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        桑黃發(fā)酵液胞外多糖含量測(cè)定方法的比較及優(yōu)化

        2022-11-28 11:51:06謝存一李劍梅郭玲玲張疏雨朱萬芹柴林山
        食用菌 2022年6期
        關(guān)鍵詞:優(yōu)化

        謝存一 李劍梅 郭玲玲 張疏雨 朱萬芹 柴林山

        (遼寧省微生物科學(xué)研究院,遼寧朝陽 122000)

        桑黃Sanghuangporus是一類重要的藥用真菌,有“森林黃金”之美稱[1]。桑黃在我國具有悠久的應(yīng)用歷史,在歷代本草著作中均有記載,最早可見于東漢的《神農(nóng)本草經(jīng)》。據(jù)《藥性論》記載:桑黃味微苦,性寒,具有治療痢疾、盜汗、血崩、脫肛瀉血、帶下、閉經(jīng)、止瀉,并具有延年等功效[2?3]。隨著現(xiàn)代生物技術(shù)的發(fā)展,桑黃類真菌逐漸被明確富含多糖、黃酮類、萜類等活性物質(zhì),其中桑黃多糖是桑黃類真菌中一種重要的活性物質(zhì),其胞內(nèi)多糖來源于菌絲體、子實(shí)體,胞外多糖大多來源于發(fā)酵液[4?6]。研究表明:桑黃多糖能促使腫瘤細(xì)胞自我毀滅,防止腫瘤細(xì)胞附著于體內(nèi)并抑制轉(zhuǎn)移,抑制率為96.78%,是目前國際公認(rèn)的生物抗癌天然產(chǎn)品中最有效的一種藥用真菌,已經(jīng)成為國內(nèi)外醫(yī)藥制劑與保健品行業(yè)研究與開發(fā)的熱點(diǎn)[7?8]。因此,對(duì)桑黃及其提取物中多糖含量的測(cè)定就顯得十分重要。目前,多糖測(cè)定方法有很多種,直接測(cè)定的高效毛細(xì)管電泳法、高效液相色譜法等在實(shí)際應(yīng)用中較為受限;利用多糖的性質(zhì),在一定條件下與顯色劑發(fā)生反應(yīng)的測(cè)定方法則相對(duì)簡(jiǎn)單方便,如水楊酸法、斐林法、苯酚?硫酸法及蒽酮?硫酸法等,其中苯酚?硫酸法與蒽酮?硫酸法應(yīng)用更為廣泛[9?10]。但不同的測(cè)定方法及測(cè)定條件測(cè)定不同來源多糖表現(xiàn)出的準(zhǔn)確性、穩(wěn)定性、重現(xiàn)性有所不同。為提高桑黃多糖含量測(cè)定的準(zhǔn)確性,筆者以桑黃Lnonotus linteu菌株S?1液體培養(yǎng)獲得的胞外多糖為原料,采用苯酚?硫酸法及蒽酮?硫酸法測(cè)定桑黃發(fā)酵液胞外多糖,比較其含量及加標(biāo)回收率,明確桑黃多糖測(cè)定的最適方法;并采用單因素試驗(yàn),考察顯色劑用量、顯色劑濃度、顯色時(shí)間、顯色溫度對(duì)測(cè)定結(jié)果的影響,優(yōu)選其最佳測(cè)定條件,為桑黃菌株代謝產(chǎn)物及其產(chǎn)品研發(fā)、質(zhì)量控制提供科學(xué)的參考依據(jù)。

        1 材料與方法

        1.1 試驗(yàn)材料

        (1)菌種:桑黃菌株S?1來源于遼寧省微生物科學(xué)研究院。

        (2)主要儀器:723N 可見分光光度計(jì)(上海儀電分析儀器有限公司);SpH?2102 立式雙層大容量恒溫培養(yǎng)搖床(上海世平實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司);HFsafe?1200 生物安全柜(上海力申科學(xué)儀器有限公司);CKX41SF 電 子 顯 微 鏡(OLYMPUS CORPORA‐TION);BCD?649 WADV冰箱(青島海爾股份有限公司);LDZX?75KBS 立式高壓蒸汽滅菌器(上海申安醫(yī)療器械廠);DHG?9 240 A 電熱鼓風(fēng)干燥箱(上海一恒科學(xué)儀器有限公司);KQ?50B 超聲清洗機(jī)(昆山舒美超聲儀器有限公司);GL?21M 高速冷凍離心機(jī)(長沙湘儀離心機(jī)儀器有限公司)。

