李藝陽(yáng)，殷詩(shī)舒，廖印長(zhǎng)，徐 康，張躍博,3*，何 俊,3*

(1.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，長(zhǎng)沙 410000；2.中國(guó)科學(xué)院亞熱帶農(nóng)業(yè)生態(tài)研究所 動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)生理與代謝過(guò)程實(shí)驗(yàn)室，長(zhǎng)沙 410000；3.嶺南現(xiàn)代農(nóng)業(yè)科學(xué)與技術(shù)廣東省實(shí)驗(yàn)室，廣州 510000)

寧鄉(xiāng)豬是我國(guó)優(yōu)良的地方豬種之一，具有早熟易肥、適應(yīng)性廣、肉質(zhì)鮮美等特點(diǎn)，因而深受消費(fèi)者喜愛(ài)[1-2]。有研究表明，肌內(nèi)脂肪(IMF)含量是影響豬肉品質(zhì)的重要因素之一[3-4]，與杜長(zhǎng)大三元雜交商品豬相比，寧鄉(xiāng)豬IMF含量更高[5]，但由于未經(jīng)歷高強(qiáng)度選育，其變異也較大，十分不利于優(yōu)質(zhì)豬肉的標(biāo)準(zhǔn)化生產(chǎn)。因此，鑒別影響寧鄉(xiāng)豬IMF含量的基因，并利用標(biāo)記輔助選擇方法來(lái)穩(wěn)定和提升其IMF含量十分必要。本研究通過(guò)對(duì)IMF相關(guān)基因遺傳變異的綜合分析，以期篩選出影響寧鄉(xiāng)豬IMF含量的基因位點(diǎn)，為寧鄉(xiāng)豬IMF含量性狀的分子標(biāo)記輔助選育提供科學(xué)依據(jù)。

脂肪酸結(jié)合蛋白(FABPs)是一類(lèi)在哺乳動(dòng)物組織中表達(dá)的胞漿蛋白，能夠結(jié)合脂肪酸和其他疏水性配體[6]。FABPs屬于細(xì)胞內(nèi)類(lèi)脂結(jié)合蛋白家族，參與細(xì)胞內(nèi)長(zhǎng)鏈脂肪酸的轉(zhuǎn)運(yùn)，可將脂肪酸從細(xì)胞膜運(yùn)送到脂肪酸氧化位點(diǎn)及其與甘油二酯及磷脂的合成位置[7]，研究發(fā)現(xiàn)FABPs能夠調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)脂肪的合成和轉(zhuǎn)運(yùn)[8]。豬的H-FABP基因5′UTR區(qū)和第二內(nèi)含子處存在與IMF相關(guān)的多態(tài)性位點(diǎn)，是影響IMF含量的重要候選基因之一[9]。哺乳動(dòng)物的A-FABP基因參與了甘油三酯的生成過(guò)程[10]，直接影響了IMF的含量，對(duì)脂肪代謝有重要的調(diào)控作用?；騿伪缎团c表型的關(guān)聯(lián)分析比SNP位點(diǎn)與表型的關(guān)聯(lián)分析更加準(zhǔn)確，分析基因單倍型與性狀的相關(guān)性可以提高表型分析的準(zhǔn)確性。另外，有研究指出，通過(guò)對(duì)不同豬種背最長(zhǎng)肌差異表達(dá)基因的篩選，發(fā)現(xiàn)SLC13A5基因Bsu36 I多態(tài)性酶切位點(diǎn)(NC_010454.4:g.50705299T/C)以及NR1H4基因MwoI多態(tài)性酶切位點(diǎn)(NM_001206993:g.83607915G/A)均與IMF含量顯著相關(guān)[11-12]。本研究的目的在于檢測(cè)FABPs、SLC13A5和NR1H4基因在寧鄉(xiāng)豬上的多態(tài)性，為寧鄉(xiāng)豬育種工作提供有效分子標(biāo)記。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

