陸 靜，陳文文，吳懷通，陳贏男

(南京林業(yè)大學林木遺傳與生物技術省部共建教育部重點實驗室，南京林業(yè)大學林學院，南方現(xiàn)代林業(yè)協(xié)同創(chuàng)新中心，江蘇 南京 210037)

成花是植物生長發(fā)育過程中的重要轉折，是一個復雜的生物學過程，受到多種植物內(nèi)源和外界環(huán)境信號的共同調控?；跀M南芥(Arabidopsisthaliana)、金魚草(Antirrhinummajus)等草本模式植物的研究結果，目前公認的成花調控途徑主要包括：春化途徑、光周期途徑、赤霉素途徑、環(huán)境溫度途徑、年齡途徑和自主途徑[1]。此外，分子生物學技術的快速發(fā)展促使越來越多花分生組織和花器官發(fā)育特征基因被分離鑒定。如花分生組織特征基因LFY(LEAFY)、AP1(APETALA1)、FUL(FRUITFUL)、CAL(CAULIFLOWER)等可以調控花序分生組織轉變?yōu)榛ǚ稚M織，決定花器官起始和發(fā)育[2-4]；B類功能基因AP3(APETALA3)調控花瓣和雄蕊的發(fā)育[5]；C類功能基因AG(AGAMOUS)決定雌蕊和雄蕊形成[6]。關于木本植物成花機理的研究起步較晚，盡管研究者發(fā)現(xiàn)一些開花調控分子路徑在不同植物中存在保守性，如光周期途徑中CO-FT調控植物響應日長、晝夜節(jié)律變化，并對休眠具有重要調節(jié)功能[7]；年齡途徑中miR156/miR172調控童期向成年期轉變[8]，但總體看對木本植物成花調控分子機制的認識還十分有限。與草本植物不同，木本植物大多需經(jīng)歷較長的童期才能成花，且花器官分化延續(xù)時間較長。人們一方面希望培育早花品系，縮短童期，加快育種進程；另一方面希望能夠延遲開花，調節(jié)光合產(chǎn)物分配，以提高木材產(chǎn)量、改良木材品質。因此，研究木本植物花芽分化進程和特點，闡明花芽分化過程中外部形態(tài)與內(nèi)部解剖結構的相關性，對于揭示樹木成花的分子調控機制具有重要意義。

美洲黑楊(Populusdeltoides)屬楊柳科楊屬(Populus)黑楊派，原產(chǎn)北美洲東部和中部地區(qū)，具有樹干通直、生長迅速、材質優(yōu)良等特點[9]。自20世紀70年代引種以來，經(jīng)過40多年的大規(guī)模栽培實踐，美洲黑楊已成為我國重要的速生用材和造林樹種之一。同時，美洲黑楊也是人工雜交親本的主要來源[10]，如利用美洲黑楊與歐美楊(Populus×canadensis)雜交，從子代群體中選育出來的‘南林895楊’被收入國家林業(yè)和草原局首批林木良種名錄，適于在黃淮、江淮及長江中下游平原地區(qū)推廣種植[11]。本研究利用石蠟切片技術，對不同發(fā)育時期的美洲黑楊雌、雄花器官進行觀察研究，以期明確美洲黑楊花芽分化時間，系統(tǒng)分析不同性別花器官發(fā)育關鍵階段和相應特征，為進一步深入研究楊樹花器官發(fā)育及性別分化的分子機制奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

以栽植于南京林業(yè)大學校園內(nèi)的成年美洲黑楊為試驗材料，樹高約20 m，冠幅5～6 m，樹冠四周受光均勻，長勢良好，無病蟲害。于2018年6—10月，每隔15 d采集1次雌、雄花芽；2018年11月至2019年3月，每隔30 d采集1次雌、雄花芽，共計采樣15次(編號T1—T15)。樣品編號與采樣時間的對應關系見表1。

表1 采樣時間與樣品編號

1.2 試驗方法

觀察不同生長階段美洲黑楊雌、雄花芽外部形態(tài)特征并測量其長度，每時期7個生物學重復。將花芽浸泡于FAA固定液(體積分數(shù)為70%的乙醇溶液90 mL，冰醋酸、體積分數(shù)為38%的甲醛和丙三醇各5 mL)，固定24 h以上。T11—T15時期的樣品，用手術刀去除花芽外部鱗片后再進行固定。石蠟切片制作參考付盼等[12]的方法，包括：乙醇梯度脫水(體積分數(shù)75%、85%、95%乙醇溶液，每梯度脫水各40 min；無水乙醇處理第1次20 min，第2次10 min)、透明處理(無水乙醇與二甲苯體積比 1∶1混合液靜置20 min，后轉入二甲苯溶液2次，依次為15 min和10 min)、浸蠟包埋(熔點為58～60 ℃)、切片(厚度8～10 μm)、烘片、脫蠟復水，并用番紅-固綠雙重染色法染色，封片烘干。將制作好的切片在Axio Imager 2型光學顯微鏡(ZEISS)下觀察并拍照記錄。