        (3)培養(yǎng)基:PDA 改良培養(yǎng)基為馬鈴薯20%,蔗糖 2%,牛肉膏 0.8%,MgSO40.15%,KH2PO40.3%,VB110 mg/L,玉米粉0.25%,豆粉0.25%。

        (4)主要試劑

        葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液:稱取105 ℃干燥至恒重的無水葡萄糖10.0 mg,用蒸餾水溶解,定容至100 mL,配置成0.1 mg/mL的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液。

        苯酚溶液:稱取3.0 g、4.0 g、5.0 g、6.0 g、7.0 g 重蒸苯酚置于棕色容量瓶中,分別用蒸餾水定容至100 mL,配制成質(zhì)量濃度分別為3%,4%,5%,6%,7%的苯酚溶液,置于棕色試劑瓶中,備用。

        蒽酮?硫酸試劑:精密稱取0.100 0 g 蒽酮,置棕色容量瓶中,用80%濃硫酸溶解并定容至100 mL,現(xiàn)用現(xiàn)配。

        1.2 試驗(yàn)方法

        1.2.1 桑黃胞外多糖溶液的制備

        從PDA 斜面挑取4 塊新鮮的S?1 桑黃菌株菌絲塊(單塊約0.5 cm2)接入裝有 100 mL 的 PDA 改良培養(yǎng)基的三角瓶中(250 mL),于28 ℃、150 r/min 條件下?lián)u床振蕩避光培養(yǎng)7 d;培養(yǎng)結(jié)束后,用三層紗布過濾發(fā)酵液,收集濾液,于10 ℃、14 400×g條件下離心20 min,收集上清液,然后吸取0.5 mL的上清液于250 mL 容量瓶中,用蒸餾水稀釋至刻度(即為桑黃胞外多糖供試樣品液),備用。

        1.2.2 不同測(cè)定方法比較

        苯酚?硫酸法:準(zhǔn)確吸取0.1 mg/mL 的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液0 mL、0.4 mL、0.8 mL、1.2 mL、1.6 mL、2.0 mL于25 mL 比色管中,分別用蒸餾水將其補(bǔ)足至2.0 mL;加入1.0 mL 5%苯酚溶液,混勻,迅速加入5 mL 98%濃硫酸,混勻,40 ℃水浴15 min 后迅速冷卻,于波長490 nm處測(cè)定吸光度值(A),獲得葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線方程式為:y=16.844x?0.077(R2=0.9881);同步吸取2 mL 的桑黃菌株胞外多糖供試樣品液置于25 mL比色管中,測(cè)定供試樣品液的吸光度值,依據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線方程式計(jì)算胞外多糖的質(zhì)量濃度。每組測(cè)定3次,取平均值。

        蒽酮?硫酸法:準(zhǔn)確吸取0.1 mg/mL 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液 0 mL、0.2 mL、0.4 mL、0.6 mL、0.8 mL、1.0 mL、1.2 mL 置于25 mL 比色管中,分別補(bǔ)蒸餾水至2.0 mL,迅速加入蒽酮?硫酸試劑6.0 mL,沸水浴15 min 后迅速冷卻,于波長620 nm 處測(cè)定吸光度值(A),獲得葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線方程式為:y=0.008x?0.001(R2=0.987);同步吸取2 mL 的桑黃菌株胞外多糖供試樣品液置于25 mL 比色管中,測(cè)定供試樣品液的吸光度值,依據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線方程式計(jì)算胞外多糖的質(zhì)量濃度。每組測(cè)定3次,取平均值。

        加標(biāo)回收率測(cè)定:吸取1.0 mL 桑黃胞外多糖供試樣品液3 份,分別加入0.1 mg/mL 的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液0.2 mL、0.4 mL、0.6 mL,分別用苯酚?硫酸法、蒽酮?硫酸法測(cè)定多糖含量,計(jì)算加標(biāo)回收率并比對(duì)。