本研究中試驗(yàn)動(dòng)物來(lái)自寧鄉(xiāng)大龍豬場(chǎng)，選擇達(dá)到上市屠宰日齡的172頭寧鄉(xiāng)公豬。所有豬只均在相同的飼養(yǎng)管理?xiàng)l件下育肥至屠宰，屠宰前24 h禁食，提供自由飲水。屠宰后采集背最長(zhǎng)肌樣品，于-20 ℃冷凍保存。

1.2 DNA的提取

采用傳統(tǒng)的苯酚-氯仿抽提法提取組織DNA，測(cè)定DNA濃度，根據(jù)測(cè)定出的樣品濃度，用滅菌水稀釋DNA至20 ng·mL-1，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 IMF含量的測(cè)定

試驗(yàn)豬屠宰后立即采集左半側(cè)胴體腰椎處背最長(zhǎng)肌約50 g，并參照文獻(xiàn)[13]采用索氏抽提法進(jìn)行肌內(nèi)脂肪提取。

1.4 引物設(shè)計(jì)合成與PCR擴(kuò)增

根據(jù)GenBank注冊(cè)的X98558和Y16180序列，在H-FABP基因5′上游區(qū)和第二內(nèi)含子區(qū)用Primer 5.0設(shè)計(jì)2對(duì)引物。從NCBI下載豬A-FABP基因組序列(GenBank登錄號(hào)：Y16039)設(shè)計(jì)引物。依據(jù)參考文獻(xiàn)[11-12]報(bào)道的序列設(shè)計(jì)SLC13A5和NR1H4基因的引物(表1)。所有引物均由北京擎科生物科技有限公司合成。

表1 H-FABP、NR1H4、A-FABP和SLC13A5的引物序列

PCR擴(kuò)增體系(25 μL)： Mix 12.5 μL，模板DNA 5 μL，上、下引物(10 μmol·L-1)各1 μL，滅菌蒸餾水5.5 μL。PCR擴(kuò)增條件：95 ℃預(yù)變性3 min；95 ℃變性30 s，退火15 s，72 ℃延伸15 s，共34個(gè)循環(huán)；最后72 ℃延伸5 min。PCR產(chǎn)物由1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，要求目的條帶清晰、單一無(wú)雜帶，將符合條件的PCR產(chǎn)物進(jìn)行酶切試驗(yàn)。

1.5 基因分型

H-FABP應(yīng)用限制性?xún)?nèi)切酶Hinf Ⅰ、HaeⅢ和MspⅠ進(jìn)行PCR-RFLP分型。Hinf Ⅰ酶切體系(30 μL)：PCR擴(kuò)增產(chǎn)物10 μL，Buffer 2 μL，限制性?xún)?nèi)切酶1 μL，滅菌蒸餾水17 μL；37 ℃反應(yīng)5～15 min。HaeⅢ和MspI酶切體系(31 μL)：PCR擴(kuò)增產(chǎn)物10 μL，Buffer 2 μL，限制性?xún)?nèi)切酶1 μL，滅菌蒸餾水18 μL；37 ℃反應(yīng)1～16 h。酶切產(chǎn)物用1.5%瓊脂糖凝膠電泳分析。H-FABP基因酶切后等位基因的判定及酶切片段的長(zhǎng)度見(jiàn)表2。A-FABP、SLC13A5和NR1H4基因經(jīng)PCR擴(kuò)增，獲得的良好產(chǎn)物由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司進(jìn)行測(cè)序。測(cè)序結(jié)果用DNAMAN系列軟件進(jìn)行比對(duì)分析。

表2 H-FABP基因等位基因的判定及酶切片段的長(zhǎng)度

1.6 統(tǒng)計(jì)分析

群體中的遺傳組成用基因型頻率和基因頻率表示。遺傳標(biāo)記多態(tài)程度的常用指標(biāo)有純合度(Ho)、雜合度(He)、有效等位基因數(shù)(Ne)、多態(tài)信息含量(PIC)等。PIC可以用來(lái)表示群體中某一位點(diǎn)多態(tài)性的程度，PIC>0.5為高度多態(tài)，PIC<0.25為低度多態(tài)，0.25