2 結果與分析

2.1 美洲黑楊雌、雄花芽外觀形態(tài)特征

在南京地區(qū)，每年成年美洲黑楊的花芽形態(tài)分化始于5月底至6月初，6月中旬至7月中旬(T2—T4)雌花和雄花原基則出現(xiàn)明顯形態(tài)學差異，雄花原基普遍較雌花原基大而飽滿。無論是雌花芽還是雄花芽，苞片在每個生長階段都保持外觀嫩綠、質地堅硬、保留2道芽鱗痕(圖1A)。對不同生長階段美洲黑楊雌、雄花芽縱向長度進行統(tǒng)計分析，結果顯示：花芽的生長趨勢呈“S”形(sigmoid)。表現(xiàn)為當年6月初至10月初(T1—T9)，花芽長度增幅較大；10月末開始至次年1月(T10—T13)，生長速度增加緩慢，開始進入休眠期；次年2月至3月(T14—T15)，花芽逐漸解除休眠，恢復生長，在T15階段迅猛增長，越發(fā)膨大，部分花芽的芽鱗出現(xiàn)明顯松動直至完全開花(圖1B)。

A.雌、雄花芽外觀形態(tài)對比comparison of appearance and morphology of male and female floral buds；B.雌、雄花芽生長曲線growth curves of male and female floral buds。**.同一時期雌、雄花芽長度存在極顯著差異(P<0.01)。** refered a extremely significant difference in floral bud length between female and male plants at the same stage(P<0.01).

2.2 美洲黑楊雌、雄花芽解剖結構特征

為進一步研究美洲黑楊雌、雄花芽形態(tài)分化的基本規(guī)律，利用石蠟切片技術，對比分析了不同時期雌、雄花芽的解剖結構，并將所觀察到的美洲黑楊花芽發(fā)育過程分為5個階段(Stage Ⅰ-Stage Ⅴ，表2)。

表2 美洲黑楊雌、雄花芽發(fā)育階段

苞片分化期(Stage Ⅰ)：鱗片包裹內(nèi)的雌、雄花序原基外形均呈圓錐形，生長點頂端表面趨于平坦，并在側面首先分化形成苞片；在6月初，雄花芽長度和寬度均已大于雌花芽，且從苞片的分化和伸長情況來看，雄花序原基較早開始分化。隨著苞片的不斷伸長，花序呈現(xiàn)向頂分化，進入小花原基起始期(Stage Ⅱ)：苞片腋部細胞逐漸分化形成盤狀花原基，隨后其邊緣細胞不斷膨大形成突起的組織環(huán)；同時，位于雌花芽頂端中央的細胞不斷擴張，呈球形凸起(圖2，T3♀、T4♀)，而此時雄花芽頂端中央的細胞分化較慢，呈凹陷狀(圖2，T2♂)。

雌蕊分化期(Stage Ⅲ)：花原基四周形成的突起組織環(huán)繼續(xù)增大，最終形成杯狀花被(圖2，T8♀)；9月末，小花頂端出現(xiàn)明顯的二分叉狀結構(圖2，T8♀)，子房已具雛形；11月中旬，形成具有柱頭、花柱和子房的完整雌蕊，即單性雌花(無花瓣結構)，柱頭四分裂，子房單室，含2～4心皮，側膜胎座。根據(jù)Boes等[13]對毛果楊(P.trichocarpa)雌花芽的解剖觀察，孢原細胞的發(fā)生也在這個時期開始。此后，雌蕊發(fā)育停滯，進入冬季休眠期。第2年春季孢原細胞體積增大，分裂形成大孢子母細胞，伴隨鱗芽松動，大孢子母細胞進一步分化形成大孢子和胚囊，胚珠倒生(Stage V)。至此，雌花發(fā)育成熟，每朵小花下有膜狀杯形花被(圖2,T13♀)。

雄蕊分化期(Stage Ⅲ)：7月初，在圓盤狀凹陷的分生區(qū)內(nèi)出現(xiàn)很多圓形凸起，即雄蕊原基(圖2，T3♂)；9月下旬，花盤內(nèi)已形成較為明顯的花藥結構(圖2，T8♂)，花藥進一步發(fā)育成蝶形花粉囊，可見4個花粉囊室，每個花粉囊室內(nèi)已分化出大量的小孢子母細胞(圖2，T12♂、T13♂)，此后雄花芽進入休眠。第2年春季，小孢子囊最內(nèi)層細胞發(fā)育成絨氈層，小孢子母細胞減數(shù)分裂，經(jīng)四分體時期最終形成成熟花粉(Stage V)，花藥表皮栓質化(圖2，T15♂)，最終開裂促進傳粉。辛昊陽等[14]對美洲黑楊小孢子母細胞減數(shù)分裂進程進行了詳細觀察，同樣發(fā)現(xiàn)減數(shù)分裂始于3月中旬，在花序露出鱗片之前完成，但未明確指出美洲黑楊成熟花粉粒的類型。董源[15]曾報道毛白楊(P.tomentosa)的成熟花粉為二核花粉粒。而判斷美洲黑楊成熟花粉粒的類型仍需對小孢子到花粉粒的發(fā)育過程進行持續(xù)觀察。

