謝存一 李劍梅 郭玲玲 張疏雨 朱萬芹 柴林山

（遼寧省微生物科學(xué)研究院，遼寧朝陽 122000）

桑黃Sanghuangporus是一類重要的藥用真菌，有“森林黃金”之美稱[1]。桑黃在我國具有悠久的應(yīng)用歷史，在歷代本草著作中均有記載，最早可見于東漢的《神農(nóng)本草經(jīng)》。據(jù)《藥性論》記載：桑黃味微苦，性寒，具有治療痢疾、盜汗、血崩、脫肛瀉血、帶下、閉經(jīng)、止瀉，并具有延年等功效[2?3]。隨著現(xiàn)代生物技術(shù)的發(fā)展，桑黃類真菌逐漸被明確富含多糖、黃酮類、萜類等活性物質(zhì)，其中桑黃多糖是桑黃類真菌中一種重要的活性物質(zhì)，其胞內(nèi)多糖來源于菌絲體、子實(shí)體，胞外多糖大多來源于發(fā)酵液[4?6]。研究表明：桑黃多糖能促使腫瘤細(xì)胞自我毀滅，防止腫瘤細(xì)胞附著于體內(nèi)并抑制轉(zhuǎn)移，抑制率為96.78%，是目前國際公認(rèn)的生物抗癌天然產(chǎn)品中最有效的一種藥用真菌，已經(jīng)成為國內(nèi)外醫(yī)藥制劑與保健品行業(yè)研究與開發(fā)的熱點(diǎn)[7?8]。因此，對(duì)桑黃及其提取物中多糖含量的測(cè)定就顯得十分重要。目前，多糖測(cè)定方法有很多種，直接測(cè)定的高效毛細(xì)管電泳法、高效液相色譜法等在實(shí)際應(yīng)用中較為受限；利用多糖的性質(zhì)，在一定條件下與顯色劑發(fā)生反應(yīng)的測(cè)定方法則相對(duì)簡(jiǎn)單方便，如水楊酸法、斐林法、苯酚?硫酸法及蒽酮?硫酸法等，其中苯酚?硫酸法與蒽酮?硫酸法應(yīng)用更為廣泛[9?10]。但不同的測(cè)定方法及測(cè)定條件測(cè)定不同來源多糖表現(xiàn)出的準(zhǔn)確性、穩(wěn)定性、重現(xiàn)性有所不同。為提高桑黃多糖含量測(cè)定的準(zhǔn)確性，筆者以桑黃Lnonotus linteu菌株S?1液體培養(yǎng)獲得的胞外多糖為原料，采用苯酚?硫酸法及蒽酮?硫酸法測(cè)定桑黃發(fā)酵液胞外多糖，比較其含量及加標(biāo)回收率，明確桑黃多糖測(cè)定的最適方法；并采用單因素試驗(yàn)，考察顯色劑用量、顯色劑濃度、顯色時(shí)間、顯色溫度對(duì)測(cè)定結(jié)果的影響，優(yōu)選其最佳測(cè)定條件，為桑黃菌株代謝產(chǎn)物及其產(chǎn)品研發(fā)、質(zhì)量控制提供科學(xué)的參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

（1）菌種：桑黃菌株S?1來源于遼寧省微生物科學(xué)研究院。

（2）主要儀器：723N 可見分光光度計(jì)（上海儀電分析儀器有限公司）；SpH?2102 立式雙層大容量恒溫培養(yǎng)搖床（上海世平實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司）；HFsafe?1200 生物安全柜（上海力申科學(xué)儀器有限公司）；CKX41SF 電 子 顯 微 鏡（OLYMPUS CORPORA‐TION）；BCD?649 WADV冰箱（青島海爾股份有限公司）；LDZX?75KBS 立式高壓蒸汽滅菌器（上海申安醫(yī)療器械廠）；DHG?9 240 A 電熱鼓風(fēng)干燥箱（上海一恒科學(xué)儀器有限公司）；KQ?50B 超聲清洗機(jī)（昆山舒美超聲儀器有限公司）；GL?21M 高速冷凍離心機(jī)（長沙湘儀離心機(jī)儀器有限公司）。

