計(jì)結(jié)果；C. Tim-3+CD3+CD4+ T細(xì)胞比例統(tǒng)計(jì)結(jié)果；D. Tim-3+CD3+CD8+ T細(xì)胞比例統(tǒng)計(jì)結(jié)果；E. Tim-3在CD3+CD4+ T細(xì)胞的表達(dá)變化；F. Tim-3在CD3+CD8+ T細(xì)胞的表達(dá)變化

2.4 感染伯氏瘧原蟲不同時(shí)期小鼠脾中NK細(xì)胞及NK細(xì)胞表面Tim-3的表達(dá)情況

利用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)小鼠脾中NK細(xì)胞及NK細(xì)胞表面Tim-3的變化，圖5A為流式圈門方案。如圖5B所示：與未感染組(0 d組)相比，感染4 d，小鼠脾CD3-NK1.1+細(xì)胞比例顯著降低(P<0.001)，感染第11天比例降到最低(P<0.001)，感染第13～19天逐漸升高，但CD3-NK1.1+細(xì)胞的比例仍顯著低于未感染組(0 d組)。與未感染組(0 d組)相比，感染4 d，小鼠脾Tim-3+CD3-NK1.1+細(xì)胞的比例顯著升高(P<0.01)，感染的第11天比例升到最高(P<0.001)，隨后逐漸降低，但感染后期脾Tim-3+CD3-NK1.1+細(xì)胞仍顯著高于未感染組(圖5C)。在感染瘧原蟲后，小鼠脾CD3-NK1.1+細(xì)胞細(xì)胞表面的Tim-3分子的表達(dá)量均顯著高于未感染組(圖5D)。

A. 流式細(xì)胞圈門方案； B. CD3-NK1.1+ 細(xì)胞比例統(tǒng)計(jì)結(jié)果；C. Tim-3+CD3-NK1.1+ 細(xì)胞比例統(tǒng)計(jì)結(jié)果；D. Tim-3在CD3-NK1.1+ 細(xì)胞的表達(dá)變化。*. P<0.05, **. P<0.01, ###、***. P<0.001, *.代表與0 d組進(jìn)行比較，#.代表19 d組與16 d組進(jìn)行比較

2.5 感染伯氏瘧原蟲不同時(shí)期小鼠外周血中NK細(xì)胞及NK細(xì)胞表面Tim-3的表達(dá)情況

小鼠外周血中CD3-NK1.1+細(xì)胞的比例在感染后第4天發(fā)生顯著升高(P<0.05)，隨后降低，直至感染末期，且在感染的第9～19天，CD3-NK1.1+細(xì)胞的比例均顯著低于未感染組(P<0.001,圖6A)。外周血Tim-3+CD3-NK1.1+細(xì)胞的比例在感染后顯著升高(P<0.001，圖6B)。流式細(xì)胞術(shù)MFI結(jié)果顯示：外周血中，CD3-NK1.1+細(xì)胞表面Tim-3分子的表達(dá)量呈不規(guī)則升高趨勢(shì)，感染末期升至最高(圖6C)。

A. CD3-NK1.1+ 細(xì)胞比例統(tǒng)計(jì)結(jié)果；B. Tim-3+CD3-NK1.1+ 細(xì)胞比例統(tǒng)計(jì)結(jié)果；C. Tim-3在CD3-NK1.1+細(xì)胞的表達(dá)變化。*. P<0.05, **. P<0.01, ***. P<0.001, *.代表與0 d組進(jìn)行比較

2.6 血清中細(xì)胞因子IFN-γ、TNF-α、IL-2、IL-6和IL-10的檢測(cè)結(jié)果

利用細(xì)胞因子微球檢測(cè)技術(shù)檢測(cè)了小鼠血清中IFN-γ、TNF-α、IL-2、IL-6和IL-10的分泌情況。如圖7A和圖7F，感染瘧原蟲后的第4天，血清中IFN-γ的分泌急劇增多，且差異極顯著(P<0.001)，之后逐漸降低，直至感染的第13～19天, IFN-γ的分泌量與未感染組幾乎相同(P>0.05)；圖7B和圖7F為血清中IL-2的分泌情況，結(jié)果顯示感染瘧原蟲后的第4～19天，血清中IL-2的分泌量均顯著高于未感染組(P<0.05)；如圖7C、圖7D和圖7F所示，感染瘧原蟲后，小鼠血清中IL-6和TNF-α的分泌均出現(xiàn)了先升高后降低的趨勢(shì)(P<0.05)。血清中IL-10的含量在小鼠感染瘧原蟲后逐漸升高，且在感染末期達(dá)到最高(P<0.001,圖7E、圖7F)。

