王育南，吳 月，宋哈楠，張 濤，關(guān)偉軍*

(1.佳木斯大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，佳木斯 154007； 2.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院北京畜牧獸醫(yī)研究所，北京 100193)

根據(jù)世界衛(wèi)生組織的數(shù)據(jù)，全世界有超過3.47億人患有糖尿病。糖尿病已成為僅次于癌癥和心腦血管疾病的第三大殺手。1900年，美國登記地區(qū)的糖尿病死亡率為10萬，1915年則為18萬。在波士頓的同一時期，這一數(shù)字從14萬上升到了26萬[1]。胰腺是人體第二大腺體，由內(nèi)分泌部和外分泌部組成[2]。外分泌胰島形成一個重要的消化系統(tǒng)，產(chǎn)生消化酶，包括糜蛋白酶、淀粉酶和脂肪酶，用于消化蛋白質(zhì)、降解碳水化合物和脂肪。內(nèi)分泌胰島是幾種激素的來源，包括胰島素和胰高血糖素[3-4]。胰島素由胰腺中的β細(xì)胞分泌，是控制血糖最重要的代謝激素。所有形式的糖尿病其主要原因是胰島素的喪失，包括胰島β細(xì)胞產(chǎn)生/分泌的胰島素數(shù)量不足[5]。胰島移植曾被認(rèn)為是一種很有前途的糖尿病治療方法。然而，研究表明只有十分之一的受試者在移植后5年內(nèi)保持胰島素獨立。當(dāng)誘導(dǎo)慢性免疫抑制以延長胰島移植物存活時間時，會導(dǎo)致許多疾病的發(fā)生。

近年來人們不斷探索新的治療方法，目前發(fā)現(xiàn)可以用干細(xì)胞移植治療來改善與胰島素分泌減少和胰島素敏感性降低相關(guān)的癥狀[6-7]。在胚胎中, 最早的胰腺來自背側(cè)和腹側(cè)前腸內(nèi)胚層Pdx1陽性細(xì)胞群[8]。隨著研究的不斷深入，Scharfmann等[9]發(fā)現(xiàn)，胎兒胰腺中可能存在多種祖細(xì)胞，而在成體中是否存在多能的胰腺干細(xì)胞還未明確。近年有研究表明，從羊胚胎中分離得到的胰腺間充質(zhì)干細(xì)胞可分化為β細(xì)胞，并改善了1型糖尿病小鼠的血糖[10]。胰腺間充質(zhì)干細(xì)胞比其他間充質(zhì)干細(xì)胞更容易分化為β細(xì)胞[11-12]，且PMSCs在血管發(fā)育、趨化性和傷口愈合過程中高度富集[13]。然而，器官供體的缺乏限制了這些細(xì)胞在體外的分離和分化。鑒于此，本試驗對西門塔爾牛胰腺間充質(zhì)干細(xì)胞進(jìn)行分離培養(yǎng)鑒定，并研究其生物學(xué)特性及多向誘導(dǎo)分化潛能，為基礎(chǔ)獸醫(yī)和臨床糖尿病治療提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗動物 3月齡健康雄性西門塔爾牛胚胎由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院北京畜牧獸醫(yī)研究所昌平試驗基地提供。

1.1.2 試驗材料 胰蛋白酶(Tripsin)、胎牛血清(FBS)、DMEM/F12基礎(chǔ)培養(yǎng)基、L-DMEM基礎(chǔ)培養(yǎng)基、磷酸鹽緩沖液(PBS)均購自Gibco公司；膠原酶Ⅳ購自Sigma公司；封閉用山羊血清、FITC標(biāo)記山羊抗兔二抗購自北京博奧森生物技術(shù)有限公司；CD29、CD44、CD73、CD90、CD34、CD45一抗購自美國Abcam公司；RNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購自TaKaRa公司；胰島素生長因子-1 (IGF-1)、堿性成纖維生長因子(bFGF)、胰島素轉(zhuǎn)鐵蛋白(ITS)均購自英國Perotech公司；吉姆薩染液、油紅O染液、阿利新藍(lán)染液、糖原染液、茜素紅染液均購自索萊寶公司。激光共聚焦顯微鏡(Nikon公司)，TH4-200倒置顯微鏡(Olympus公司)，CO2培養(yǎng)箱(Heraeus公司)，離心機(jī)(Eppendorf公司)。