（3）培養(yǎng)基：PDA 改良培養(yǎng)基為馬鈴薯20%，蔗糖 2%，牛肉膏 0.8%，MgSO40.15%，KH2PO40.3%，VB110 mg/L，玉米粉0.25%，豆粉0.25%。

（4）主要試劑

葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液：稱取105 ℃干燥至恒重的無水葡萄糖10.0 mg，用蒸餾水溶解，定容至100 mL，配置成0.1 mg/mL的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液。

苯酚溶液：稱取3.0 g、4.0 g、5.0 g、6.0 g、7.0 g 重蒸苯酚置于棕色容量瓶中，分別用蒸餾水定容至100 mL，配制成質(zhì)量濃度分別為3%，4%，5%，6%，7%的苯酚溶液，置于棕色試劑瓶中，備用。

蒽酮?硫酸試劑：精密稱取0.100 0 g 蒽酮，置棕色容量瓶中，用80%濃硫酸溶解并定容至100 mL，現(xiàn)用現(xiàn)配。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 桑黃胞外多糖溶液的制備

從PDA 斜面挑取4 塊新鮮的S?1 桑黃菌株菌絲塊（單塊約0.5 cm2）接入裝有 100 mL 的 PDA 改良培養(yǎng)基的三角瓶中（250 mL），于28 ℃、150 r/min 條件下?lián)u床振蕩避光培養(yǎng)7 d；培養(yǎng)結(jié)束后，用三層紗布過濾發(fā)酵液，收集濾液，于10 ℃、14 400×g條件下離心20 min，收集上清液，然后吸取0.5 mL的上清液于250 mL 容量瓶中，用蒸餾水稀釋至刻度（即為桑黃胞外多糖供試樣品液），備用。

1.2.2 不同測(cè)定方法比較

苯酚?硫酸法：準(zhǔn)確吸取0.1 mg/mL 的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液0 mL、0.4 mL、0.8 mL、1.2 mL、1.6 mL、2.0 mL于25 mL 比色管中，分別用蒸餾水將其補(bǔ)足至2.0 mL；加入1.0 mL 5%苯酚溶液，混勻，迅速加入5 mL 98%濃硫酸，混勻，40 ℃水浴15 min 后迅速冷卻，于波長490 nm處測(cè)定吸光度值（A），獲得葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線方程式為：y=16.844x?0.077（R2=0.9881）；同步吸取2 mL 的桑黃菌株胞外多糖供試樣品液置于25 mL比色管中，測(cè)定供試樣品液的吸光度值，依據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線方程式計(jì)算胞外多糖的質(zhì)量濃度。每組測(cè)定3次，取平均值。

蒽酮?硫酸法：準(zhǔn)確吸取0.1 mg/mL 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液 0 mL、0.2 mL、0.4 mL、0.6 mL、0.8 mL、1.0 mL、1.2 mL 置于25 mL 比色管中，分別補(bǔ)蒸餾水至2.0 mL，迅速加入蒽酮?硫酸試劑6.0 mL，沸水浴15 min 后迅速冷卻，于波長620 nm 處測(cè)定吸光度值（A），獲得葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線方程式為：y=0.008x?0.001（R2=0.987）；同步吸取2 mL 的桑黃菌株胞外多糖供試樣品液置于25 mL 比色管中，測(cè)定供試樣品液的吸光度值，依據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線方程式計(jì)算胞外多糖的質(zhì)量濃度。每組測(cè)定3次，取平均值。

加標(biāo)回收率測(cè)定：吸取1.0 mL 桑黃胞外多糖供試樣品液3 份，分別加入0.1 mg/mL 的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液0.2 mL、0.4 mL、0.6 mL，分別用苯酚?硫酸法、蒽酮?硫酸法測(cè)定多糖含量，計(jì)算加標(biāo)回收率并比對(duì)。

1.2.3 苯酚?硫酸法測(cè)定條件優(yōu)化

1.2.3.1 濃硫酸用量的優(yōu)化

移取5 份胞外多糖供試樣品液2.0 mL 于25 mL比色管中，加入1 mL 5%苯酚溶液，混勻后迅速加入1.0 mL、3.0 mL、5.0 mL、7.0 mL、9.0 mL 的濃硫酸，搖勻，40 ℃水浴顯色15 min，取出后迅速冷卻至室溫，于波長490 nm處測(cè)定吸光度值。

