馬曉玲，彭 巍，舒 適

(青海大學(xué)，西寧 810016)

牦牛是主要生活在高海拔地區(qū)的一類珍稀物種，被譽(yù)為“高原之舟”[1]。作為青藏高原的唯一大型哺乳動(dòng)物，牦牛不僅為當(dāng)?shù)鼐用裉峁┤夂湍?，還被用作貿(mào)易運(yùn)輸?shù)墓ぞ?。牦牛的皮、毛、絨及角也都具有一定的經(jīng)濟(jì)價(jià)值，為高原牧民提供了生活必需品與經(jīng)濟(jì)支撐[2]。然而，牦牛的繁殖率普遍偏低，成年母牦牛的繁殖率多為兩年一胎，甚至三年一胎[3]。這種較低的繁殖率除了由于牦牛自身的性成熟較晚、生殖發(fā)育緩慢、生長(zhǎng)周期較長(zhǎng)以外，營(yíng)養(yǎng)水平、環(huán)境因素、科學(xué)的管理模式、發(fā)情配種和疾病都會(huì)直接或間接影響繁殖率[3-4]。近年來(lái)，雖然國(guó)內(nèi)外的研究者已經(jīng)對(duì)牦牛繁殖方面進(jìn)行了深入的研究，但是對(duì)于圍產(chǎn)期的研究鮮有報(bào)道。圍產(chǎn)期是經(jīng)產(chǎn)母畜極為重要的時(shí)期，一般界定為妊娠第31周到產(chǎn)后4周，即產(chǎn)前28天至產(chǎn)后28天[5]。在圍產(chǎn)期，經(jīng)產(chǎn)母畜機(jī)體的任何異常變化，都會(huì)直接或間接地影響其健康狀況與繁殖性能[6]?；谇捌诘难芯靠芍?，經(jīng)產(chǎn)牦牛在圍產(chǎn)后期發(fā)生了能量負(fù)平衡，其酮體含量升高，并且對(duì)生殖激素的分泌存在一定的影響[7]。另外也有研究者發(fā)現(xiàn)，在圍產(chǎn)期對(duì)牦牛進(jìn)行不同程度的補(bǔ)飼，可提高牦牛的繁殖率和犢牛的生長(zhǎng)性能[8-9]。但是繁殖率的提高是參差不齊的，而且補(bǔ)飼提高繁殖性能的具體機(jī)制是不清楚的。這是由于缺乏牦牛圍產(chǎn)期機(jī)體代謝的基礎(chǔ)資料。

代謝組學(xué)作為系統(tǒng)生物學(xué)的重要組成部分，能夠?qū)Ρ确治霾煌±?、生理狀態(tài)下的代謝圖譜，從而揭示疾病機(jī)制。液相色譜-質(zhì)譜(liquid chromatography mass spectrometry，LCMS)技術(shù)作為代謝組學(xué)主要技術(shù)平臺(tái)之一，不僅分離度與靈敏度高、樣品預(yù)處理簡(jiǎn)單[10-11]，還能夠?qū)颖具M(jìn)行靈敏和全面的評(píng)估[12]。Liu等[13]應(yīng)用LCMS技術(shù)對(duì)牦牛瘤胃菌群和代謝產(chǎn)物之間的關(guān)系進(jìn)行了研究，不僅得到了不同飼料對(duì)應(yīng)的瘤胃菌群類型，還通過(guò)分析揭示了飼料類型是如何改變瘤胃代謝的產(chǎn)物和模式的。Yang等[14]也利用LCMS技術(shù)對(duì)比了包括牦牛在內(nèi)的幾種產(chǎn)奶動(dòng)物的乳汁差異代謝組學(xué)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)了各種動(dòng)物乳汁中的特有代謝物，以及這些乳汁中獨(dú)特的代謝機(jī)制。LCMS實(shí)際上廣泛的應(yīng)用于人類、動(dòng)物和植物，不僅能夠獲得有價(jià)值的標(biāo)志物，還能夠推測(cè)構(gòu)建網(wǎng)絡(luò)代謝機(jī)制。

本研究應(yīng)用LCMS技術(shù)篩選經(jīng)產(chǎn)母牦牛圍產(chǎn)后期各時(shí)期的代謝物表達(dá)譜，結(jié)合生物信息學(xué)分析，旨在闡明經(jīng)產(chǎn)母牦牛圍產(chǎn)后期動(dòng)態(tài)的代謝情況，并通過(guò)代謝物的功能挖掘，構(gòu)建其代謝網(wǎng)絡(luò)以及其對(duì)生殖激素影響的機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)動(dòng)物的選擇和分組

