張慧敏 安芳芳 吳宇圳 鄭永標(biāo)

（福建師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，福建福州 350117）

樺褐孔菌Inonotus obliquus，是一種生長(zhǎng)于白樺樹(shù)上的藥用真菌[1]，主要生長(zhǎng)在北半球北緯40°~50°的地區(qū)，分布于俄羅斯西伯利亞、俄羅斯遠(yuǎn)東地區(qū)、北歐、日本北海道、朝鮮、中國(guó)黑龍江、中國(guó)長(zhǎng)白山等地。早在16世紀(jì)，北歐、東歐等國(guó)家已用樺褐孔菌治療癌癥、糖尿病[1]等疾病，俄羅斯將樺褐孔菌稱為“西伯利亞靈芝”。近年來(lái)，韓國(guó)、美國(guó)等國(guó)家將樺褐孔菌提取物加入沐浴露、精華乳、補(bǔ)水面膜、洗發(fā)液、抗皺眼霜等各種美妝產(chǎn)品中，作為抗氧化劑廣泛使用。我國(guó)對(duì)樺褐孔菌的開(kāi)發(fā)利用處于起步階段，市場(chǎng)上的產(chǎn)品大多數(shù)為用于泡水的菌塊，由子實(shí)體制成的壓片糖果或是代用茶等，少數(shù)為美妝產(chǎn)品，如“稀物集”松茸蘑菇系列、“皙島”白樺茸酵母水等。目前，樺褐孔菌的相關(guān)產(chǎn)品存在主要功效成分不明確，化學(xué)質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)有待進(jìn)一步確定等問(wèn)題。近年來(lái)研究表明，樺褐孔菌含有豐富的多酚類物質(zhì)，具有抗氧化[2]、抗腫瘤[3]、抑菌[4]等作用。此外，樺褐孔菌野生資源有限，且人工栽培子實(shí)體較為困難。因此，近年來(lái)學(xué)者常用樺褐孔菌液體深層培養(yǎng)菌絲體及代謝產(chǎn)物來(lái)替代野生樺褐孔菌子實(shí)體開(kāi)發(fā)相關(guān)產(chǎn)品。筆者總結(jié)樺褐孔菌中多酚類物質(zhì)的化學(xué)結(jié)構(gòu)、生物活性、提取工藝及采用液體發(fā)酵技術(shù)提高樺褐孔菌多酚類物質(zhì)相關(guān)研究，以期為樺褐孔菌的開(kāi)發(fā)與利用提供參考。

1 樺褐孔菌多酚類物質(zhì)的結(jié)構(gòu)鑒定

近年來(lái)，學(xué)者發(fā)現(xiàn)樺褐孔菌中含有化學(xué)結(jié)構(gòu)多樣的多酚類物質(zhì)，2007—2021年[5?9]，共報(bào)道28種樺褐孔菌多酚類物質(zhì)（表1、圖1），其中，25種多酚類物質(zhì)（序號(hào)1—25）從子實(shí)體中分離得到，3種多酚類物質(zhì)（序號(hào)26—28）從菌核中分離得到。此外，4?羥基?3，5?二甲氧基苯甲酸2?羥基?1?羥甲基乙酯（序號(hào)1），2，5?二羥對(duì)苯甲酸（序號(hào)7），Inonoblins A、B、C（序號(hào)17—19）為樺褐孔菌中發(fā)現(xiàn)的新天然化合物。

圖1 樺褐孔菌多酚類物質(zhì)的化學(xué)結(jié)構(gòu)

表1 樺褐孔菌多酚類物質(zhì)的種類

2 樺褐孔菌多酚類物質(zhì)的生物活性

2.1 抗氧化作用

樺褐孔菌多酚類物質(zhì)具有較強(qiáng)的抗氧化能力，能通過(guò)清除羥基自由基、抑制脂肪氧合酶活性、淬滅H2O2、抑制脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)等多種途徑發(fā)揮其抗氧化作用[10]。CUI等[11]用80%乙醇提取及冷凍干燥技術(shù)在室溫下從樺褐孔菌子實(shí)體中獲得多酚類物質(zhì)提取物，質(zhì)量濃度為10~50μg/mL，該提取物對(duì)過(guò)氧化氫誘導(dǎo)的細(xì)胞損傷具有較好的保護(hù)作用，且質(zhì)量濃度為50μg/mL的多酚類物質(zhì)提取物的作用效果與0.4 mg/mL的過(guò)氧化氫酶相當(dāng)。高晗等[12]采用鄰二氮菲?Fe2+氧化法與鄰苯三酚活性測(cè)定法，發(fā)現(xiàn)0.2%的樺褐孔菌多酚類物質(zhì)對(duì)羥自由基和超氧自由基的清除率可達(dá)69.58%、82.01%。潘林等[13]在超聲?微波協(xié)同萃取法輔助下，用50%乙醇提取樺褐孔菌多酚類物質(zhì)，發(fā)現(xiàn)提取物對(duì)DPPH自由基清除率的IC50值為9.03μg/mL，對(duì)羥自由基清除率的IC50值為2.03 mg/mL。上述研究結(jié)果表明，樺褐孔菌多酚類物質(zhì)具有較好的抗氧化活性，具有進(jìn)一步研究的價(jià)值。