1.2.3.2 苯酚溶液質(zhì)量濃度的優(yōu)化

移取5 份胞外多糖供試樣品液2.0 mL 于25 mL比色管中，分別加入1 mL 質(zhì)量濃度為3%、4%、5%、6%、7%的苯酚溶液，混勻后分別迅速加入（優(yōu)化用量）濃硫酸，搖勻后于40 ℃水浴顯色15 min，取出后迅速冷卻至室溫，于波長490 nm處測(cè)定吸光度值。

1.2.3.3 苯酚溶液用量的優(yōu)化

采用優(yōu)化的濃硫酸用量及苯酚質(zhì)量濃度。移取5 份胞外多糖供試液2.0 mL 于25 mL 比色管中，分別加入 0.2 mL、0.6 mL、1.0 mL、1.4 mL、1.8 mL 苯酚溶液，混勻后分別于冰水浴中迅速加入濃硫酸，搖勻，40 ℃水浴顯色15 min，取出后迅速冷卻至室溫，于波長490 nm處測(cè)定吸光度值。

1.2.3.4 水浴顯色時(shí)間的優(yōu)化

在上述優(yōu)化條件下，移取6 份胞外多糖供試樣品液2.0 mL于25 mL比色管中，按照1.2.3.1方法，依次加入苯酚、濃硫酸，搖勻，在優(yōu)化的水浴溫度條件下分別顯色 5 min、10 min、15 min、25 min、30 min、35 min，取出后迅速冷卻至室溫，于波長490 nm 處測(cè)定吸光度值。

1.2.3.5 顯色溫度的優(yōu)化

移取5 份胞外多糖供試樣品液2.0 mL 于25 mL比色管中，在優(yōu)化的顯色劑用量及質(zhì)量濃度條件下，按照1.2.3.1 方法，依次加入苯酚、濃硫酸，搖勻后分別在 20 ℃、40 ℃、60 ℃、80 ℃、100 ℃水浴條件下顯色15 min，取出后迅速冷卻至室溫，于波長490 nm處測(cè)定吸光度值。

1.2.4 方法準(zhǔn)確度及精密度

1.2.4.1 線性關(guān)系考察

準(zhǔn)確吸取0.1 mg/mL 的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液0 mL、0.4 mL、0.8 mL、1.2 mL、1.6 mL、2.0 mL，于 25 mL 比色管中，用蒸餾水補(bǔ)足至2.0 mL；然后在優(yōu)化的測(cè)定條件下，按照1.2.2 中的苯酚?硫酸法測(cè)定不同質(zhì)量濃度葡萄糖溶液的吸光度值，以葡萄糖質(zhì)量濃度（mg/mL）為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)制備標(biāo)準(zhǔn)曲線，考察優(yōu)化條件下測(cè)定方法的準(zhǔn)確度。

1.2.4.2 穩(wěn)定性試驗(yàn)

在優(yōu)化的測(cè)定條件下，移取2.0 mL 胞外多糖供試樣品液，依次加入苯酚溶液、濃硫酸，顯色、冷卻后分別放置 5 min、10 min、15 min、30 min、60 min、90 min，于波長490 nm 處測(cè)定吸光度值，考察吸光度值變化情況。

1.2.4.3 精密度試驗(yàn)

精密移取5 份2.0 mL 的胞外多糖供試樣品液，按1.2.4.1 檢測(cè)方法平行測(cè)定其吸光度值，并計(jì)算相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差。

1.2.4.4 加標(biāo)回收率試驗(yàn)

移取4 份1.0 mL 胞外多糖供試樣品液于25 mL比色管中，取其中的3 份，分別加入0.1 mg/mL 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液 0.6 mL、0.8 mL、1.0 mL，然后分別用蒸餾水補(bǔ)足2 mL，按1.2.4.1 測(cè)定方法平行測(cè)定其吸光度值，計(jì)算加標(biāo)回收率。