試驗(yàn)自4月起在青海省海北藏族自治州海晏縣隨機(jī)選取經(jīng)產(chǎn)牦牛8頭，所選牦牛年齡、胎次和體況均相近，飼養(yǎng)管理方式為自由放牧，且無(wú)任何補(bǔ)飼措施。自牦牛分娩之日起，每隔7 d采集1次血液，并根據(jù)時(shí)間點(diǎn)進(jìn)行分組，分別為分娩日(A組)、產(chǎn)后7天(B組)、產(chǎn)后14天(C組)、產(chǎn)后21天(D組)和產(chǎn)后28天(E組)。試驗(yàn)?zāi)戈笈；拘畔⒁?jiàn)表1。

表1 試驗(yàn)?zāi)戈笈；拘畔?/p>

1.2 血液樣本采集

采用頸靜脈采血的方法，采集全血，不加任何抗凝劑。室溫靜置3 h后，收集血清。3 000 r·min-1離心5 min，提取上清液，-80 ℃保存。

1.3 樣品前處理

取100 μL或100 mg樣品，液氮研磨，加入3倍體積的 lysis buffer(80%甲醇)，渦旋混勻，組織破碎儀45 Hz 研磨處理4 min，超聲5 min(冰水浴)。于-20 ℃靜置30 min，14 000g離心 30 min，取上清，用0.45 μm的濾膜過(guò)濾，待上機(jī)。取上清20 μL于進(jìn)樣瓶中上機(jī)檢測(cè)。所有樣品另取等量上清混合成質(zhì)控(quality control，QC)樣品上機(jī)檢測(cè)。

1.4 質(zhì)譜鑒定

樣品按儀器要求上高效液相色譜儀(Thermo，系統(tǒng)： Thermo ScientificTMDionexTMltiMateTM3000 Rapid Separation LC (RSLC))檢測(cè)，其中質(zhì)譜系統(tǒng)為T(mén)hermo，型號(hào)：Q Exactive。Loading Pump流速0.25 mL·min-1，20 min。流動(dòng)相參數(shù)設(shè)置見(jiàn)表2，離子源參數(shù)為噴霧電壓2 500 V，毛細(xì)管溫度320 ℃，離子源為HESI；質(zhì)譜采用70000 FWHM方法，全掃描目標(biāo)為3e6，全掃描最大值100 ms，掃描范圍為100～1 500 m·z-1；二級(jí)質(zhì)譜采用17500 FWHM方法，目標(biāo)和最大值分別為1e5和50 ms。

表2 流動(dòng)相參數(shù)設(shè)置

1.5 質(zhì)譜數(shù)據(jù)處理

原始數(shù)據(jù)經(jīng)過(guò)歸一化及降噪處理后，進(jìn)行數(shù)據(jù)庫(kù)檢索。數(shù)據(jù)庫(kù)包括METLIN數(shù)據(jù)庫(kù)(https://metlin.scripps.edu)、Human Metabolome Database數(shù)據(jù)庫(kù)(https://metlin.scripps.edu)和ChemSpider數(shù)據(jù)庫(kù)(www.chemspider.com)。將質(zhì)譜檢測(cè)得到的原始文件(.uep)導(dǎo)入 Progenesis QI 2.3 (PQI)軟件中，對(duì)不同樣品根據(jù)保留時(shí)間偏差 0.2 min 和質(zhì)量偏差 5 ppm 進(jìn)行數(shù)據(jù)對(duì)齊，CV(coefficient of variance)值30%、信噪比3、最小信號(hào)強(qiáng)度100 000、加和離子等信息進(jìn)行峰提取反褶積，峰值提取。對(duì)峰面積進(jìn)行定量，再整合目標(biāo)離子，然后通過(guò)分子離子峰和碎片離子進(jìn)行分子式的預(yù)測(cè)并與數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比對(duì)，對(duì)定量結(jié)果進(jìn)行歸一化和標(biāo)記矩陣的生產(chǎn)和識(shí)別，最后得到數(shù)據(jù)的鑒定和定量結(jié)果。

