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        超聲波協(xié)同半仿生法提取靈芝三萜工藝優(yōu)化

        2022-11-28 11:51:06馬婧嘉李雅茹張文雋屈文英吳亞召
        食用菌 2022年6期
        關(guān)鍵詞:三萜類三萜靈芝

        馬婧嘉 李雅茹 張文雋 郝 哲 屈文英 吳亞召 雷 萍*

        (1陜西省微生物研究所,陜西西安 710043;2榆林市農(nóng)墾服務中心,陜西榆林 719000;3洛川縣農(nóng)業(yè)機械技術(shù)服務中心,陜西延安 727400)

        靈芝Ganoderma lucidum,又名神芝、萬年蕈,現(xiàn)指隸屬于真菌界、擔子菌門、傘菌綱、多孔菌目、靈芝科的一類傳統(tǒng)藥用真菌的統(tǒng)稱[1]?,F(xiàn)有研究表明靈芝三萜在抗腫瘤[2]、肝臟保護[3]、免疫促進[4]等方面都發(fā)揮著顯著作用,在食品和醫(yī)藥領(lǐng)域有廣泛的應用。

        目前,靈芝三萜的提取方法有超臨界CO2提取、亞臨界水提取、超聲輔助提取、溶劑浸提、微波輔助提取法等[5],這些傳統(tǒng)提取法存在提取效率低、時間長、耗能高等缺點。半仿生提取法(semi?bionicex‐traction,SBE)是以控制論“灰思維方式”為基礎(chǔ)的提取技術(shù),可以提高藥物生物利用度,從生物藥劑學角度建立的一種新型提取技術(shù)[6?7]。超聲波輔助提取法廣泛應用于提取天然成分,其原理是利用超聲波產(chǎn)生的空化、振動、粉碎、攪拌等綜合效應,提高提取的效率[8]。目前,未見采用超聲波協(xié)同半仿生法從靈芝中提取三萜類化合物的研究報道。因此,筆者以靈芝為原料,采取超聲波協(xié)同半仿生法結(jié)合單因素與正交試驗,探究三萜類化合物提取工藝,以期為靈芝三萜的提取提供一種新的思路與方法。

        1 材料與方法

        1.1 材料與試劑

        靈芝:靈芝?LG,由陜西省微生物研究所提供;熊果酸,河南標準物質(zhì)研發(fā)中心;鹽酸、無水乙醇、冰醋酸、氫氧化鈉、香草醛、高氯酸、乙酸乙酯,天津市天力化學試劑有限公司(均為分析純)。

        1.2 儀器與設(shè)備

        酸度計:賽多利斯科學儀器(北京)有限公司;TU?1901 雙光束紫外可見分光光度計,北京普析通用儀器有限責任公司;JP?120ST 超聲波清洗儀,深圳市結(jié)盟設(shè)備有限公司;TD5離心機,上海盧湘儀離心機儀器有限公司。

        1.3 試驗方法

        1.3.1 靈芝粉的制備

        新鮮靈芝子實體→洗凈曬干→60 ℃烘箱干燥(至恒重)→粉碎→過40目篩→靈芝粉。

        1.3.2 超聲波協(xié)同半仿生法提取靈芝三萜

        準確稱取按照1.3.1 制備靈芝粉樣品1 g,采用超聲波協(xié)同半仿生法,固定料液比、乙醇質(zhì)量分數(shù)、超聲時間、提取溫度4 個因素,在模擬人體胃、腸道環(huán)境pH 值為1、4、7.5、8.3的溶液中依次分別提取靈芝三萜,在 4 000 r/min 條件下離心 10 min,合并 3 次上清液,定容至100 mL,作為待用供試品溶液。

        1.3.3 靈芝三萜的測定

        采用香草醛?高氯酸比色法測定靈芝三萜[9]。

        1.3.4 靈芝三萜提取率的計算

        靈芝三萜提取率計算:靈芝三萜提取率(質(zhì)量比)=C×V/m%

        式中:C(mg/mL)表示提取液中靈芝三萜的質(zhì)量濃度;V(mL)表示提取液定容體積;m(mg)表示所用靈芝干粉質(zhì)量。

        1.3.5 單因素試驗設(shè)計

        精確稱取1 g靈芝粉5份,按1.3.2的方法進行超聲波協(xié)同半仿生法提取靈芝三萜,分別設(shè)固定條件乙醇質(zhì)量分數(shù)75%,料(g)液(mL)比為1∶25、提取溫度60 ℃,超聲時間20 min,分別設(shè)定5水平:料(g)液(mL)比為1∶15、1∶20、1∶25、1∶30、1∶35;乙醇質(zhì)量分數(shù)為75%、80%、85%、90%、95%;提取溫度40 ℃、50 ℃、60 ℃、70 ℃、80 ℃;超聲時間 10 min、20 min、30 min、40 min、50 min,考察不同因素對靈芝三萜的提取率影響。