1.3 數(shù)據(jù)處理

試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用Excel軟件進(jìn)行處理及繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同測(cè)定方法多糖含量的測(cè)定結(jié)果

苯酚?硫酸法及蒽酮?硫酸法均可用于測(cè)定桑黃菌株胞外多糖含量。但相比于苯酚?硫酸法[胞外多糖測(cè)定值為（22.877±0.982）mg/mL]，蒽酮?硫酸法測(cè)定的桑黃胞外多糖含量的結(jié)果值偏高，為（34.25±0.5）mg/mL。由表1 可知，蒽酮?硫酸法平均加樣回收率為114.38%，RSD 為6.21%，表明加樣回收率較差，而苯酚?硫酸法的平均加樣回收率為95.42%，RSD 為2.33%，為良好范圍值。由此可見，苯酚?硫酸法測(cè)定桑黃胞內(nèi)外多糖含量比較好。

表1 兩種多糖測(cè)定方法測(cè)算結(jié)果比較

2.2 苯酚-硫酸法測(cè)定條件優(yōu)化

2.2.1 濃硫酸用量的確定

由圖1 可知，溶液吸光度值隨著濃硫酸用量的增加呈現(xiàn)出先增高后降低的趨勢(shì)。當(dāng)濃硫酸用量低于7.0 mL 內(nèi)，吸光度值上升幅度較大，當(dāng)濃硫酸用量為7.0 mL 時(shí)，吸光度值最高（0.908），然后隨著濃硫酸用量的增加，吸光度值小幅度下降，這主要是由于過量的濃硫酸導(dǎo)致多糖成分的碳化所致。因此，濃硫酸最適用量為7.0 mL。

圖1 不同濃硫酸用量測(cè)得的吸光度值

2.2.2 苯酚溶液質(zhì)量濃度的確定

由圖2可知，在優(yōu)化的濃硫酸用量條件下，隨著苯酚溶液的質(zhì)量濃度上升，供試樣品液的吸光度值緩慢上升，當(dāng)苯酚溶液質(zhì)量濃度為5%時(shí)，供試樣品液的吸光度值達(dá)峰值（0.979）；然后隨著苯酚溶液質(zhì)量濃度的上升，吸光度值略有下降，但下降幅度較小?？梢?，苯酚溶液的質(zhì)量濃度對(duì)吸光度值影響幅度較小，苯酚溶液最適質(zhì)量濃度為5%。

圖2 不同苯酚溶液質(zhì)量濃度測(cè)得的吸光度值

2.2.3 苯酚溶液用量的確定

由圖3 可知，在優(yōu)化的濃硫酸用量及苯酚溶液質(zhì)量濃度條件下，苯酚溶液的用量對(duì)吸光度值具有顯著影響，吸光度值變化較大。其中，在苯酚溶液用量低于1.0 mL時(shí)，吸光度值呈現(xiàn)快速上升的趨勢(shì)，當(dāng)苯酚溶液用量為1.0 mL 時(shí)，吸光度值最高（0.985），然后隨著苯酚溶液用量的上升，吸光度值呈顯著的下降趨勢(shì)。故苯酚溶液最適用量為1.0 mL。

圖3 不同苯酚溶液用量測(cè)得的吸光度值

2.2.4 顯色時(shí)間的確定

由圖4可知，在上述優(yōu)化條件下，隨著顯色時(shí)間的上升，吸光度值逐漸上升，當(dāng)顯色時(shí)間為15 min時(shí)，吸光度值最高（0.913），然后隨著顯色時(shí)間的延長，吸光度值呈現(xiàn)小幅度的下降趨勢(shì)。因此，最適顯色時(shí)間為15 min。

圖4 不同顯色時(shí)間測(cè)得的吸光度值

2.2.5 水浴顯色溫度的確定

由圖5 可知，在優(yōu)化的顯色試劑用量及濃度條件下，水浴溫度對(duì)吸光度值影響較小，呈現(xiàn)小幅度的先上升后下降趨勢(shì)，當(dāng)水浴溫度為60 ℃時(shí)，吸光度值最高（0.944）。因此，最適顯色溫度為60 ℃。