1.6 差異代謝物的篩選

為了更好的顯示經(jīng)產(chǎn)母牦牛圍產(chǎn)期代謝的動(dòng)態(tài)變化，試驗(yàn)篩選每2個(gè)時(shí)間點(diǎn)之間的差異代謝物，旨在構(gòu)建經(jīng)產(chǎn)母牦牛在圍產(chǎn)后期的代謝情況。試驗(yàn)采用多元統(tǒng)計(jì)分析的方法，在最大程度保留原始信息的基礎(chǔ)上對(duì)采集的多維數(shù)據(jù)進(jìn)行降維和回歸分析，然后進(jìn)行差異代謝物的篩選及后續(xù)分析。主要包括主成分分析(PCA)、偏最小二乘判別分析(PLS_DA)和正交偏最小二乘判別分析(OPLS-DA)。通過(guò)計(jì)算第一主成分的變量投影重要度(variable importance in projection，VIP)值以及差異性(P值)和差異倍數(shù)進(jìn)行差異代謝物的篩選。

1.7 差異代謝物的生物信息學(xué)分析

試驗(yàn)對(duì)篩選的差異代謝物進(jìn)行KEGG(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes)功能注釋、HMDB(Human Metabolome Database)注釋和LIPID注釋分析。KEGG功能注釋主要通過(guò)信號(hào)通路挖掘代謝物參與的主要生化代謝路徑和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，數(shù)據(jù)庫(kù)網(wǎng)址https://www.genome.jp/kegg/；HMDB注釋是與人類相關(guān)的小分子代謝物的詳細(xì)信息，雖然人類與牦牛物種之間有所差異，但是HMDB的注釋可以在一定程度上幫助理解代謝物的主要功能，數(shù)據(jù)庫(kù)網(wǎng)址https://hmdb.ca/；LIPID注釋主要用于挖掘脂質(zhì)類的差異代謝物的結(jié)構(gòu)和功能；應(yīng)用的數(shù)據(jù)庫(kù)為L(zhǎng)IPID MAPS Structure Database(LMSD)，網(wǎng)址http://www.lipidmaps.org/data/structure/。3個(gè)數(shù)據(jù)庫(kù)的結(jié)合可以更好的構(gòu)建經(jīng)產(chǎn)母牦牛圍產(chǎn)后期的動(dòng)態(tài)代謝變化。

2 結(jié) 果

2.1 LCMS質(zhì)譜鑒定結(jié)果

試驗(yàn)對(duì)正、負(fù)離子模式下的QC樣本進(jìn)行了相關(guān)性分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，負(fù)離子模式下QC樣本之間均無(wú)顯著性差異，且相關(guān)性顯著(圖1)，正離子模式下QC樣本之間雖無(wú)完全相關(guān)，但相關(guān)性均高于0.99。LCMS聯(lián)用在正離子模式下檢測(cè)到5 801個(gè)代謝物信號(hào)，其中2 841種代謝物得到定性分析結(jié)果。負(fù)離子模式下檢測(cè)到2 813個(gè)代謝物信號(hào)，其中1 326種代謝物得到定性分析結(jié)果。定性鑒定代謝物的聚類分析和PCA分析結(jié)果見(jiàn)圖2。

A.正離子模式下QC樣品之間的相關(guān)性；B.負(fù)離子模式下QC樣品之間的相關(guān)性

A, C.分別為正離子模式下代謝物的聚類分析和PCA分析；B, D. 為負(fù)離子模式下代謝物的聚類分析和PCA分析

2.2 差異代謝物的篩選

試驗(yàn)對(duì)差異代謝物的篩選標(biāo)準(zhǔn)為：1)根據(jù)原始數(shù)據(jù)進(jìn)行每?jī)蓚€(gè)時(shí)間點(diǎn)的T-test統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)算P值，P<0.05為統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的差異；2)差異倍數(shù)(Fold change，F(xiàn)C)，根據(jù)原始數(shù)據(jù)進(jìn)行每?jī)蓚€(gè)時(shí)間點(diǎn)的相對(duì)定量均值的比值來(lái)計(jì)算FC，設(shè)定FC>2.0或FC<0.5為本試驗(yàn)的FC閾值；3)VIP值的計(jì)算，根據(jù)對(duì)原始數(shù)據(jù)進(jìn)行多元統(tǒng)計(jì)分析計(jì)算VIP值，設(shè)置閾值為VIP>1.0。

根據(jù)設(shè)置的閾值進(jìn)行差異代謝物的篩選，在正離子模式下篩選出差異代謝物共65個(gè)，其中4個(gè)重復(fù)結(jié)果，故為61種差異代謝物；負(fù)離子模式下篩選的差異代謝物共57個(gè)，其中1個(gè)重復(fù)結(jié)果，故為56種差異代謝物。整合結(jié)果共篩選出122個(gè)差異代謝物，除去重復(fù)的結(jié)果，共獲得117種差異代謝物。圖3是以E組和C組為例的對(duì)比分析結(jié)果。