1.2 方法

1.2.1 PMSCs的分離培養(yǎng) 在無菌條件下從3月齡西門塔爾牛胚胎中獲取胰腺組織，PBS洗滌3遍，切除腸系膜并將胰腺切成小塊(1 mm×1 mm×1 mm)，膠原酶消化法：在37 ℃下用0.1%的膠原酶Ⅳ消化10～20 min?？梢姶罅考?xì)胞從組織塊脫落，再用含10% FBS的DMEM/F12完全培養(yǎng)基中和消化反應(yīng)。所得懸浮液經(jīng)100目篩網(wǎng)過濾，并以1 200 r·min-1離心6 min。接種于細(xì)胞培養(yǎng)皿，培養(yǎng)2 d后，PBS清洗細(xì)胞，以去除非粘附細(xì)胞。組織塊貼壁法：將1 mm×1 mm×1 mm的小塊胰腺組織PBS洗3遍，貼于細(xì)胞培養(yǎng)皿，待組織塊牢固加DMEM/F12完全培養(yǎng)基(DEME/F12+10% FBS+10 ng·mL-1bFGF)，在37 ℃，50 mL·L-1CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。接種數(shù)天后，可見大量細(xì)胞從組織塊周圍爬出，匯合度達(dá)80%時傳代，進(jìn)行后續(xù)培養(yǎng)。

1.2.2 PMSCs生長曲線及群體倍增時間檢測 將第3代、第9代和第15代細(xì)胞以1×104細(xì)胞·孔-1接種到24孔板中。自接種時起每24 h隨機(jī)選取3個孔分別收集細(xì)胞懸浮液進(jìn)行細(xì)胞計數(shù)，連續(xù)計數(shù)8 d。根據(jù)平均值繪制生長曲線，計算群倍增時間(PDT)。PDT=(t-t0)lg2/(lgNt-lgN0)，其中t0是培養(yǎng)開始時間，t是培養(yǎng)終止時間，N0是培養(yǎng)初始細(xì)胞數(shù)，Nt是培養(yǎng)最終細(xì)胞數(shù)。

1.2.3 PMSCs克隆形成能力檢測 將第3代、第9代、第15代的PMSCs細(xì)胞以100細(xì)胞·孔-1接種在6孔板中培養(yǎng)，2周后可見單個PMSCs形成較大克隆團(tuán)，40 g·L-1多聚甲醛固定30 min，PBS洗2次，吉姆薩工作液染色20 min。顯微鏡下拍照觀察克隆形態(tài)并計算克隆形成率，克隆形成率=克隆形成數(shù)/接種細(xì)胞數(shù)×100%，試驗重復(fù)3次以計算平均值。

1.2.4 染色體核型檢測 用0.25%的胰蛋白酶消化貼壁細(xì)胞，顯微鏡下觀察多數(shù)細(xì)胞變圓發(fā)亮，且大部分細(xì)胞單個存在，添加秋水仙素0.2 μg·mL-1，于 37 ℃，50 mL·L-1CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)24 h，消化收集細(xì)胞，2 000 r·min-1離心10 min，棄上清，37 ℃低滲處理30 min， 1 mL固定液輕吹混勻，室溫靜置30 min，重復(fù)固定1次，后吸取細(xì)胞懸液在預(yù)冷的載玻片上方1.5 m處均勻滴下細(xì)胞懸液，室溫干燥，吉姆薩工作液染色20 min。自然風(fēng)干，生物顯微鏡下觀察并拍照。

1.2.5 PMSCs表面標(biāo)志物檢測 將PMSCs接種到六孔板中。在70%匯合時，PBS清洗細(xì)胞，40 g·L-1多聚甲醛固定30 min，0.25% Triton X-100通透10 min。山羊血清室溫下封閉30 min，分別加入CD29、CD44、CD73、CD90抗體稀釋液4 ℃孵育過夜。棄去一抗，PBS洗2次，加入FITC標(biāo)記二抗，孵育1 h；PBS洗3次，DAPI孵育20 min，PBS清洗后，激光共聚焦顯微鏡下觀察并拍照。