A～E. 血清中細(xì)胞因子IFN-γ、IL-2、IL-6、TNF-α和IL-10的檢測(cè)結(jié)果統(tǒng)計(jì)；F. 對(duì)血清中IFN-γ、IL-2、IL-6、TNF-α和IL-10檢測(cè)數(shù)據(jù)進(jìn)行的熱圖分析結(jié)果。*. P<0.05, **. P< 0.01, ***. P<0.001, *.代表與0 d組進(jìn)行比較

3 討 論

脾是機(jī)體重要的免疫器官，在機(jī)體的造血和免疫監(jiān)視功能中都起著非常重要的作用，脾腫大可能是嚴(yán)重疾病的第一個(gè)征兆[17]。本研究發(fā)現(xiàn)，在感染瘧原蟲第4天小鼠脾腫大非常明顯，且隨感染時(shí)間的延長(zhǎng)，小鼠脾持續(xù)增大。脾的功能之一是清除異常紅細(xì)胞，因此，這可能意味著在感染瘧原蟲的小鼠脾中存在更多的受感染紅細(xì)胞。此外，本研究發(fā)現(xiàn)感染瘧原蟲小鼠脾非淋巴細(xì)胞亞群的細(xì)胞比例顯著增多，而已有研究表明，脾腫大與非淋巴細(xì)胞(例如中性粒細(xì)胞)的脾浸潤(rùn)有關(guān)[17]，這也可能是導(dǎo)致本研究中小鼠脾增大的原因之一。

T細(xì)胞是清除紅內(nèi)期瘧原蟲的重要組成部分[5]，可產(chǎn)生如IFN-γ和TNF-α等促炎細(xì)胞因子，從而引發(fā)巨噬細(xì)胞和其他組分的抗寄生蟲免疫應(yīng)答[7]。本研究顯示,外周血T細(xì)胞，尤其是CD3+CD8+T細(xì)胞在感染前期顯著升高，而血清中的IFN-γ的分泌量也在此時(shí)達(dá)到最高。除T細(xì)胞外，IFN-γ也可由NK細(xì)胞產(chǎn)生，是NK細(xì)胞清除瘧原蟲所必需的細(xì)胞因子[18]，NK細(xì)胞通過(guò)細(xì)胞毒性和產(chǎn)生促炎細(xì)胞因子來(lái)破壞受損、功能失調(diào)或被感染的宿主細(xì)胞，從而控制瘧原蟲感染的進(jìn)程[9]。本研究發(fā)現(xiàn)，感染早期外周血NK細(xì)胞的比例也達(dá)到了最高。具有抗蟲活性的TNF-α也可通過(guò)活化的巨噬細(xì)胞分泌[19-20]。IL-2也是一種促炎細(xì)胞因子，因其具有促進(jìn)T細(xì)胞體外增殖和分化的能力而被命名為T細(xì)胞生長(zhǎng)因子(T cell growth factor，TCGF)。IL-2主要由活化的T細(xì)胞產(chǎn)生，尤其是活化的CD4+T細(xì)胞[21]。IL-6主要由單核巨噬細(xì)胞、Th2 細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞、成纖維細(xì)胞等產(chǎn)生，可與 IL-1 一起協(xié)同促進(jìn) T 細(xì)胞增殖，它還可促使 B 細(xì)胞分化。瘧原蟲紅內(nèi)期感染期間，IL-6可以促進(jìn)CD4+T細(xì)胞活化和B細(xì)胞應(yīng)答反應(yīng)及分化，刺激早期瘧原蟲特異性IgM的產(chǎn)生，是瘧原蟲感染期間免疫應(yīng)答的重要組成部分[22]。在本研究中，血清IFN-γ、IL-2、IL-6和TNF-α的分泌在感染瘧原蟲后顯著升高，在感染后4、7或9 d達(dá)到最高水平，表明機(jī)體此時(shí)在進(jìn)行積極的抗蟲免疫反應(yīng)。