A. E組和C組的聚類分析；B. E組和C組差異代謝物的篩選

2.3 生物信息學(xué)分析

2.3.1 KEGG數(shù)據(jù)庫(kù)功能分析 試驗(yàn)對(duì)117種差異代謝物進(jìn)行KEGG數(shù)據(jù)庫(kù)檢索，結(jié)果得到21個(gè)信號(hào)通路，歸屬于6個(gè)分類，包括細(xì)胞過(guò)程(cellular process)、藥物開(kāi)發(fā)(drug development)、環(huán)境信息處理(environmental information processing)、人類疾病(human diseases)、新陳代謝(metabo-lism)和生物系統(tǒng)(organismal systems)(圖4)。

圖4 差異代謝物的KEGG功能注釋

2.3.2 HMDB數(shù)據(jù)庫(kù)分析 試驗(yàn)對(duì)117種差異代謝物進(jìn)行HMDB數(shù)據(jù)庫(kù)檢索，結(jié)果得到11個(gè)結(jié)果，包括脂質(zhì)和類脂分子(lipids and lipid-like molecules)、有機(jī)雜環(huán)化合物(organoheterocyclic compounds)、有機(jī)酸及其衍生物(organic acids and derivatives)、苯環(huán)型化合物(benzenoids)、有機(jī)氧化合物(organic oxygen compounds)、苯丙烷和聚酮(phenylpropanoids and polyketides)、有機(jī)氧化合物(organooxygen compounds)、生物堿及其衍生物(alkaloids and derivatives)、核苷、核苷酸和類似物(nucleosides, nucleotides, and analogues)、有機(jī)氮化合物(organic nitrogen compounds)和木脂素、新木脂素及相關(guān)化合物(lignans, neolignans and related compounds)(圖5)。

圖5 差異代謝物的HMDB功能注釋

2.3.3 LMSD脂類注釋分析 試驗(yàn)對(duì)117種差異代謝物進(jìn)行LMSD數(shù)據(jù)庫(kù)檢索，結(jié)果得到13個(gè)結(jié)果，包括類固醇(steroids)、分泌腺(secosteroids)、神經(jīng)酰胺(ceramides)、黃酮類化合物(flavonoids)、芳香聚酮(aromatic polyketides)、甘油磷酸膽堿(glycerophosphocholines)、甘油磷酸乙醇胺(glycerophosphoethanolamines)、脂肪酸和共軛物(fatty acids and conjugates)、脂肪酯(fatty esters)、脂肪酰胺(fatty amides)、二十烷酸(eicosanoids)、脂肪醇(fatty alcohols)和含氧碳?xì)浠衔?oxygenated hydrocarbons)(圖6)。

圖6 差異代謝物的LMSD功能注釋

2.4 關(guān)鍵差異代謝物的篩選和網(wǎng)絡(luò)機(jī)制的構(gòu)建

根據(jù)對(duì)差異代謝物的篩選和生物信息學(xué)分析結(jié)果，篩選出與繁殖、脂類代謝和氨基酸代謝相關(guān)的關(guān)鍵差異代謝物30個(gè)，通過(guò)歸類篩選出18種關(guān)鍵代謝物(表3)。其中，隨時(shí)間推移表達(dá)上調(diào)的有9種，表達(dá)下調(diào)的有6種，表達(dá)不規(guī)則的有3種。