1.2.6 多能性相關(guān)基因表達(dá)鑒定 使用Trizol法從細(xì)胞中提取RNA，PCR試劑盒(Takara)合成cDNA。用Primer Premier 5.0 軟件進(jìn)行特異性引物設(shè)計(表1)，擴(kuò)增cDNA。PCR在含有2.0 μL 10× RT緩沖液、13.4 μL蒸餾水、0.2 μL Ex-Taq、1.0 μL正向和反向引物、1.0 μL模板cDNA和1.4 μL dNTP(2.5 mmol·L-1)的20 μL溶液中進(jìn)行。反應(yīng)條件嚴(yán)格按照說明書設(shè)置。PCR產(chǎn)物通過瓊脂糖凝膠電泳在140 V下持續(xù)30 min，觀察多能性相關(guān)基因表達(dá)情況。

表1 引物信息表

1.2.7 誘導(dǎo)分化能力鑒定 成骨誘導(dǎo)液由DMEM/F12、10% FBS、0.1 mmol·L-1地塞米松、10 mmol·L-1β-甘油磷酸和50 mg· L-1維生素C組成;成脂誘導(dǎo)液由DMEM/F-12、10% FBS、10-7mol·L-1地塞米松、8 μg·mL-1胰島素、70 μmol·L-1吲哚美辛、0.5 mmol·L-1IBMX組成。成軟骨誘導(dǎo)液由L-DMEM、2.5% FBS、1% ITS、50 μg·mL-1脯氨酸、0.1 μmol·L-1地塞米松、0.5 mmol·L-1丙酮酸鈉、50 μg·mL-1維生素C、10 ng·mL-1TGF-β3、10 mg·L-1IGF-1組成；成肝樣誘導(dǎo)液由DMEM/F12、5% FBS、20 ng·mL-1FGF-4、20 ng·mL-1HGF、1% ITS組成。當(dāng)細(xì)胞生長至60%匯合度時，PBS洗2次，加入誘導(dǎo)液，誘導(dǎo)液每2 d更換1次。連續(xù)培養(yǎng)，直到觀察到細(xì)胞有誘導(dǎo)標(biāo)志性變化。分別用茜素紅、油紅O、阿利新蘭和糖原染色，并通過RT-PCR分析成骨特異性基因膠原蛋白-Ⅰ(collogen-Ⅰ)和骨橋蛋白(OPN)的表達(dá)；成脂特異性基因過氧化物酶體增殖物激活受體-γ(PPAR-γ)和脂蛋白脂肪酶(LPL)的表達(dá)；成軟骨特異性基因ACAN和SOX9的表達(dá);成肝樣特異性基因白蛋白(ALB)和甲胎蛋白(AFP)的表達(dá)。

1.3 數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)處理使用SPSS25.0軟件進(jìn)行單因素方差分析及鄧肯氏多重比較，用“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示，P<0.05表示差異顯著，P<0.01表示差異極顯著。

2 結(jié) 果

2.1 PMSCs的分離培養(yǎng)

通過膠原酶消化法和組織塊貼壁法均可獲得PMSCs，兩種方法分離的細(xì)胞在傳至第3代時，細(xì)胞形態(tài)均一為長梭形，成漩渦樣生長，無明顯差異(圖1)。

A～D.膠原酶消化法原代、第3代、第9代、第15代(P0、P3、P9、P15)細(xì)胞形態(tài)；E～H.組織塊貼壁法原代、第3代、第9代、第15代(P0、P3、P9、P15)細(xì)胞形態(tài)

2.2 PMSCs體外增殖能力檢測

對第3代、第9代、第15代的PMSCs進(jìn)行細(xì)胞計數(shù)，繪制細(xì)胞生長曲線。三代細(xì)胞增殖過程均經(jīng)歷潛伏期、對數(shù)生長期、平臺期和衰退期，呈典型“S”型(圖2A)。計算得出第3代細(xì)胞的群體倍增時間為31.13 h，第9代細(xì)胞的群體倍增時間為33.75 h，第15代細(xì)胞的群體倍增時間為35.76 h。隨著傳代次數(shù)的增加群體倍增時間也逐漸增加,并且第9代細(xì)胞群體倍增時間顯著低于第15代而高于第3代(P<0.01，圖2B)。