H-FABP基因的Hinf Ⅰ(SNP1)和HaeⅢ(SNP2)多態(tài)性位點(diǎn)間的連鎖不平衡分析采用Haploview軟件，采用R語(yǔ)言haplo.stats程序包進(jìn)行單倍型種類(lèi)及其頻率的分析。采用SPSS 26統(tǒng)計(jì)分析軟件的GLM(general linear model)程序分析不同基因型與IMF含量的相關(guān)性，統(tǒng)計(jì)模型為：

Y=μ+D+R+e

式中，Y為肌內(nèi)脂肪含量測(cè)量值；μ為群體均值；D為體重效應(yīng)；R為基因型效應(yīng)；e為隨機(jī)殘差效應(yīng)。

2 結(jié) 果

2.1 PCR產(chǎn)物擴(kuò)增結(jié)果

擴(kuò)增產(chǎn)物用1.5%的瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測(cè)(圖1)。結(jié)果顯示，擴(kuò)增片段與目的片段大小一致且特異性較好，可直接進(jìn)行RFLP或測(cè)序。

A. H-FABP基因706 bp的PCR產(chǎn)物；B. H-FABP基因816 bp的PCR產(chǎn)物；C. NR1H4基因761 bp的PCR產(chǎn)物；D. A-FABP基因783 bp的PCR產(chǎn)物；E. SLC13A5基因815 bp的PCR產(chǎn)物

2.2 H-FABP基因PCR-RFLP結(jié)果

在706 bp的擴(kuò)增片段上存在4個(gè)Hinf Ⅰ酶切位點(diǎn)，產(chǎn)生339、172、110、59及26 bp共5個(gè)片段，其中第1 324 bp具有多態(tài)性，產(chǎn)生了HH、Hh、hh三種基因型；在816 bp擴(kuò)增片段中存在3個(gè)HaeⅢ酶切位點(diǎn)，產(chǎn)生405、278、117及16 bp共4個(gè)片段，其中第1 811 bp處為多態(tài)性酶切位點(diǎn)，產(chǎn)生了DD和Dd兩種基因型；在816 bp擴(kuò)增片段中存在1個(gè)MspⅠ酶切位點(diǎn)，產(chǎn)生727、89 bp兩個(gè)片段，僅檢測(cè)出AA一種基因型(圖2)。

A. H-FABP基因Hinf I酶切分型結(jié)果圖；B. H-FABP基因Hae III酶切分型結(jié)果；C. H-FABP基因Msp I酶切分型結(jié)果

2.3 A-FABP、SLC13A5和NR1H4基因突變位點(diǎn)測(cè)序結(jié)果

通過(guò)DANMAN和Chromas軟件對(duì)寧鄉(xiāng)豬A-FABP、SLC13A5和NR1H4基因PCR產(chǎn)物測(cè)序結(jié)果進(jìn)行比對(duì)分析，結(jié)果見(jiàn)圖3。A-FABP基因測(cè)序結(jié)果顯示，A-FABP基因783 bp擴(kuò)增片段中沒(méi)有發(fā)現(xiàn)SNP位點(diǎn)；在SLC13A5基因815 bp擴(kuò)增片段中發(fā)現(xiàn)1個(gè)SNP位點(diǎn)(251 bp處)，存在3種基因型：BB型、Bb型和bb型；在NR1H4基因761 bp擴(kuò)增片段中同樣發(fā)現(xiàn)1個(gè)SNP位點(diǎn)(293 bp處)，測(cè)序結(jié)果顯示共發(fā)現(xiàn)了TT、Tt和tt三種基因型。