圖2 不同發(fā)育時期美洲黑楊雌、雄花芽解剖學觀察

3 討 論

開花是有花植物生長發(fā)育過程的重要轉折點，植物的成花調控可以分為3個階段：開花誘導(floral induction)、花的發(fā)端(floral evocation)和花器官發(fā)育(floral organ development)[16-17]。不同于草本模式植物擬南芥，楊樹在完成童期向成年期轉變后，每年1次的季節(jié)性開花都需經(jīng)歷上述3個階段才能成花[18]。Yuceer等[19]通過對22 a樹齡的成年美洲黑楊開展長期調查，提出了跨越3 a的開花周期：第1個生長季的5—9月枝條頂端形成鱗芽，鱗芽在冬季經(jīng)歷休眠和春化作用；第2個生長季的3—9月，由頂端鱗芽發(fā)育而成的當年生枝條由下向上可以分為3個區(qū)域，即營養(yǎng)區(qū)I(vegetative zone I)→開花區(qū)(floral zone)→營養(yǎng)區(qū)Ⅱ(vegetative zone Ⅱ)，只有位于開花區(qū)的腋芽經(jīng)過成花誘導和花的發(fā)端才能發(fā)育為肉眼可見的花芽，完成花器官發(fā)育并在冬季再次經(jīng)歷休眠；第3個生長季的3—5月開花，完成傳粉和受精過程。本研究在6月初所采集到的雌、雄花芽已經(jīng)完成了成花誘導和花的發(fā)端，進入花器官發(fā)育階段。雌、雄花芽在T1階段雖然與營養(yǎng)芽形態(tài)相似，但并不是營養(yǎng)芽向生殖芽轉變的過渡階段，而是已經(jīng)處于花器官分化初期。此外，不同于擬南芥的4輪完全花，美洲黑楊為柔荑花序，其花結構僅由苞片和雄蕊或雌蕊兩輪結構組成，這種高度退化的花器官及緊密排列的花序結構可能是楊柳科植物趨同進化(convergent evolution)的結果，更有利于傳粉和受精[20]。

楊屬植物為雌雄異株(偶然存在雌雄同株的情況)，是研究植物性別決定遺傳機制的理想材料之一。Mitchell等[21]根據(jù)花發(fā)育過程將單性花分為兩種類型：Ⅰ型，在花發(fā)育過程中存在同時具備雌蕊和雄蕊的階段，在發(fā)育完成之前某一性別的花器官發(fā)生敗育，最終產(chǎn)生單性花；Ⅱ型，整個花發(fā)育過程僅出現(xiàn)一種性別的花器官。因此，在完成發(fā)育的Ⅰ型單性花中仍然可以看到殘存的、不育的相反性別花器官，將具有這種單性花的雌雄異株植物稱為隱性雌雄異株[22]，如柿子[23]、獼猴桃[24]等。本研究通過對美洲黑楊雌、雄花芽完整發(fā)育過程的解剖學觀察，發(fā)現(xiàn)在雌或雄花芽苞片腋部發(fā)生的花器官原基僅發(fā)育成雌蕊或雄蕊，因此美洲黑楊雌花和雄花均為Ⅱ型單性花，其性別分化應該發(fā)生在心皮原基和雄蕊原基起始之前。研究花芽發(fā)育和分化規(guī)律，探究花芽外部形態(tài)與內(nèi)部解剖結構之間的相關性，不僅為解析植物成花和花器官發(fā)育特征基因，揭示植物性別分化分子機制等前沿理論研究提供重要基礎，還可為生產(chǎn)實踐中優(yōu)異種質資源的選育和管理等提供參考依據(jù)。例如，對不同品種大蒜(Alliumsativum)花芽分化進程進行解剖觀察，明確了花芽分化時間與品種熟性的關系，對栽培過程中調控大蒜抽薹開花具有指導意義[25]；對刺槐(Robiniapseudoacacia)不同時期花蕾外部形態(tài)與雌雄配子發(fā)育特征的剖析可為花器官離體培養(yǎng)接種外植體的選擇提供依據(jù)[26]；對青錢柳(Cyclocaryapaliurus)雌、雄花芽分化外部形態(tài)和內(nèi)部發(fā)育進程相關性的研究可為選育優(yōu)質青錢柳種質和選擇栽培管理措施提供基礎[27]；對麻瘋樹(Jatrophacurcas)花發(fā)育形態(tài)和解剖結構的研究可為人工增加麻瘋樹雌雄花比例、提高掛果率和種籽產(chǎn)量提供依據(jù)[28]。三倍體楊樹具有速生、優(yōu)質、抗病等優(yōu)勢，利用2n花粉進行雜交是培育三倍體楊樹的重要途徑[29]。辛昊陽等[14]詳細記錄了美洲黑楊小孢子母細胞的發(fā)生過程，為人工誘導2n配子的適時取材提供了參考。本研究對美洲黑楊雌、雄花芽發(fā)育關鍵時期開展了詳細的觀察和分析，將有助于指導楊樹的人工授粉，提高雜交概率。