高愿軍等[14]用48%乙醇于75℃下浸提樺褐孔菌50 min，得到的粗提物用乙酸乙酯萃取獲得多酚類物質(zhì)，發(fā)現(xiàn)該多酚類物質(zhì)可提高昆明種小鼠血清中超氧化物歧化酶、谷胱甘肽過(guò)氧化物酶及過(guò)氧化氫酶的活性，顯著提高血清中的總抗氧化能力，并可降低小鼠血清中丙二醛（MDA）含量。而蔡建秀等[10]利用無(wú)菌級(jí)小鼠構(gòu)建對(duì)照試驗(yàn)，體外抗氧化試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，4.0 mg/mL樺褐孔菌多酚類物質(zhì)對(duì)H2O2誘導(dǎo)的小鼠紅細(xì)胞溶血抑制率為69.65%，與對(duì)照組相比，樺褐孔菌多酚類物質(zhì)可極顯著地抑制小鼠肝勻漿自發(fā)性產(chǎn)生的MDA；體內(nèi)抗氧化試驗(yàn)，注射樺褐孔菌多酚類物質(zhì)的小鼠體內(nèi)肝組織MDA的產(chǎn)生也受到顯著抑制，抑制率可達(dá)66.84%，且小鼠血清與肝勻漿中谷胱甘肽過(guò)氧化物酶活性極顯著增強(qiáng)。因此，上述動(dòng)物試驗(yàn)表明，樺褐孔菌多酚類物質(zhì)在體內(nèi)外均具有明顯的抗氧化作用。具有抗氧化活性的物質(zhì)不僅能預(yù)防衰老，還能預(yù)防許多由自由基引起的與老化相關(guān)的疾病，對(duì)相關(guān)產(chǎn)品的開(kāi)發(fā)具有借鑒作用。

2.2 抗腫瘤作用

樺褐孔菌的多酚類物質(zhì)具有明顯的細(xì)胞毒活性。YUKI等[15]用80%甲醇浸提樺褐孔菌子實(shí)體，提取分離的7種多酚類物質(zhì)（序號(hào)1—7）對(duì)4種癌細(xì)胞（A549、PA?1、HL?60和U937）均具有較強(qiáng)的細(xì)胞毒性，但對(duì)正常細(xì)胞系（IMR90）的細(xì)胞毒性較低；其中，3，4?二羥基苯甲丙酮（序號(hào)3）對(duì)正常細(xì)胞的半致死量LD50為272.8μmol/L，對(duì)癌細(xì)胞PA?1的LD50為12.2μmol/L，具有較好的成藥性。流式細(xì)胞儀分析表明，3，4?二羥基苯甲丙酮（序號(hào)3）作用于G2/M期，且能通過(guò)阻斷I?kBα激酶激活來(lái)抑制核因子kB，從而刺激腫瘤壞死因子?α誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡；進(jìn)一步構(gòu)效分析發(fā)現(xiàn)，分子尾部帶有醛或酮的3，4?二羥基苯甲丙酮（序號(hào)3）比帶有游離羧基的咖啡酸（序號(hào)2）具有更強(qiáng)的抗腫瘤活性。MIZUSHINA等[16]發(fā)現(xiàn)咖啡酸（序號(hào)2）和3，4?二羥基苯甲丙酮（序號(hào)3）能夠直接與拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅱ結(jié)合，抑制其活性（IC50值分別為15μmol/L、10μmol/L），顯著抑制人結(jié)腸癌HCT116細(xì) 胞 的 增 殖（LD50分 別 為70.0μmol/L、49.4μmol/L），并使細(xì)胞周期停止在G2/M期，且呈劑量依賴性。

以上研究結(jié)果表明，樺褐孔菌多酚類物質(zhì)具有誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡和抑制拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅱ活性等作用，具有較大的治療腫瘤潛力，但其作用機(jī)制有待進(jìn)一步研究，也需要通過(guò)動(dòng)物試驗(yàn)與臨床試驗(yàn)來(lái)進(jìn)一步評(píng)估其抗腫瘤作用。