A.SLC13A5基因SNP測(cè)序峰圖；B.NR1H4基因SNP測(cè)序峰圖

2.4 寧鄉(xiāng)豬群體遺傳學(xué)分析

經(jīng)卡方適合性檢驗(yàn)分析，Hinf Ⅰ-RFLP位點(diǎn)和NR1H4基因多態(tài)性位點(diǎn)上的等位基因頻率和基因型頻率都處于Hardy-Weinberg平衡狀態(tài)(P>0.05)，HaeⅢ-RFLP位點(diǎn)、SLC13A5基因多態(tài)性位點(diǎn)經(jīng)卡方適合性檢驗(yàn)，都未達(dá)到Hardy-Weinberg平衡狀態(tài)(P<0.05)，可能與試驗(yàn)群體數(shù)量少或近交程度有關(guān)。

從表3可以看出，H-FABP-Hinf Ⅰ酶切位點(diǎn)、SLC13A5和NR1H4基因多態(tài)性位點(diǎn)的純合度分別為0.62、0.54和0.62；多態(tài)信息含量分別為0.30、0.35和0.30，均屬中度多態(tài)(0.25

表3 寧鄉(xiāng)豬酶切位點(diǎn)多態(tài)性分析結(jié)果

2.5 寧鄉(xiāng)豬多態(tài)性位點(diǎn)不同基因型與IMF含量的關(guān)聯(lián)分析

寧鄉(xiāng)豬多態(tài)性位點(diǎn)與IMF含量的關(guān)聯(lián)分析結(jié)果見(jiàn)表4。寧鄉(xiāng)豬H-FABP基因Hinf Ⅰ位點(diǎn)酶切后3種基因型的IMF含量表現(xiàn)為Hh>HH>hh，其中Hh基因型與HH和hh基因型的IMF含量之間的差異達(dá)到極顯著水平(P<0.01)，HH基因型與hh基因型的IMF含量差異不顯著(P>0.05)。在HaeⅢ酶切位點(diǎn)上，只出現(xiàn)了DD和Dd兩種基因型，其中D等位基因占主導(dǎo)地位，Dd基因型IMF含量極顯著高于DD基因型(P<0.01)。

表4 寧鄉(xiāng)豬群不同位點(diǎn)各基因型IMF含量的比較

H-FABP基因MspⅠ酶切及A-FABP基因測(cè)序結(jié)果顯示寧鄉(xiāng)豬均不存在多態(tài)現(xiàn)象；SLC13A5基因多態(tài)性位點(diǎn)上檢測(cè)出的3種基因型在IMF含量上無(wú)顯著差異(P>0.05)，但呈現(xiàn)出bb>BB>Bb的趨勢(shì)；NR1H4基因多態(tài)性位點(diǎn)處3種基因型間的IMF含量差異也不顯著(P>0.05)。

2.6 寧鄉(xiāng)豬H-FABP基因單倍型組合與IMF含量的關(guān)聯(lián)分析

連鎖不平衡分析發(fā)現(xiàn)，H-FABP基因SNP1和SNP2位點(diǎn)處于強(qiáng)連鎖不平衡狀態(tài)(D′>0.72)。單倍型種類(lèi)及其頻率分析表明，H-FABP基因的2個(gè)SNPs位點(diǎn)在寧鄉(xiāng)豬群體中共形成了3種單倍型(HD、hD和hd)，分別命名為H1、H2和H3，單倍型頻率分別為0.74、0.22和0.03。根據(jù)2個(gè)突變位點(diǎn)的連鎖不平衡結(jié)果，對(duì)H1～H3組成的每個(gè)個(gè)體的單倍型組合進(jìn)行分析，共發(fā)現(xiàn)5種單倍型組合。

在形成的5種單倍型組合中，其中hD/hd單倍型組合樣本數(shù)為1，不進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析。用剩余4種單倍型組合與寧鄉(xiāng)豬IMF含量性狀進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析，結(jié)果見(jiàn)表5。H1H3(其序列為HD/hd)單倍型組合個(gè)體的IMF含量顯著高于H1H2(其序列為HD/hD)單倍型組合個(gè)體(P<0.05)，極顯著高于剩余兩種單倍型組合個(gè)體(P<0.01)。因此，在本試驗(yàn)群體中H1H3單倍型組合個(gè)體具有最高的IMF含量。