        1.2.3 苯酚?硫酸法測(cè)定條件優(yōu)化

        1.2.3.1 濃硫酸用量的優(yōu)化

        移取5 份胞外多糖供試樣品液2.0 mL 于25 mL比色管中,加入1 mL 5%苯酚溶液,混勻后迅速加入1.0 mL、3.0 mL、5.0 mL、7.0 mL、9.0 mL 的濃硫酸,搖勻,40 ℃水浴顯色15 min,取出后迅速冷卻至室溫,于波長490 nm處測(cè)定吸光度值。

        1.2.3.2 苯酚溶液質(zhì)量濃度的優(yōu)化

        移取5 份胞外多糖供試樣品液2.0 mL 于25 mL比色管中,分別加入1 mL 質(zhì)量濃度為3%、4%、5%、6%、7%的苯酚溶液,混勻后分別迅速加入(優(yōu)化用量)濃硫酸,搖勻后于40 ℃水浴顯色15 min,取出后迅速冷卻至室溫,于波長490 nm處測(cè)定吸光度值。

        1.2.3.3 苯酚溶液用量的優(yōu)化

        采用優(yōu)化的濃硫酸用量及苯酚質(zhì)量濃度。移取5 份胞外多糖供試液2.0 mL 于25 mL 比色管中,分別加入 0.2 mL、0.6 mL、1.0 mL、1.4 mL、1.8 mL 苯酚溶液,混勻后分別于冰水浴中迅速加入濃硫酸,搖勻,40 ℃水浴顯色15 min,取出后迅速冷卻至室溫,于波長490 nm處測(cè)定吸光度值。

        1.2.3.4 水浴顯色時(shí)間的優(yōu)化

        在上述優(yōu)化條件下,移取6 份胞外多糖供試樣品液2.0 mL于25 mL比色管中,按照1.2.3.1方法,依次加入苯酚、濃硫酸,搖勻,在優(yōu)化的水浴溫度條件下分別顯色 5 min、10 min、15 min、25 min、30 min、35 min,取出后迅速冷卻至室溫,于波長490 nm 處測(cè)定吸光度值。

        1.2.3.5 顯色溫度的優(yōu)化

        移取5 份胞外多糖供試樣品液2.0 mL 于25 mL比色管中,在優(yōu)化的顯色劑用量及質(zhì)量濃度條件下,按照1.2.3.1 方法,依次加入苯酚、濃硫酸,搖勻后分別在 20 ℃、40 ℃、60 ℃、80 ℃、100 ℃水浴條件下顯色15 min,取出后迅速冷卻至室溫,于波長490 nm處測(cè)定吸光度值。

        1.2.4 方法準(zhǔn)確度及精密度

        1.2.4.1 線性關(guān)系考察

        準(zhǔn)確吸取0.1 mg/mL 的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液0 mL、0.4 mL、0.8 mL、1.2 mL、1.6 mL、2.0 mL,于 25 mL 比色管中,用蒸餾水補(bǔ)足至2.0 mL;然后在優(yōu)化的測(cè)定條件下,按照1.2.2 中的苯酚?硫酸法測(cè)定不同質(zhì)量濃度葡萄糖溶液的吸光度值,以葡萄糖質(zhì)量濃度(mg/mL)為橫坐標(biāo),吸光度為縱坐標(biāo)制備標(biāo)準(zhǔn)曲線,考察優(yōu)化條件下測(cè)定方法的準(zhǔn)確度。

        1.2.4.2 穩(wěn)定性試驗(yàn)

        在優(yōu)化的測(cè)定條件下,移取2.0 mL 胞外多糖供試樣品液,依次加入苯酚溶液、濃硫酸,顯色、冷卻后分別放置 5 min、10 min、15 min、30 min、60 min、90 min,于波長490 nm 處測(cè)定吸光度值,考察吸光度值變化情況。

        1.2.4.3 精密度試驗(yàn)

        精密移取5 份2.0 mL 的胞外多糖供試樣品液,按1.2.4.1 檢測(cè)方法平行測(cè)定其吸光度值,并計(jì)算相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差。

        1.2.4.4 加標(biāo)回收率試驗(yàn)

        移取4 份1.0 mL 胞外多糖供試樣品液于25 mL比色管中,取其中的3 份,分別加入0.1 mg/mL 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液 0.6 mL、0.8 mL、1.0 mL,然后分別用蒸餾水補(bǔ)足2 mL,按1.2.4.1 測(cè)定方法平行測(cè)定其吸光度值,計(jì)算加標(biāo)回收率。

