劉 芳 袁宗勝 陳國平 袁 濱 柯麗娜 謝寶貴*

（1 福建農(nóng)林大學生命科學學院，福建福州 350002；2 閩江學院地理與海洋學院，福建福州 350108；3漳州市農(nóng)業(yè)農(nóng)村局經(jīng)濟作物站，福建漳州 363099；4 漳州市農(nóng)業(yè)科學研究所，福建漳州，363005）

秀珍菇屬真菌門Eumycota，擔子菌綱Basidio‐mycete，傘菌目 Agarical，側(cè)耳科 Pleurotaceae，側(cè)耳屬Pleurotus[1]，因其外形悅目、味道鮮美、營養(yǎng)豐富、口感清脆而得名。近年來除了傳統(tǒng)季節(jié)性栽培秀珍菇外，工廠化栽培規(guī)模也逐步擴大[2]。長期以來，栽培秀珍菇采用固體菌種，但固體菌種存在培養(yǎng)周期長、菌齡不一致、污染率高等問題，大大制約了秀珍菇的產(chǎn)業(yè)化發(fā)展[3]。將液體菌種技術(shù)應(yīng)用于秀珍菇的栽培，則可以在短期內(nèi)獲得大量菌絲體，且發(fā)酵液特性穩(wěn)定，生產(chǎn)能力大，有利于秀珍菇的規(guī)?；a(chǎn)[4]?，F(xiàn)就秀珍菇液體菌種標準化生產(chǎn)技術(shù)簡要介紹如下。

1 通用要求

1.1 生產(chǎn)廠房設(shè)計要求

須達到NY/T 528 標準要求，菌種發(fā)酵車間需按照GB 50073潔凈廠房設(shè)計規(guī)范執(zhí)行。

1.2 生產(chǎn)設(shè)備與設(shè)施

（1）應(yīng)設(shè)置配料間、滅菌間、接種室等基本設(shè)施，需有調(diào)溫通風設(shè)施。檢測室和菌種室要有相應(yīng)的實驗檢測儀器、設(shè)備和制種用的滅菌設(shè)施和常規(guī)用具。

（2）應(yīng)配備發(fā)酵罐、滅菌鍋、烘干箱、超凈工作臺、恒溫培養(yǎng)箱、空氣壓縮機、空氣過濾器等基本生產(chǎn)設(shè)備。

1.3 培養(yǎng)原料

化學試劑類符合NY/T 528 食用菌菌種生產(chǎn)技術(shù)規(guī)程要求。生物制劑和天然材料類除符合NY/T 528 食用菌菌種生產(chǎn)技術(shù)規(guī)程要求外，水不溶性固體物料要過80目（180μm±7.6μm）篩網(wǎng)。

1.4 品種

選用高產(chǎn)、優(yōu)質(zhì)、抗逆性強、商品性好的秀珍菇品種，從具相應(yīng)資質(zhì)的供種單位引種或本單位選育，并能追溯菌種來源。

2 液體菌種生產(chǎn)工藝要求

2.1 容器

2.1.1 母種容器、搖瓶

母種容器應(yīng)使用玻璃試管和透氣隔菌的硅膠塞（或棉塞），搖瓶應(yīng)使用耐高溫的玻璃錐形瓶和透氣隔菌的硅膠塞（或棉塞），棉塞外可用紗布包裹。

2.1.2 液體菌種發(fā)酵罐

發(fā)酵罐使用前需檢查罐上全部閥門、壓力表、軟管等，確保完好無損。罐體內(nèi)、外和全部閥門、軟管用流水清洗，做到無死角、內(nèi)壁無任何培養(yǎng)料殘余物、無菌絲殘留。菌種罐初次使用、出現(xiàn)染菌、長期放置、更換品種時，都要求進行空消滅菌。用外源蒸汽滅菌的發(fā)酵罐，蒸汽壓力應(yīng)達0.105~0.125 MPa，溫度121~124 ℃，70 min。

2.2 液體菌種培養(yǎng)基

白糖16 kg，硫酸鎂800 g，磷酸二氫鉀800 g，豆粉 3 kg，泡敵100 mL，水1 000 L，pH 6.0~6.5[5]。

2.3 定容與滅菌

關(guān)閉進氣閥和接種閥，將漏斗插入進料口，將料液分批分次倒入或用水泵抽入處理好的培養(yǎng)器內(nèi)?？傃b料量為罐體總?cè)莘e的70%~80%，擰緊上料口蓋。微開排氣閥門，其余所有閥門均關(guān)閉，加熱滅菌。啟動加熱器加熱，當溫度升至105 ℃時，關(guān)閉排氣閥門使罐內(nèi)蒸汽壓力達0.12 MPa 維持60 min以上[6]，結(jié)束滅菌自然降壓。