表3 篩選的關(guān)鍵差異代謝物

與繁殖性能相關(guān)的有3種，包括隨時(shí)間推移表達(dá)上調(diào)的β-皮質(zhì)醇(beta-cortol，Cor)和四氫皮質(zhì)醇(tetrahydrocortisol，TH-Cor)，表達(dá)下調(diào)的真菌毒素T2(mycotoxin T2，MT2)；與脂類代謝相關(guān)的有7種，包括隨時(shí)間推移表達(dá)上調(diào)的磷脂酰絲氨酸(phosphatidylserine，PS)和甘油三酯(triglyceride，TG)，表達(dá)下調(diào)的丙酸(propanoic acid，Pac)、13S羥基十八碳二烯酸(13S-hydroxyoctadecadienoic acid，13-HODE)和9S羥基十八碳二烯酸(9S-hydroxyoctadecadienoic acid，9-HODE)，表達(dá)不規(guī)則的磷脂酰膽堿(phosphatidylcholine，PC)和磷脂酰乙醇胺(phosphatidylethanolamine，PE)；與氨基酸代謝相關(guān)的有8種，包括隨時(shí)間推移表達(dá)上調(diào)的精氨酰苯丙氨酸(arginyl-Phenylalanine，Arg-Phe)、D-谷氨酸(D-glutamic acid，D-Glu)、γ-谷氨酰半胱氨酸(gamma-glutamylcysteine，Gln-Cys)、甘氨酸(glycylleucine，Gly)和吲哚丙酮酸(indolepyruvate，Ipa)，表達(dá)下調(diào)的5-甲氧基色氨酸(5-methoxytryptophol，Trp)和酪氨酸苯丙氨酸(tyrosyl-phenylalanine，Tyr-Phe)，表達(dá)不規(guī)則的色氨酸谷氨酰胺(tryptophyl-glutamine，Trp-Gln)。

(轉(zhuǎn)下頁(yè) Carried forward)

根據(jù)篩選的關(guān)鍵代謝物及其生物信息學(xué)的功能挖掘，試驗(yàn)構(gòu)建了經(jīng)產(chǎn)母牦牛圍產(chǎn)期代謝情況，以及對(duì)生殖激素的影響(圖7)。根據(jù)代謝物隨時(shí)間變化的趨勢(shì)，模擬在圍產(chǎn)后期相應(yīng)代謝過(guò)程的動(dòng)態(tài)變化(圖8)。

圖中藍(lán)色字體代謝物表示隨著時(shí)間的推移表達(dá)下調(diào)，紅色字體代謝物表示表達(dá)上調(diào)，既存在藍(lán)色字體又存在紅色字體的代謝物表示隨著時(shí)間的推移發(fā)生不規(guī)則變化；“×”表示通路受阻；“√”表示通路順暢；“→”表示代謝物的轉(zhuǎn)化和生成；“─┄→”表示通路部分步驟省略；“┤”表示代謝物抑制作用

圖8 圍產(chǎn)后期動(dòng)態(tài)代謝作用

3 討 論

3.1 母牦牛圍產(chǎn)后期的糖代謝

葡萄糖是動(dòng)物機(jī)體主要的能量來(lái)源[15]，葡萄糖的代謝一般分為無(wú)氧條件下的糖酵解過(guò)程和有氧條件下的三羧酸循環(huán)(tricarboxylic acid cycle；TCA)，這兩個(gè)代謝途徑均能分解葡萄糖產(chǎn)生能量，以供給機(jī)體的正常生理需要[16]。葡萄糖在糖酵解的作用下產(chǎn)生丙酮酸，丙酮酸的出路主要有兩個(gè)，其中一個(gè)就是進(jìn)入TCA，進(jìn)一步分解產(chǎn)生能量供給機(jī)體。丙酮酸的另一條出路是糖異生，糖異生是葡萄糖合成的主要機(jī)制。母畜在分娩日由于分娩給機(jī)體帶來(lái)的能量消耗而導(dǎo)致血糖含量的降低，這在奶牛中早已被證實(shí)[17-18]。當(dāng)機(jī)體血糖含量降低時(shí)，糖酵解和TCA過(guò)程效率降低，機(jī)體就會(huì)啟動(dòng)葡萄糖的合成機(jī)制，用以提供能量[19]。但是，當(dāng)糖酵解過(guò)程效率降低時(shí)，產(chǎn)生的丙酮酸也會(huì)隨之降低，糖異生過(guò)程的主要原料不足，葡萄糖的合成受阻。有研究報(bào)道[20]，母牛產(chǎn)后因采食量降低和泌乳增加，其體內(nèi)糖異生過(guò)程被抑制，從而引起血糖穩(wěn)態(tài)失衡[21]。隨著葡萄糖供能效率的降低，TCA過(guò)程中的草酰乙酸發(fā)生積累，草酰乙酸是糖異生過(guò)程中丙酮酸的下游代謝物，機(jī)體的草酰乙酸則會(huì)直接進(jìn)入糖異生，開(kāi)始合成葡萄糖。而這一過(guò)程可能導(dǎo)致母牦牛圍產(chǎn)后期葡萄糖呈現(xiàn)先降低后升高的趨勢(shì)，這與前期的研究結(jié)果相一致[7]。