然而，瘧原蟲感染會(huì)引起T細(xì)胞的耗竭[23]。已有研究表明，在瘧原蟲感染中，表達(dá)Tim-3的T細(xì)胞亞群比例升高，而阻斷Tim-3可增強(qiáng)宿主介導(dǎo)的細(xì)胞免疫應(yīng)答反應(yīng)[13]。Tim-3作為一種免疫抑制分子，在包括T細(xì)胞、NK細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和單核細(xì)胞等多種免疫細(xì)胞上均有表達(dá)。在對(duì)荷瘤小鼠的研究中發(fā)現(xiàn)，抗Tim-3抗體可減弱小鼠對(duì)抗PD-1治療產(chǎn)生耐藥性[24]。也有研究表明，給感染日本血吸蟲的小鼠注射Tim-3-Fc融合蛋白，表達(dá)IFN-γ的CD4+T細(xì)胞的比例會(huì)增加，表明Tim-3抑制了機(jī)體的Th1型免疫反應(yīng)[11]。本研究發(fā)現(xiàn)，在感染瘧原蟲后小鼠脾和外周血T細(xì)胞和NK細(xì)胞表達(dá)的Tim-3的水平均出現(xiàn)升高趨勢(shì)，雖然Tim-3分子在外周血CD3+CD4+T細(xì)胞和CD3+CD8+T細(xì)胞表面的表達(dá)均呈現(xiàn)了先升高后降低的趨勢(shì)，但感染末期Tim-3分子的表達(dá)量仍高于未感染小鼠。有研究表明，Tim-3在抑制細(xì)胞因子(如TNF和 INF-γ)的表達(dá)方面也發(fā)揮著關(guān)鍵作用[25]。在多發(fā)性硬化和結(jié)腸直腸癌的小鼠模型中，Tim-3和IL-10的升高伴隨著IFN-γ和TNF-α表達(dá)的減少[26]。此外，由Th2細(xì)胞產(chǎn)生的IL-10也可抑制IL-2、IL-12和IFN-γ的分泌，并降低樹(shù)突狀細(xì)胞的抗原提呈和MHC Ⅱ 類分子表達(dá)[27]。也有研究發(fā)現(xiàn)，在約氏瘧原蟲感染的小鼠中，IL-10和TGF-β的產(chǎn)生與高寄生蟲血癥和嚴(yán)重貧血有關(guān)[28]。在本研究中，Tim-3分子的持續(xù)升高表達(dá)以及血清中IL-10的急劇持續(xù)升高可能是引起IFN-γ、TNF-α和IL-6在感染中期和后期逐漸降低的原因之一。表明感染后期，機(jī)體的免疫抑制過(guò)程加劇，這也可能是機(jī)體免疫反應(yīng)最終未能成功殺滅瘧原蟲的原因之一。

4 結(jié) 論

綜上，本研究結(jié)果表明，感染瘧原蟲后，小鼠的T細(xì)胞與NK細(xì)胞介導(dǎo)的免疫應(yīng)答反應(yīng)發(fā)揮了一定的殺傷作用，在感染前期有一些促炎細(xì)胞因子如IFN-γ、TNF-α、IL-2和IL-6參與了抗瘧原蟲免疫，但由于Tim-3免疫檢查點(diǎn)分子及一些發(fā)揮免疫抑制作用的細(xì)胞因子(IL-10)的過(guò)度表達(dá)，推測(cè)這可能導(dǎo)致小鼠在感染后期處于過(guò)度的免疫抑制狀態(tài)，從而有利于瘧原蟲逃避宿主的免疫捕殺作用。這提示從宿主免疫抑制角度出發(fā)，針對(duì)抗瘧原蟲免疫反應(yīng)方面設(shè)計(jì)藥物具有重要意義。