圖5 不同水浴顯色溫度測(cè)得的吸光度值

2.3 優(yōu)化測(cè)定條件后的苯酚-硫酸法考察

2.3.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

優(yōu)化測(cè)定條件下，以葡萄糖質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，吸光度值A(chǔ)為縱坐標(biāo)，繪制葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線。由圖6 可知，葡萄糖質(zhì)量濃度在0~100μg/mL，其與吸光度值具有良好的線性關(guān)系，所獲得的線性回歸方程為y=15.319x-0.008 8，其R2=0.999 3；表明優(yōu)化后的苯酚?硫酸法具有良好的準(zhǔn)確性。

圖6 優(yōu)化后葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線方程

2.3.2 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取相同供試樣品液5 份，在相同條件下測(cè)定吸光度值，結(jié)果如表2。由表2 可知，隨著顯色時(shí)間的延長，供試樣品液的吸光度值呈小幅度的先上升后下降趨勢(shì)，90 min 內(nèi)的吸光度值在0.966~0.976，平均值為0.972，RSD 為0.32%，表明優(yōu)化后的苯酚?硫酸測(cè)定方法穩(wěn)定性良好。

表2 穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果

2.3.3 精密度試驗(yàn)

由表3 可知，同一供試樣品溶液，在相同條件下，重復(fù)測(cè)定吸光度值5 次，所測(cè)得的吸光度平均值為0.963，相對(duì)平均偏差RSD 為1.80%?？梢?，所獲方法重現(xiàn)性良好。

表3 精密度試驗(yàn)結(jié)果

2.3.4 加樣回收率

由表4 可知，在試驗(yàn)范圍內(nèi)，采用優(yōu)化后的苯酚?硫酸法的加樣回收率在101.05%~104.88%，平均回收率為103.24%，相對(duì)平均偏差 RSD 為1.91%。可見，優(yōu)化后的苯酚?硫酸法測(cè)定結(jié)果穩(wěn)定、良好。

表4 加樣回收率結(jié)果

3 小結(jié)

以桑黃菌株S?1 胞外多糖為試驗(yàn)材料，兩種方法測(cè)定多糖含量測(cè)定結(jié)果表明，苯酚?硫酸法及蒽酮?硫酸法均可直接測(cè)定桑黃菌株胞外多糖的含量，但相比之下，蒽酮?硫酸法測(cè)定胞外多糖的含量值均偏高，苯酚?硫酸法測(cè)定的結(jié)果值更為可信，且苯酚?硫酸法的加標(biāo)回收率（95.42%，RSD=2.33%）較蒽酮?硫酸法（114.38%，RSD=6.21%）表現(xiàn)更好，是測(cè)量桑黃胞內(nèi)外多糖的更優(yōu)選擇。

苯酚?硫酸法測(cè)定多糖含量的原理是在濃硫酸水合產(chǎn)生的高溫條件下將多糖水解成單糖，而苯酚與單糖迅速脫水生成的糖衍生物發(fā)生反應(yīng)，生成橙黃色化合物，再以紫外可見光分光光度計(jì)法測(cè)定[11]，方法中濃硫酸、苯酚質(zhì)量濃度、苯酚溶液的用量、顯色時(shí)間、水浴溫度對(duì)吸光度值具有一定的影響。單因素優(yōu)化結(jié)果表明：試驗(yàn)范圍內(nèi)，各因素對(duì)吸光度值的影響均呈先上升后降低的變化趨勢(shì)，最優(yōu)的試驗(yàn)條件：在2.0 mL 待測(cè)樣品液中，加入5%苯酚溶液1 mL，緩慢加入濃硫酸7 mL，于60 ℃水浴條件下顯色15 min；優(yōu)化后的苯酚?硫酸法，0~100 μg/mL 葡萄糖質(zhì)量濃度與吸光度值具有良好的線性關(guān)系，穩(wěn)定性、精密度試驗(yàn)的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）分別為0.32%、1.80%；平均加標(biāo)回收率為103.24%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD=1.91%。可見，優(yōu)化的苯酚?硫酸法具有良好的準(zhǔn)確度、穩(wěn)定性、重現(xiàn)性，可作為桑黃菌株發(fā)酵液胞外多糖的測(cè)定方法。