        1.3 數(shù)據(jù)處理

        試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用Excel軟件進(jìn)行處理及繪圖。

        2 結(jié)果與分析

        2.1 不同測(cè)定方法多糖含量的測(cè)定結(jié)果

        苯酚?硫酸法及蒽酮?硫酸法均可用于測(cè)定桑黃菌株胞外多糖含量。但相比于苯酚?硫酸法[胞外多糖測(cè)定值為(22.877±0.982)mg/mL],蒽酮?硫酸法測(cè)定的桑黃胞外多糖含量的結(jié)果值偏高,為(34.25±0.5)mg/mL。由表1 可知,蒽酮?硫酸法平均加樣回收率為114.38%,RSD 為6.21%,表明加樣回收率較差,而苯酚?硫酸法的平均加樣回收率為95.42%,RSD 為2.33%,為良好范圍值。由此可見,苯酚?硫酸法測(cè)定桑黃胞內(nèi)外多糖含量比較好。

        表1 兩種多糖測(cè)定方法測(cè)算結(jié)果比較

        2.2 苯酚-硫酸法測(cè)定條件優(yōu)化

        2.2.1 濃硫酸用量的確定

        由圖1 可知,溶液吸光度值隨著濃硫酸用量的增加呈現(xiàn)出先增高后降低的趨勢(shì)。當(dāng)濃硫酸用量低于7.0 mL 內(nèi),吸光度值上升幅度較大,當(dāng)濃硫酸用量為7.0 mL 時(shí),吸光度值最高(0.908),然后隨著濃硫酸用量的增加,吸光度值小幅度下降,這主要是由于過量的濃硫酸導(dǎo)致多糖成分的碳化所致。因此,濃硫酸最適用量為7.0 mL。

        圖1 不同濃硫酸用量測(cè)得的吸光度值

        2.2.2 苯酚溶液質(zhì)量濃度的確定

        由圖2可知,在優(yōu)化的濃硫酸用量條件下,隨著苯酚溶液的質(zhì)量濃度上升,供試樣品液的吸光度值緩慢上升,當(dāng)苯酚溶液質(zhì)量濃度為5%時(shí),供試樣品液的吸光度值達(dá)峰值(0.979);然后隨著苯酚溶液質(zhì)量濃度的上升,吸光度值略有下降,但下降幅度較小??梢?,苯酚溶液的質(zhì)量濃度對(duì)吸光度值影響幅度較小,苯酚溶液最適質(zhì)量濃度為5%。

        圖2 不同苯酚溶液質(zhì)量濃度測(cè)得的吸光度值

        2.2.3 苯酚溶液用量的確定

        由圖3 可知,在優(yōu)化的濃硫酸用量及苯酚溶液質(zhì)量濃度條件下,苯酚溶液的用量對(duì)吸光度值具有顯著影響,吸光度值變化較大。其中,在苯酚溶液用量低于1.0 mL時(shí),吸光度值呈現(xiàn)快速上升的趨勢(shì),當(dāng)苯酚溶液用量為1.0 mL 時(shí),吸光度值最高(0.985),然后隨著苯酚溶液用量的上升,吸光度值呈顯著的下降趨勢(shì)。故苯酚溶液最適用量為1.0 mL。

        圖3 不同苯酚溶液用量測(cè)得的吸光度值

        2.2.4 顯色時(shí)間的確定

        由圖4可知,在上述優(yōu)化條件下,隨著顯色時(shí)間的上升,吸光度值逐漸上升,當(dāng)顯色時(shí)間為15 min時(shí),吸光度值最高(0.913),然后隨著顯色時(shí)間的延長,吸光度值呈現(xiàn)小幅度的下降趨勢(shì)。因此,最適顯色時(shí)間為15 min。

        圖4 不同顯色時(shí)間測(cè)得的吸光度值

        2.2.5 水浴顯色溫度的確定

        由圖5 可知,在優(yōu)化的顯色試劑用量及濃度條件下,水浴溫度對(duì)吸光度值影響較小,呈現(xiàn)小幅度的先上升后下降趨勢(shì),當(dāng)水浴溫度為60 ℃時(shí),吸光度值最高(0.944)。因此,最適顯色溫度為60 ℃。