A.PMSCs第3代、第9代、第15代(P3、P9、P15)的生長曲線；B.PMSCs第3代、第9代、第15代(P3、P9、P15)的群體倍增時間。**.P<0.01

2.3 PMSCs克隆形成能力檢測

第3代、第9代、第15代的PMSCs均能夠在低密度條件下形成單克隆團(tuán)(圖3A)?？寺⌒纬陕史謩e是(49±4.58)%、(34±6.08)%、(18.33±4.61)%，西門塔爾牛PMSCs隨著傳代次數(shù)的升高，細(xì)胞的克隆形成能力逐漸減弱。通過SPSS軟件計算表明第3代、第9代、第15代的PMSCs克隆形成率具有顯著差異(P<0.05，圖3B)。

A～C.西門塔爾牛PMSCs 第3代、第9代、第15代(P3、P9、P15)的克隆團(tuán)形態(tài)；D.柱狀圖顯示了不同代次細(xì)胞的克隆形成率。*.P<0.05

2.4 核型分析

取第9代PMSCs進(jìn)行核型分析，染色體數(shù)目為2n=60，其中包括一對性染色體XY。染色體形態(tài)無畸變，表明此次體外培養(yǎng)的PMSCs保持了正常的染色體數(shù)目及形態(tài)(圖4)。

圖4 西門塔爾牛PMSCs染色體核型分析

2.5 免疫熒光表型分析

第7代PMSCs細(xì)胞做免疫熒光檢測結(jié)果顯示，間充質(zhì)干細(xì)胞表面標(biāo)志物CD29、CD44、CD73和CD90均呈陽性表達(dá)，CD45、CD34呈陰性表達(dá)(圖5)。

圖5 免疫熒光檢測西門塔爾牛PMSCs表面標(biāo)志物

2.6 多能性相關(guān)基因表達(dá)鑒定

Primer Premier 5.0 軟件設(shè)計CD29、CD44、CD73、CD90、CD106、CD166和CD34、CD45標(biāo)記基因擴(kuò)增引物，以GAPDH為內(nèi)參基因，結(jié)果顯示間充質(zhì)干細(xì)胞特異性標(biāo)記基因CD29、CD44、CD73、CD90、CD106、CD166呈陽性表達(dá)；造血干細(xì)胞特異性標(biāo)記基因CD34、CD45呈陰性表達(dá)(圖6)。

M. DL1000 DNA相對分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；1. GAPDH；2. CD29；3. CD44；4. CD73；5. CD90；6. CD106；7. CD166；8. CD34；9. CD45

2.7 PMSCs多向分化能力鑒定

2.7.1 成脂誘導(dǎo)分化能力鑒定 成脂誘導(dǎo)6 d后進(jìn)行油紅O染色，誘導(dǎo)后細(xì)胞胞漿可見大量橘紅色油滴，并進(jìn)行RT-PCR檢測，結(jié)果表明成脂誘導(dǎo)后的PMSCs表達(dá)脂肪細(xì)胞相關(guān)基因脂蛋白脂肪酶(LPL)和過氧化物酶體增殖激活受體γ(PPAR-γ),而對照組LPL和PPAR-γ呈陰性表達(dá)(圖7)。

A.對照組油紅O染色；B.誘導(dǎo)組油紅O染色；C:M. DL1000 DNA相對分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；1. GAPDH； 2.誘導(dǎo)組LPL；3.誘導(dǎo)組PPAR-γ；4.對照組LPL；5.對照組PPAR-γ

2.7.2 成骨誘導(dǎo)分化能力的鑒定 成骨誘導(dǎo)15 d后進(jìn)行茜素紅染色，誘導(dǎo)后可見沉積的鈣鹽被染成紅色，RT-PCR結(jié)果顯示成骨誘導(dǎo)后的PMSCs表達(dá)Ⅰ型膠原蛋白(CollagetypeⅠ)和骨橋蛋白(osteopontin)基因，而對照組未檢測到CollagetypeⅠ和osteopontin表達(dá)(圖8)。