3.2 母牦牛圍產(chǎn)后期的脂類代謝

試驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，TG，脂肪酸中的Pca，游離脂肪酸的一類甘油磷脂代謝物PS、PE、PC，以及脂肪酸中亞油酸的代謝物13-HODE和9-HODE等7種代謝物，在5個(gè)不同的時(shí)間點(diǎn)之間表現(xiàn)出了差異性。脂肪是動(dòng)物主要能量?jī)?chǔ)藏形式，主要以TG的形式存在。隨著時(shí)間的推移，TG下調(diào)，這說(shuō)明母牦牛在圍產(chǎn)后期發(fā)生了脂肪動(dòng)員。當(dāng)機(jī)體主要能量來(lái)源受阻時(shí)，為了獲取更多能量維持自身需求，便會(huì)動(dòng)員脂肪以提供能量[22]。

大量脂肪被動(dòng)員后，首先被分解為脂肪酸，Pca和亞油酸都屬于脂肪酸的一種。Pca是一種三碳短鏈脂肪酸，能夠維持腸道和免疫穩(wěn)態(tài)[23]。作為脂肪酸，它能夠直接影響脂肪細(xì)胞調(diào)節(jié)脂肪酸的代謝[24]。亞油酸屬于不飽和脂肪酸家族的一員，13-HODE和9-HODE是亞油酸的衍生物[25]。在人類的研究中發(fā)現(xiàn)，與健康女性相比，患有多囊卵巢綜合癥的女性血液中13-HODE和9-HODE水平升高，說(shuō)明這兩種代謝物與生殖機(jī)能有關(guān)[26]。但是，在牦牛的研究中未見(jiàn)相關(guān)的報(bào)道。在本研究中，13-HODE和9-HODE隨著時(shí)間的推移表達(dá)下調(diào)，說(shuō)明以其上游代謝物亞油酸和Pca為代表的脂肪酸在圍產(chǎn)后期的末期開(kāi)始降低，推測(cè)脂肪動(dòng)員可能在圍產(chǎn)后期的前期作用效率較高，直到中期開(kāi)始降低，末期恢復(fù)糖代謝供能后，脂肪動(dòng)員恢復(fù)正常。另外，發(fā)現(xiàn)幾種甘油磷脂隨著時(shí)間的推移表現(xiàn)不同的表達(dá)情況。甘油磷脂包含1個(gè)極性的磷酸頭部基團(tuán)和1個(gè)或2個(gè)非極性脂肪?；膊炕鶊F(tuán)，是所有活體細(xì)胞膜的主要成分[27]。甘油磷脂與脂肪酸之間可以通過(guò)水解合成作用相互轉(zhuǎn)化，與此同時(shí)，甘油磷脂之間也可以相互轉(zhuǎn)換。本研究中，3類甘油磷脂分別表現(xiàn)上調(diào)和下調(diào)，PC更是表現(xiàn)為先上調(diào)后下調(diào)，結(jié)果說(shuō)明脂肪代謝在產(chǎn)后母牦牛機(jī)體內(nèi)發(fā)生變化，作為機(jī)體能量供給不足時(shí)的能量補(bǔ)充機(jī)制發(fā)揮了作用。

脂肪酸經(jīng)過(guò)反應(yīng)生成乙酰輔酶A，乙酰輔酶A能夠進(jìn)入TCA進(jìn)行完全氧化，也可以通過(guò)脂肪酸代謝的逆方向合成脂肪酸[28]。然而，在母牦牛圍產(chǎn)后期，乙酰輔酶A的這兩條出路由于糖代謝的停滯以及脂肪的過(guò)度動(dòng)員都不能進(jìn)行，為了提供能量，乙酰輔酶A可以轉(zhuǎn)化為乙酰乙酰輔酶A，進(jìn)而形成酮體，即乙酰乙酸、β-羥丁酸和丙酸[29]。酮體作為奶牛在圍產(chǎn)期發(fā)生能量負(fù)平衡的金標(biāo)準(zhǔn)，在牦牛的前期研究中也報(bào)道過(guò)。

本研究篩選的與脂類代謝相關(guān)的關(guān)鍵代謝物，通過(guò)構(gòu)建網(wǎng)絡(luò)機(jī)制發(fā)現(xiàn)，脂類代謝在母牦牛圍產(chǎn)后期的前期為了提供能量，啟動(dòng)脂肪動(dòng)員。過(guò)度的脂肪動(dòng)員產(chǎn)生了乙酰輔酶A，進(jìn)一步反應(yīng)產(chǎn)生了酮體，以供給牦牛機(jī)體能量需求。說(shuō)明母牦牛圍產(chǎn)后期發(fā)生了嚴(yán)重的能量負(fù)平衡。