表5 H-FABP基因單倍型組合及其與IMF含量性狀的關(guān)聯(lián)分析

3 討 論

大量研究表明，豬IMF含量受多個(gè)基因影響[15-18]。Ockner等[19]首次從腸組織液中分離出FABP，進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)FABP能特異性的結(jié)合脂肪酸，參與細(xì)胞內(nèi)脂肪的運(yùn)輸。在哺乳動(dòng)物中FABPs家族至少有9種蛋白類(lèi)型[20]。不同類(lèi)型的FABP在不同的組織和細(xì)胞中表達(dá)，其中H-FABP在心肌、骨骼肌和乳腺中表達(dá)，A-FABP在脂肪細(xì)胞中表達(dá)[21]。本研究采用PCR-RFLP結(jié)合測(cè)序技術(shù)分析了寧鄉(xiāng)豬H-FABP和A-FABP基因的遺傳多態(tài)性，結(jié)果表明H和D為優(yōu)勢(shì)等位基因。寧鄉(xiāng)豬H-FABP-Hinf Ⅰ位點(diǎn)存在多態(tài)性，等位基因H的頻率為0.75，表現(xiàn)為中度多態(tài)(PIC=0.304 7)，與劉志成等[22]、張陳華等[23]及劉劍鋒等[24]在不同豬種中的研究結(jié)果基本一致。采用最小二乘效應(yīng)分析表明，基因型Hh對(duì)IMF含量的效應(yīng)值最大，該結(jié)果與王存芳[25]、Gerbens等[26]對(duì)杜洛克等國(guó)外豬種的分析結(jié)果有所差異，導(dǎo)致這一現(xiàn)象的原因可能與中外豬群體的遺傳背景不同有關(guān)。經(jīng)分析，H-FABP基因HaeⅢ酶切位點(diǎn)Dd基因型的IMF含量最高，并且未檢測(cè)到dd基因型，這與2003年柳小春等[27]報(bào)道的多態(tài)性結(jié)果一致，可能是由于dd基因型個(gè)體較少造成的，同時(shí)在一定程度上說(shuō)明近20年來(lái)寧鄉(xiāng)豬保種效果良好。林萬(wàn)華等[28-30]對(duì)國(guó)內(nèi)外不同豬種HaeⅢ位點(diǎn)的多態(tài)性分析表明，不同豬種間多態(tài)性存在差異，等位基因頻率也各有不同。目前，在動(dòng)物生產(chǎn)中單倍型分析得到越來(lái)越多的應(yīng)用，與單個(gè)SNPs位點(diǎn)分析相比，利用單倍型研究QTL與動(dòng)物生產(chǎn)性能間的相關(guān)性，能夠更準(zhǔn)確的分析表型性狀的遺傳信息。房嘉園等[31]通過(guò)構(gòu)建包含IGF-1R兩種單倍型的表達(dá)載體，發(fā)現(xiàn)大型豬和小型豬IGF-1R胞外域編碼區(qū)兩種單倍型在轉(zhuǎn)錄和翻譯水平上影響基因的表達(dá)，進(jìn)而調(diào)控動(dòng)物的生長(zhǎng)發(fā)育。本研究對(duì)H-FABP基因的Hinf Ⅰ和HaeⅢ酶切位點(diǎn)進(jìn)行單倍型分析，共形成3種單倍型、5種單倍型組合，其中H1H3是IMF含量性狀的優(yōu)勢(shì)單倍型。