A.對照組茜素紅染色；B.誘導(dǎo)組茜素紅染色；C: M. DL1000 DNA相對分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；1. GAPDH；2.誘導(dǎo)組collagen type I；3.誘導(dǎo)組osteopontin；4.對照組collagen type I；對照組osteopontin

2.7.3 成軟骨誘導(dǎo)分化能力的鑒定 成軟骨誘導(dǎo)15 d后進(jìn)行阿利新蘭染色，誘導(dǎo)組可見含酸性黏多糖的軟骨結(jié)節(jié)被染成藍(lán)色，RT-PCR結(jié)果顯示成軟骨誘導(dǎo)后的PMSCs表達(dá)ACAN和SOX9基因，而對照組未檢測到ACAN和SOX9基因表達(dá)(圖9)。

A.對照組阿利新蘭染色；B.誘導(dǎo)組阿利新藍(lán)染色；C: M. DL1000 DNA 相對分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；1. GAPDH；2.誘導(dǎo)組ACAN；3.誘導(dǎo)組SOX9；4.對照組ACAN；5.對照組SOX9

2.7.4 成肝樣誘導(dǎo)分化能力的鑒定 成肝樣誘導(dǎo)15 d后進(jìn)行糖原染色，誘導(dǎo)組可見胞質(zhì)內(nèi)儲存的糖原被染為紫紅色，RT-PCR結(jié)果顯示成肝樣誘導(dǎo)后的PMSCs表達(dá)白蛋白(ALB)和甲胎蛋白(AFP)基因，而對照組ALB和AFP基因呈陰性表達(dá)(圖10)。

A.對照組糖原染色；B.誘導(dǎo)組糖原染色；C:M.DL1000 DNA 相對分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；1.GAPDH；2.誘導(dǎo)組AFP；3.誘導(dǎo)組ALB；4.對照組AFP；5.對照組ALB

3 討 論

間充質(zhì)干細(xì)胞具有免疫調(diào)節(jié)作用，有助于從組織損傷中恢復(fù)和抑制炎癥。許多研究調(diào)查了基于MSCs對糖尿病治療的可行性、安全性和有效性[14-16]。然而，臨床使用的最佳來源還沒有被證實。因此，相同組織來源或胚胎發(fā)育過程中同源區(qū)域組織類型來源的干細(xì)胞可能提供新的治療策略[17]。PMSCs除了對糖尿病具有治療潛力，Thirlwell等[18]通過對PMSCs和骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs)分化潛能和免疫調(diào)節(jié)能力的比較表明PMSCs在治療移植物抗宿主病方面也具有優(yōu)勢。

通過酶消法和貼壁法均可從西門塔爾牛胚胎中獲得生長狀態(tài)良好的PMSCs，細(xì)胞形態(tài)為長梭形且傳代時間一致。隨著傳代次數(shù)的增加群體倍增時間逐漸增加，克隆形成率逐漸降低。說明隨著細(xì)胞傳代次數(shù)的增加細(xì)胞逐漸衰老。二倍體核型和穩(wěn)定的染色體數(shù)目、形狀和結(jié)構(gòu)是細(xì)胞生長和功能的先決條件。核型分析是區(qū)分正常細(xì)胞和變異細(xì)胞的一種簡單實用的方法[19-20]。西門塔爾牛有30對染色體，包括性染色體X和Y[21-22]。本研究培養(yǎng)的西門塔爾牛PMSCs均為正常二倍體(2n=60，XY)。這些發(fā)現(xiàn)可能對理解染色體融合的分子機(jī)制、基因進(jìn)化具有重要意義。