3.3 母牦牛圍產(chǎn)后期的氨基酸代謝

機(jī)體發(fā)生能量缺口時(shí)，蛋白質(zhì)代謝也為機(jī)體提供能量[30]。氨基酸是蛋白質(zhì)的基本單位，可以分為生糖氨基酸和生酮氨基酸。

3.3.1 生糖氨基酸 生糖氨基酸主要通過(guò)作用于丙酮酸或α-酮戊二酸，本試驗(yàn)結(jié)果中發(fā)現(xiàn)了Gln-Cys復(fù)合體，其中Cys就是作用于丙酮酸的生糖氨基酸。Cys是一種非必需中性氨基酸，為三羧酸循環(huán)提供碳源[31]。另外一個(gè)作用于丙酮酸的生糖氨基酸是Gly，它在分解過(guò)程中經(jīng)過(guò)氨基酸脫氨基、轉(zhuǎn)氨基，再經(jīng)氧化分解生成二氧化碳和水[32]。Gln-Cys復(fù)合體中Gln是作用于α-酮戊二酸的生糖氨基酸，其通過(guò)分界代謝和谷氨酸脫氫酶轉(zhuǎn)化為α-酮戊二酸參與TCA[33]。Arg-Phe中的Arg是作用于α-酮戊二酸的生糖氨基酸，Arg通過(guò)脫氨基作用轉(zhuǎn)變?yōu)樘钱惿緩降闹虚g產(chǎn)物，從而異生成葡萄糖。D-Glu同樣是作用于α-酮戊二酸的生糖氨基酸，它能夠被氧化后在轉(zhuǎn)氨基作用下生成α-酮戊二酸進(jìn)入TCA[34]。

試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)的生糖氨基酸及氨基酸復(fù)合體均表達(dá)上調(diào)，說(shuō)明機(jī)體在血糖較低的情況下，機(jī)體氨基酸代謝效率升高用以補(bǔ)充血糖。但是由于圍產(chǎn)后期的起初糖異生和TCA作用效率過(guò)低，生糖氨基酸并沒(méi)有發(fā)揮作用發(fā)生積累導(dǎo)致的升高。

3.3.2 生酮氨基酸 本試驗(yàn)結(jié)果還發(fā)現(xiàn)了Trp和Tyr-Phe復(fù)合體，它們均為生酮氨基酸，其中Phe和Trp還分別從Arg-Phe和Trp-Gln復(fù)合體中被發(fā)現(xiàn)了。生酮氨基酸可直接作用于乙酰乙酰輔酶A，進(jìn)而生成酮體。Trp作為必需氨基酸之一，是機(jī)體無(wú)法合成的，需要通過(guò)食物來(lái)獲得。Trp經(jīng)過(guò)催化和甲?；傅纫幌盗兴庾饔眯纬杀?，丙酮酸脫羧生成乙酰乙酸[35]；Tyr是一種含有酚羥基的芳香族極性氨基酸[36]，Tyr通過(guò)各種代謝催化后生成尿黑酸，再通過(guò)氧化和水解作用下合成延胡索酸和乙酰乙酸[37-38]；Phe是哺乳動(dòng)物必需的氨基酸，是蛋白質(zhì)生物合成的底物[39]，它能夠通過(guò)酪氨酸轉(zhuǎn)氨酶催化后生成乙酰乙酸[40]。

本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)既存在表達(dá)上調(diào)的生酮氨基酸及氨基酸復(fù)合體，也存在表達(dá)下調(diào)的生酮氨基酸及氨基酸復(fù)合體。Phe與其他生酮氨基酸表達(dá)相反可能是由于在產(chǎn)后初期，與Arg結(jié)合的復(fù)合體利用Arg的生糖功能大量產(chǎn)生，但機(jī)體沒(méi)有啟動(dòng)糖異生所產(chǎn)生的累積導(dǎo)致的。Tyr與Trp表達(dá)下調(diào)，說(shuō)明其參與了脂肪動(dòng)員啟動(dòng)，產(chǎn)生的乙酰輔酶A大量的轉(zhuǎn)化為酮體，以給機(jī)體提供能量。