        1.3.6 正交試驗

        以上述單因素試驗為基礎(chǔ),選取表1 中4 因素3水平,采取L9(34)正交試驗對靈芝三萜的提取工藝參數(shù)進行優(yōu)化。

        李林,任校長19年來,他把“引導學生走向幸?!弊鳛閷W校的辦學宗旨,積極探索教育規(guī)律,努力實施“以德立校,依法治校,科研興校,文化強校”的辦學策略,著力培養(yǎng)學生適應終身發(fā)展和社會發(fā)展需要的必備品格和關(guān)鍵能力。

        表1 正交試驗因素水平

        1.4 數(shù)據(jù)處理

        用Office 軟件處理數(shù)據(jù),運用GraphPad Prism 7.00作圖。

        2 結(jié)果與分析

        2.1 單因素試驗結(jié)果

        2.1.1 料液比對靈芝三萜提取率的影響

        由圖1可知,隨著料液比上升,靈芝三萜的提取率逐步提高,料液比為1∶30,靈芝三萜的提取率最高(2.71%)??赡芗哟笕軇┑牧亢螅黾恿斯滔嗪鸵合嘀g三萜的含量差,加快三萜的溶出速率,從而提取率上升,當料液比達1∶30已充分溶出靈芝三萜,故料液比1∶30提取率最高。

        圖1 不同料液比下靈芝三萜提取率

        2.1.2 乙醇質(zhì)量分數(shù)對靈芝三萜提取率的影響

        由圖2 可知,乙醇質(zhì)量分數(shù)為70%、80%、85%時,隨著乙醇質(zhì)量分數(shù)上升,靈芝三萜提取率逐漸升高,乙醇質(zhì)量分數(shù)為85%時三萜提取率最高(2.85%),再繼續(xù)提高乙醇質(zhì)量分數(shù),三萜的提取率反而降低。原因可能是過高的乙醇質(zhì)量分數(shù),導致其他醇溶性物質(zhì)析出量增加,影響三萜類物質(zhì)的溶出,因而三萜提取率不升反降。

        圖2 不同乙醇質(zhì)量分數(shù)下靈芝三萜提取率

        2.1.3 提取溫度對靈芝三萜提取率的影響

        由圖3 可知,靈芝三萜提取率隨著提取溫度的升高逐漸上升,在提取溫度60 ℃時靈芝三萜提取率最高(2.78%),再繼續(xù)升高溫度,提取率反而降低??赡苓^高提取溫度使三萜發(fā)生了分解,破壞了三萜結(jié)構(gòu)[10],導致提取率降低。

        圖3 不同提取溫度下靈芝三萜提取率

        提取靈芝三萜需要一定的時間溶出有效成分并達到傳質(zhì)平衡。由圖4可知,超聲時間的延長,溶出的三萜增多,超聲時間30 min,三萜的提取率最高(2.82%),隨后三萜的提取率開始降低。這可能是因為溶出的無效成分和雜質(zhì)增多,影響三萜類物質(zhì)的溶出,因此超聲時間30 min 為靈芝三萜類物質(zhì)提取的最佳時長。

        圖4 不同超聲時間下靈芝三萜提取率

        2.2 超聲波協(xié)同半仿生法提取靈芝三萜的工藝正交優(yōu)化結(jié)果

        正交試驗結(jié)果見表2,方差分析結(jié)果見表3。

        表2 正交試驗結(jié)果

        表3 方差分析

        由表2 和表3 可知,4 個試驗因素對靈芝三萜的提取率均有不同程度的影響,其影響的主次順序為:B(乙醇質(zhì)量分數(shù))>D(提取時間)>A(料液比)>C(超聲溫度)。乙醇質(zhì)量分數(shù)對提取率的影響極為顯著,提取時間對提取率影響顯著,其余兩個因素不顯著。從R值得出的最佳工藝參數(shù)為A2B2C2D2,所對應的條件:料(g)液(mL)比為1∶30,乙醇質(zhì)量分數(shù)為85%,提取溫度60 ℃,超聲時間30 min。與表2中的較優(yōu)組合A2B2C3D1不一致。因此需要進一步驗證試驗(重復3次后取其平均值),結(jié)果見表4。

        由表4 可知,超聲波協(xié)同半仿生法提取靈芝三萜的最佳工藝參數(shù)為A2B2C2D2,經(jīng)過3 次驗證試驗,靈芝三萜的平均提取率為2.99%,高于正交試驗中的較優(yōu)組合。

        表4 正交試驗驗證結(jié)果

        3 結(jié)論

        試驗首次采取超聲波協(xié)同半仿生法提取靈芝三萜,考察了不同料液比、乙醇質(zhì)量分數(shù)、超聲時間、提取溫度條件下靈芝三萜的提取率。單因素試驗及正交試驗結(jié)果表明,提取靈芝三萜的最佳工藝條件為料(g)液(mL)1∶30,乙醇質(zhì)量分數(shù)85%,提取溫度60 ℃,超聲時間30 min。經(jīng)過三次平行重復試驗,靈芝三萜的提取率為2.99%,試驗為靈芝三萜的提取提供了新的提取方法。

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