在H-FABP-MspⅠ酶切位點(diǎn)上，所有被檢測(cè)個(gè)體的基因型均為AA型。黃大鵬等[32]、Pang等[14]對(duì)國(guó)內(nèi)外不同豬種的分析結(jié)果表明，此位點(diǎn)上杜洛克豬、長(zhǎng)白豬和大白豬3個(gè)國(guó)外豬種均存在多態(tài)性，而地方豬種內(nèi)江豬、榮昌豬、漢江黑豬和八眉豬為單態(tài)。林萬(wàn)華等[28]在杜洛克、長(zhǎng)白、大約克、南昌白、二花臉、梅山、玉山黑豬等10個(gè)中外豬種上的研究結(jié)果也顯示，除杜洛克豬外其他豬種在此位點(diǎn)均無(wú)多態(tài)。根據(jù)之前的報(bào)道及研究結(jié)果可以認(rèn)為，中國(guó)地方豬種在MspⅠ位點(diǎn)上缺乏多態(tài)性。

在A-FABP基因的Bsu36 Ⅰ酶切位點(diǎn)上，三江白豬、大白豬、東北民豬、長(zhǎng)白豬和大河烏豬都存在多態(tài)性[32-35]，并且不同基因型間IMF含量存在顯著差異。本研究在此位點(diǎn)上僅檢測(cè)出一種基因型，可能原因是樣本數(shù)相對(duì)較少，其他基因型在群體中出現(xiàn)的頻率較低。目前，豬A-FABP基因的遺傳多態(tài)性研究相對(duì)較少。在松遼黑豬和軍牧1號(hào)白豬中，A-FABP基因遺傳多態(tài)性與大理石紋之間存在一定的相關(guān)性[36-37]。有研究指出，在杜洛克豬A-FABP基因第1內(nèi)含子區(qū)發(fā)現(xiàn)的1條微衛(wèi)星序列，其多態(tài)性與IMF含量相關(guān)[38]。因此，利用該基因位點(diǎn)進(jìn)行與寧鄉(xiāng)豬肉質(zhì)相關(guān)性狀的選育有待更進(jìn)一步的研究。

NR1H4基因在哺乳動(dòng)物肌肉和脂質(zhì)的能量代謝中起著重要的調(diào)節(jié)作用[38-39]，Yang等[40]利用PCR-RFLP技術(shù)在沙子嶺豬NR1H4基因的第9外顯子MwoI酶切位點(diǎn)處檢測(cè)到1個(gè)SNP，在產(chǎn)生的GG、GA和AA三種基因型中，G等位基因在沙子嶺豬中頻率較高，同時(shí)發(fā)現(xiàn)該基因在背肌的表達(dá)高于其他組織。本研究在NR1H4基因的SNP位點(diǎn)檢測(cè)到3種基因型，其中Tt基因型的IMF含量高于TT和tt基因型，但不同基因型對(duì)IMF含量的關(guān)聯(lián)均未達(dá)到顯著水平。Luo等[41]研究發(fā)現(xiàn)，豬SLC13A5基因Bsu36 I酶切位點(diǎn)多態(tài)性與IMF含量有顯著的關(guān)系，本研究對(duì)寧鄉(xiāng)豬SLC13A5基因的多態(tài)性進(jìn)行研究，共檢測(cè)到3種基因型，其中bb型個(gè)體的IMF含量最高，但3種基因型間的IMF含量差異并不顯著(P>0.05)，與王玲玉[42]在大白豬中的研究結(jié)果一致。

4 結(jié) 論

對(duì)H-FABP、NR1H4、A-FABP和SLC13A5基因在寧鄉(xiāng)豬群體中多態(tài)性的研究表明，H-FABP-MspⅠ和A-FABP-Bsu36 Ⅰ兩位點(diǎn)不存在多態(tài)現(xiàn)象；測(cè)序結(jié)果顯示，SLC13A5和NR1H4兩個(gè)多態(tài)性位點(diǎn)的不同基因型間IMF含量差異均不顯著，而H-FABP基因Hinf Ⅰ和HaeⅢ位點(diǎn)存在多態(tài)性，并與寧鄉(xiāng)豬IMF含量顯著關(guān)聯(lián)，其中這兩個(gè)位點(diǎn)形成的單倍型組合HD/hd的IMF含量最高。本研究結(jié)果可為寧鄉(xiāng)豬IMF含量性狀的分子標(biāo)記輔助選育提供參考。