3.4 母牦牛圍產(chǎn)后期生殖激素的合成與分泌

圍產(chǎn)后期生殖激素的分泌與合成不僅能夠反映母牦牛的生殖系統(tǒng)恢復(fù)情況，也在一定程度上決定了母牦牛下一次妊娠的時(shí)間。圍產(chǎn)期經(jīng)產(chǎn)母牦牛由于能量的流失，糖代謝發(fā)生障礙，過(guò)度的脂肪動(dòng)員使機(jī)體產(chǎn)生酮體供給能量，發(fā)生了能量負(fù)平衡。與此同時(shí)，由于脂肪的過(guò)度動(dòng)員產(chǎn)生的乙酰輔酶A也有部分在循環(huán)血液中形成了部分膽固醇。類固醇激素(甾體激素)是由膽固醇經(jīng)過(guò)一系列酶解反應(yīng)產(chǎn)生的一類環(huán)脂肪烴化合物，主要包括糖皮質(zhì)激素、鹽皮質(zhì)激素和性腺皮質(zhì)激素[41]。循環(huán)血液中的膽固醇主要作用于性腺，對(duì)性腺產(chǎn)生配子及分泌激素起著至關(guān)重要的作用[42]。有研究證實(shí)，膽固醇被催化合成類固醇激素后可進(jìn)行機(jī)體代謝過(guò)程，而此時(shí)可生成皮質(zhì)醇和孕酮[43-44]。在小鼠的研究中發(fā)現(xiàn)，嚴(yán)重控制飲食后，腎上腺皮質(zhì)細(xì)胞中膽固醇轉(zhuǎn)為類固醇激素的代謝通路活躍，大量合成皮質(zhì)醇以此適應(yīng)外界應(yīng)激[45]。這些也與本研究的結(jié)果相一致，代謝組學(xué)結(jié)果顯示作為產(chǎn)生P4的終端產(chǎn)物THCor和Cor在D和E兩個(gè)時(shí)間點(diǎn)分別顯著性升高，說(shuō)明P4在后期開(kāi)始形成并產(chǎn)生終端產(chǎn)物。另一方面，膽固醇也可以形成E2。E2作為最主要的雌性激素，其合成過(guò)程受到多種蛋白的共同調(diào)控作用[46]。作為卵巢類固醇激素的E2，在作用于中樞神經(jīng)系統(tǒng)后，可與P4協(xié)同促進(jìn)子宮發(fā)育并誘導(dǎo)母畜發(fā)情[47-48]。另外，在差異代謝物的結(jié)果中還發(fā)現(xiàn)了MT2，有多個(gè)研究報(bào)告指出，奶牛產(chǎn)奶量和乏情都與MT2有關(guān)[49]。但是相關(guān)機(jī)制尚不清楚。

根據(jù)研究結(jié)果可以推測(cè)，過(guò)度脂肪動(dòng)員后產(chǎn)生的乙酰輔酶A除了大量產(chǎn)生酮體以外，少部分形成了膽固醇，而僅有的膽固醇形成了P4導(dǎo)致最終產(chǎn)物THCor和Cor的上調(diào)。但是，膽固醇并沒(méi)有過(guò)多的形成E2，這一推測(cè)也與前期的研究結(jié)果相一致[7]。母牦牛在圍產(chǎn)后期，調(diào)節(jié)發(fā)情的主要生殖激素濃度不對(duì)等，這可能是經(jīng)產(chǎn)母牦牛產(chǎn)后生殖系統(tǒng)恢復(fù)困難、產(chǎn)犢間隔過(guò)長(zhǎng)的主要原因之一，具體的發(fā)生機(jī)制還需要進(jìn)一步驗(yàn)證。

4 結(jié) 論

本研究對(duì)經(jīng)產(chǎn)母牦牛圍產(chǎn)后期血液代謝譜進(jìn)行分析，通過(guò)關(guān)鍵代謝物的篩選及生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，經(jīng)產(chǎn)母牦牛圍產(chǎn)后期發(fā)生能量負(fù)平衡，糖代謝、脂類代謝和氨基酸代謝發(fā)生不同程度的代謝障礙，對(duì)生殖激素的合成和分泌造成影響，導(dǎo)致產(chǎn)后生殖系統(tǒng)恢復(fù)困難，但具體機(jī)制需要進(jìn)一步驗(yàn)證。本研究結(jié)果為高原地區(qū)母牦牛營(yíng)養(yǎng)代謝和繁殖性能的研究提供了基礎(chǔ)資料和數(shù)據(jù)，為牦牛產(chǎn)業(yè)研究提供了新的方向。