圖1 液體菌種發(fā)酵液

圖2 液體菌種發(fā)酵培養(yǎng)4~5 d時視鏡觀察

2.4 冷卻與接種

滅菌完畢后，應(yīng)自然降壓（不能強制降壓），液體菌種罐在通氣狀態(tài)下采用夾套循環(huán)水冷卻至30 ℃以下。取液體菌種發(fā)酵罐培養(yǎng)基無菌操作接于營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中，于28 ℃恒溫培養(yǎng)48 h 后，觀察培養(yǎng)物生長情況，并經(jīng)顯微鏡鏡檢確定無污染為滅菌合格。

菌種罐接種，專用菌種需要提前準備好，菌種的搖瓶口和發(fā)酵罐進料口須用75%酒精消毒，在火焰保護下接種。火圈放在進料口的上方點燃，打開進料口蓋，將經(jīng)檢測無污染的液體母種迅速投入罐后（接種量為相應(yīng)菌種罐所裝培養(yǎng)液體積的0.5%~1.0%），立即蓋好進料口。接種完成移走火圈后及時做好標記。

2.5 液體菌種培養(yǎng)

液體菌種罐通氣培養(yǎng)，空氣流量調(diào)至（1.2~1.5）m3/h 以上，罐壓控制為 0.02~0.04 MPa[6]，培養(yǎng)溫度為21~23 ℃。在上述條件下培養(yǎng)4~5 d 可達放罐指標。

2.6 取樣與檢測

在液體菌種發(fā)酵培養(yǎng)過程中，應(yīng)定期取樣，留樣觀察測定pH、菌絲濕重，并進行顯微鏡鏡檢。pH的測定采用酸度計法；菌絲濕重的測定采用直徑15 cm 的定量濾紙，將100 mL液體菌液，過濾至無水滴滴下，稱重后減去濾紙濕重；無雜菌檢查，采用顯微鏡觀察菌種發(fā)酵液中是否有異常菌絲或孢子；并應(yīng)同時在檢測霉菌和細菌的瓊脂平板上劃線或涂布培養(yǎng)，分別于28 ℃和35 ℃恒溫培養(yǎng)48 h，每天觀察平板菌落生長狀況，若無異常菌落（霉菌和細菌菌落生長），則表明該樣品無污染；或結(jié)合搖瓶培養(yǎng)檢測，48 h 內(nèi)觀察培養(yǎng)液無變色，無渾濁或無大量起泡則表明該批液體菌種無細菌污染。

2.7 放罐

液體菌種達到放罐指標并經(jīng)鏡檢等檢驗合格后即可放罐。

2.7.1 感官指標

感官指標應(yīng)符合表1的要求。

表1 液體菌種感官狀態(tài)

2.7.2 理化指標

理化指標應(yīng)符合表2的要求。

表2 液體菌種理化指標和鏡檢狀態(tài)

2.8 污染罐的處理

發(fā)現(xiàn)污染的液體菌種罐應(yīng)立即關(guān)閉排氣閥，避免污染菌在發(fā)酵室內(nèi)繁殖擴散，罐內(nèi)的液體菌種通過排廢管道直接排入下水道或污水處理系統(tǒng)，并及時清洗、消毒發(fā)酵罐。同時加強對發(fā)酵室的消毒[7]。

圖3 液體菌種的顯微觀察

圖4 液體菌種發(fā)酵培養(yǎng)4~5 d顯微觀察菌絲狀態(tài)

3 液體菌種接種要求

接種環(huán)境應(yīng)達到GB 50073潔凈廠房設(shè)計規(guī)范相關(guān)標準。將待接種的栽培料袋（瓶）放置在接種輸送帶，無菌的膠管和接種槍接上菌種罐后要先放掉一些液體菌種，沖洗膠管及接種槍，降低污染率[7]。然后用接種槍將液體菌種注入栽培料袋（瓶），接種量為35 mL/袋（瓶），接種動作應(yīng)迅速、準確。

4 生產(chǎn)記錄及人員要求

液體菌種發(fā)酵生產(chǎn)的各個環(huán)節(jié)應(yīng)有翔實的生產(chǎn)記錄，由具體操作人員現(xiàn)場記錄填寫并歸檔保存。

應(yīng)配備液體菌種生產(chǎn)所需的專業(yè)技術(shù)人員。從事液體菌種生產(chǎn)的各工序操作人員，必須按照相關(guān)規(guī)定要求進行專業(yè)培訓合格后，方可從事液體菌種的生產(chǎn)。