2.3 抑菌作用

樺褐孔菌多酚類物質(zhì)有較好的抑菌作用。戴航宇等[17]用50%乙醇，在60℃，料（g）液（mL）比為1∶20的條件下浸提樺褐孔菌子實(shí)體粉末，獲得樺褐孔菌多酚類物質(zhì)對(duì)大腸桿菌、葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、單增李斯特菌、沙門氏菌均有抑制活性；當(dāng)樺褐孔菌多酚類物質(zhì)質(zhì)量濃度為10 mg/mL時(shí)，對(duì)金黃葡萄球菌抑制效果最好，抑菌圈直徑達(dá)19.5 mm，比對(duì)枯草芽孢桿菌、單增李斯特菌、大腸桿菌和沙門氏菌的抑菌圈分別高23.4%、8.9%、18.2%和40.2%，對(duì)革蘭氏陽(yáng)性菌的抑制能力優(yōu)于革蘭氏陰性菌。

3 樺褐孔菌多酚類物質(zhì)提取工藝優(yōu)化

對(duì)樺褐孔菌多酚類物質(zhì)的提取工藝優(yōu)化，有利于樺褐孔菌多酚類物質(zhì)的充分開(kāi)發(fā)利用。樺褐孔菌多酚類物質(zhì)的分子結(jié)構(gòu)中有多個(gè)酚羥基，極性較大，易溶解于醇、醚、酮類溶劑，乙醇是一種滲透性強(qiáng)、提取率高、毒性小的萃取劑[18]。樺褐孔菌多酚類物質(zhì)的常用提取溶劑為乙醇?水。高洋等[19]用70%乙醇，料（g）液（mL）比為1∶20，于80℃條件下提取樺褐孔菌多酚類物質(zhì)，含量達(dá)3.2%。張梅梅等[20]通過(guò)正交試驗(yàn)優(yōu)化樺褐孔菌多酚類物質(zhì)的提取條件，用50%乙醇，料（g）液（mL）比1∶10，提取溫度50℃，浸提時(shí)間45 min，多酚類物質(zhì)的提取率為3.1%。

為了進(jìn)一步提高多酚類物質(zhì)的提取率，研究者還采用超聲波與微波輔助技術(shù)進(jìn)一步優(yōu)化提取工藝。梁麗雅等[21]采用超聲波輔助提取樺褐孔菌多酚類物質(zhì)，通過(guò)正交試驗(yàn)優(yōu)化的最佳工藝為60%乙醇，超聲處理時(shí)間30 min，超聲功率500 W，料（g）液（mL）比1∶30，在此條件下提取的多酚類物質(zhì)對(duì)DPPH自由基清除率可達(dá)75.39%。董琦等[22]通過(guò)微波輔助提取樺褐孔菌多酚類物質(zhì)，最佳工藝為50%乙醇，料（g）液（mL）比1∶50，微波功率560 W，微波時(shí)間180 s，樺褐孔菌多酚類物質(zhì)提取率為3.19%。樺褐孔菌多酚類物質(zhì)提取工藝的優(yōu)化為樺褐孔菌產(chǎn)品開(kāi)發(fā)提供保障。

4 樺褐孔菌多酚類物質(zhì)發(fā)酵工藝優(yōu)化

樺褐孔菌多酚類物質(zhì)具有較好的生物活性，在醫(yī)療產(chǎn)品與食品方面具有較好的開(kāi)發(fā)前景，但樺褐孔菌的野生資源有限，制約樺褐孔菌的相關(guān)產(chǎn)品研發(fā)。近年來(lái)，通過(guò)液體發(fā)酵獲得樺褐孔菌菌絲體并提高多酚類物質(zhì)含量成為樺褐孔菌的重要研發(fā)方向。