西門塔爾牛PMSCs的識別通?；贛SCs特異性標(biāo)記 CD29、CD44、CD73、CD90[23]。CD44是一種細(xì)胞表面糖蛋白，參與細(xì)胞間相互作用、遷移和粘附，參與淋巴細(xì)胞激活、再循環(huán)和歸巢等多種細(xì)胞功能[24]。CD73主要分布在細(xì)胞表面，并通過糖基磷脂酰肌醇(GPI)與細(xì)胞膜結(jié)合[25]。血管細(xì)胞黏附分子-1(CD106 或VCAM-1)是一種細(xì)胞因子誘導(dǎo)的細(xì)胞表面蛋白，能夠介導(dǎo)粘附[26]。目前，間充質(zhì)干細(xì)胞鑒定除了根據(jù)細(xì)胞形態(tài)學(xué)、生長特征、多種免疫表型外，另外一項重要的特征是其在體外具有多向分化潛能。細(xì)胞在體外必須能夠分化成骨細(xì)胞、脂肪細(xì)胞、軟骨細(xì)胞等[27]。研究表明，魯西黃牛PMSCs在體外可分化為中胚層脂肪細(xì)胞和骨細(xì)胞[27]。本試驗將生長狀態(tài)良好的PMSCs在不同誘導(dǎo)條件下分化為中胚層骨細(xì)胞、脂肪細(xì)胞、軟骨細(xì)胞，并跨胚層誘導(dǎo)分化成肝樣細(xì)胞，進(jìn)一步驗證了西門塔爾牛PMSCs具有良好的體外分化潛能。骨細(xì)胞相關(guān)標(biāo)記基因的表達(dá)包括CollagetypeⅠ和OPN，OPN是成骨分化和成熟的早期標(biāo)記[28-29]，脂肪細(xì)胞相關(guān)標(biāo)記基因的表達(dá)包括LPL和PPAR-γ，PPAR-γ屬于配體激活轉(zhuǎn)錄因子的核激素受體超家族，已知可作為脂肪細(xì)胞分化的主要轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子，并抑制成骨細(xì)胞分化[30]。軟骨細(xì)胞標(biāo)記基因包括ACAN和SOX9。由ACAN基因編碼的蛋白聚糖是細(xì)胞外軟骨基質(zhì)中的主要蛋白多糖成分[31]。SOX9是一種主轉(zhuǎn)錄因子，通過階段特異性調(diào)控一系列下游因子參與軟骨形成的序列事件[32]。本研究發(fā)現(xiàn)，在進(jìn)行成骨和成軟骨誘導(dǎo)時細(xì)胞匯合度應(yīng)選取50%左右，但在成脂誘導(dǎo)時細(xì)胞匯合度應(yīng)選取80%左右為宜。這主要是因為在成脂誘導(dǎo)過程中細(xì)胞不再增殖，啟動了凋亡程序[33]。西門塔爾牛PMSCs分化為肝樣細(xì)胞15 d后可表達(dá)ALB和AFP，并在胞質(zhì)儲存糖原。由于ALB和AFP是肝細(xì)胞存在和代謝活性的特異性標(biāo)志基因，只有肝細(xì)胞才能產(chǎn)生和儲存糖原，提示此時PMSCs在體外已經(jīng)成功向肝樣細(xì)胞分化[34]。但是由于缺少體內(nèi)微環(huán)境的調(diào)節(jié)，在體外誘導(dǎo)成的肝樣細(xì)胞會受到誘導(dǎo)條件影響而產(chǎn)生不同成熟度的肝樣細(xì)胞，因此本試驗中誘導(dǎo)分化獲得的肝樣細(xì)胞尚需更詳盡的方案來評價其多方面的肝細(xì)胞功能。

4 結(jié) 論

本研究成功從3月齡西門塔爾牛胚胎胰腺組織中分離到PMSCs，細(xì)胞形態(tài)均一，呈長梭形，并保持了較高的自我更新能力；西門塔爾牛PMSCs表達(dá)MSCs相關(guān)的表面標(biāo)記基因CD29、CD44、CD73、CD90、CD106、CD166,不表達(dá)CD34、CD45；西門塔爾牛PMSCs在體外可向成脂、成骨、成軟骨、成肝樣細(xì)胞分化，具有較高的分化潛能。有望在細(xì)胞治療方面發(fā)揮潛力，為組織工程學(xué)提供新的種子細(xì)胞。