        圖5 不同水浴顯色溫度測(cè)得的吸光度值

        2.3 優(yōu)化測(cè)定條件后的苯酚-硫酸法考察

        2.3.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

        優(yōu)化測(cè)定條件下,以葡萄糖質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo),吸光度值A(chǔ)為縱坐標(biāo),繪制葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線。由圖6 可知,葡萄糖質(zhì)量濃度在0~100μg/mL,其與吸光度值具有良好的線性關(guān)系,所獲得的線性回歸方程為y=15.319x-0.008 8,其R2=0.999 3;表明優(yōu)化后的苯酚?硫酸法具有良好的準(zhǔn)確性。

        圖6 優(yōu)化后葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線方程

        2.3.2 穩(wěn)定性試驗(yàn)

        取相同供試樣品液5 份,在相同條件下測(cè)定吸光度值,結(jié)果如表2。由表2 可知,隨著顯色時(shí)間的延長,供試樣品液的吸光度值呈小幅度的先上升后下降趨勢(shì),90 min 內(nèi)的吸光度值在0.966~0.976,平均值為0.972,RSD 為0.32%,表明優(yōu)化后的苯酚?硫酸測(cè)定方法穩(wěn)定性良好。

        表2 穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果

        2.3.3 精密度試驗(yàn)

        由表3 可知,同一供試樣品溶液,在相同條件下,重復(fù)測(cè)定吸光度值5 次,所測(cè)得的吸光度平均值為0.963,相對(duì)平均偏差RSD 為1.80%??梢?,所獲方法重現(xiàn)性良好。

        表3 精密度試驗(yàn)結(jié)果

        2.3.4 加樣回收率

        由表4 可知,在試驗(yàn)范圍內(nèi),采用優(yōu)化后的苯酚?硫酸法的加樣回收率在101.05%~104.88%,平均回收率為103.24%,相對(duì)平均偏差 RSD 為1.91%。可見,優(yōu)化后的苯酚?硫酸法測(cè)定結(jié)果穩(wěn)定、良好。

        表4 加樣回收率結(jié)果

        3 小結(jié)

        以桑黃菌株S?1 胞外多糖為試驗(yàn)材料,兩種方法測(cè)定多糖含量測(cè)定結(jié)果表明,苯酚?硫酸法及蒽酮?硫酸法均可直接測(cè)定桑黃菌株胞外多糖的含量,但相比之下,蒽酮?硫酸法測(cè)定胞外多糖的含量值均偏高,苯酚?硫酸法測(cè)定的結(jié)果值更為可信,且苯酚?硫酸法的加標(biāo)回收率(95.42%,RSD=2.33%)較蒽酮?硫酸法(114.38%,RSD=6.21%)表現(xiàn)更好,是測(cè)量桑黃胞內(nèi)外多糖的更優(yōu)選擇。

        苯酚?硫酸法測(cè)定多糖含量的原理是在濃硫酸水合產(chǎn)生的高溫條件下將多糖水解成單糖,而苯酚與單糖迅速脫水生成的糖衍生物發(fā)生反應(yīng),生成橙黃色化合物,再以紫外可見光分光光度計(jì)法測(cè)定[11],方法中濃硫酸、苯酚質(zhì)量濃度、苯酚溶液的用量、顯色時(shí)間、水浴溫度對(duì)吸光度值具有一定的影響。單因素優(yōu)化結(jié)果表明:試驗(yàn)范圍內(nèi),各因素對(duì)吸光度值的影響均呈先上升后降低的變化趨勢(shì),最優(yōu)的試驗(yàn)條件:在2.0 mL 待測(cè)樣品液中,加入5%苯酚溶液1 mL,緩慢加入濃硫酸7 mL,于60 ℃水浴條件下顯色15 min;優(yōu)化后的苯酚?硫酸法,0~100 μg/mL 葡萄糖質(zhì)量濃度與吸光度值具有良好的線性關(guān)系,穩(wěn)定性、精密度試驗(yàn)的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)分別為0.32%、1.80%;平均加標(biāo)回收率為103.24%,相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD=1.91%。可見,優(yōu)化的苯酚?硫酸法具有良好的準(zhǔn)確度、穩(wěn)定性、重現(xiàn)性,可作為桑黃菌株發(fā)酵液胞外多糖的測(cè)定方法。

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