研究表明，通過(guò)向培養(yǎng)液中添加5‐氮雜胞苷、木質(zhì)纖維材料、糙米混合物、激發(fā)子、有機(jī)溶劑等，可有效地提高樺褐孔菌液體發(fā)酵產(chǎn)物中的多酚類物質(zhì)含量。趙艷霞等[23]在培養(yǎng)液中添加100μmol/L的5‐氮雜胞苷，能提高樺褐孔菌菌絲體內(nèi)與多酚類物質(zhì)合成相關(guān)的苯丙氨酸解氨酶（PAL）、4?香豆酸輔酶A連接酶（4CL）、硬毛素合成酶（SPS）基因的表達(dá)水平，改變SPS啟動(dòng)子區(qū)的組蛋白甲基化修飾，提高組蛋白H3K4、H3K36的甲基化修飾水平，使樺褐孔菌菌絲體細(xì)胞內(nèi)多酚類物質(zhì)積累量由對(duì)照組的28.7 mg/g提高至46.6 mg/g，胞外多酚類物質(zhì)的體積質(zhì)量由對(duì)照組的66.9 mg/L提高至92.3 mg/L。ZHU等[24]向液體培養(yǎng)液中分別添加木質(zhì)纖維材料小麥秸稈、甘蔗渣、稻草，使樺褐孔菌胞外多酚類物質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別提高106.9%、67.6%、151.2%，胞內(nèi)多酚類物質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別提高26.1%、38.9%、45.3%，三者胞外多酚類物質(zhì)中的表兒茶素?3?沒(méi)食子酸酯、表沒(méi)食子兒茶素?3?沒(méi)食子酸酯、phelligridin G均顯著增加，此外還大量生成對(duì)照培養(yǎng)基中未發(fā)現(xiàn)的Davallialactone、inoscavin B。王艷梅等[25]將玉米、紅小豆、糙米（1∶1∶1）混合并粉碎至顆粒直徑0.25 mm以下，用該基質(zhì)培養(yǎng)的樺褐孔菌，多酚類物質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)可達(dá)22.48 mg/g。魏志文等[26]在樺褐孔菌液體培養(yǎng)液中加入50μg/L黑曲霉細(xì)胞壁碎片作為真菌激發(fā)子，培養(yǎng)的樺褐孔菌菌絲體胞內(nèi)和胞外多酚類物質(zhì)體積質(zhì)量最高為102.15 mg/L、311.91 mg/L；進(jìn)一步研究表明真菌激發(fā)子能夠顯著提高一氧化氮合酶活性，進(jìn)而提高一氧化氮的含量，從而提高樺褐孔菌的代謝速率，最終提高多酚類物質(zhì)的產(chǎn)量。沈夢(mèng)薇等[27]在樺褐孔菌培養(yǎng)基中添加能夠改變細(xì)胞膜通透性的丙酮，進(jìn)而影響細(xì)胞對(duì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的吸收，可提高樺褐孔菌胞內(nèi)外多酚類物質(zhì)產(chǎn)量與活性，其中胞內(nèi)多酚類物質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)達(dá)7.84 mg/g，是對(duì)照組的2.5倍，且二苯代苦味肼基自由基清除率達(dá)85.97%，為對(duì)照組的3倍。此外，光照條件對(duì)多酚類物質(zhì)的生成也有影響[28]。

以上研究結(jié)果表明，5‐氮雜胞苷、木質(zhì)纖維材料、糙米混合物、多糖類物質(zhì)、有機(jī)溶劑等誘導(dǎo)劑是提高樺褐孔菌發(fā)酵培養(yǎng)時(shí)胞內(nèi)外多酚類物質(zhì)含量的有效方法。

5 展望

總結(jié)樺褐孔菌多酚類物質(zhì)的結(jié)構(gòu)、生物活性及提取工藝的研究進(jìn)展，為樺褐孔菌開(kāi)發(fā)利用提供參考。樺褐孔菌多酚類物質(zhì)不僅具有抗氧化、抗腫瘤和抑菌等作用，還具有改善肝臟脂質(zhì)[29]、抑制肝細(xì)胞凋亡[30]、調(diào)節(jié)血脂水平[31]、提高外周淋巴細(xì)胞的生存能力[32]、調(diào)節(jié)血糖[33]、緩解宿醉[34]和延長(zhǎng)食用油貨架期[35]等作用，具有較廣闊的市場(chǎng)應(yīng)用前景。但由于樺褐孔菌野生資源有限，其各類產(chǎn)品的研發(fā)受限制，尤其是基于多酚類物質(zhì)功能性產(chǎn)品的開(kāi)發(fā)。采用液體發(fā)酵技術(shù)生產(chǎn)菌絲體來(lái)代替野生樺褐孔菌，是樺褐孔菌資源利用的重要研究方向。目前通過(guò)添加各種誘導(dǎo)劑提高樺褐孔菌多酚類物質(zhì)總含量的研究取得一些進(jìn)展，但對(duì)提高哪種多酚類物質(zhì)含量的研究未見(jiàn)報(bào)道，今后應(yīng)加強(qiáng)這方面的研究，為樺褐孔菌資源的高效利用及制定多酚類物質(zhì)的化學(xué)標(biāo)準(zhǔn)提供依據(jù)。另外，多糖與三萜類成分也是樺褐孔菌的主要功效成分，如何與多酚類物質(zhì)相結(jié)合來(lái)開(kāi)發(fā)功能多樣的樺褐孔菌產(chǎn)品，也是樺褐孔菌資源利用的重要領(lǐng)域。