祖木熱提古麗·阿不來提 陳鐳雨 馬琰迪 何尚峰 熱孜亞古麗·阿克木 徐江

口腔鱗狀細(xì)胞癌(oral squamous cell carcinoma,OSCC)是嚴(yán)重危害人類健康的惡性腫瘤之一，2018 年全球新增354 864 例惡性腫瘤病例，就有177 384 例死于口腔癌[1-2]。我國口腔頜面部的惡性腫瘤以鱗狀細(xì)胞癌最普遍，達(dá)到了80%。瞬時(shí)受體電位通路(Transient receptor potiential,TRP)超家族是一類大的非選擇性陽離子通道亞基，廣泛的分布在各種低高等生物中，參與多種細(xì)胞的功能調(diào)節(jié)，與多種癌癥有關(guān)[3]。其中，瞬時(shí)感受器電位香草酸受體亞型4(transient receptor potential vanilloid 4,TRPV4)是非選擇性的陽離子通路，Ca、Na等陽離子的發(fā)卡狀通路，參與多種細(xì)胞功能[4]。轉(zhuǎn)化生長因子-β1(transforming growth factor-β1,TGF-β1)是一個(gè)生物多效性的生長分化機(jī)制，在許多癌癥中異常高表達(dá)，而且也與癌癥的生物學(xué)行為密切相關(guān)。本實(shí)驗(yàn)將采用免疫組織化學(xué)Envision法，測定在OSCC和癌旁正常組織中TRPV4、TGF-β1的表達(dá)情況，并探討TRPV4、TGF-β1表達(dá)與OSCC臨床特性和術(shù)后生存率之間的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 組織標(biāo)本和資料收集

本實(shí)驗(yàn)納入OSCC樣本103 例，同時(shí)選取癌旁正常組織66例(距離癌組織2 cm以上)，樣本來自于石河子大學(xué)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院2004 年～2019 年間病理確診的病例石蠟組織。同時(shí)收錄了103 例蠟塊相對(duì)應(yīng)的患者臨床病歷資料，包括姓名、性別、年齡、病理診斷、分化程度、T分期、N分期、TNM分期、確診日期、總生存時(shí)間等，并建立組織樣本信息庫。通過電話、醫(yī)院病歷或其他方法等103 例OSCC中隨訪例數(shù)為74 例。

1.2 主要試劑

兔抗TGF-β1多克隆抗體(Affinity公司，AF1027,美國)；稀釋濃度1∶200；TRPV4兔多克隆抗體(Abcam公司，ab94868，英國)；稀釋濃度1∶150；免疫組化試劑盒(北京市中杉金橋生物科技股份有限公司)。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法及結(jié)果判定

采用免疫組化EnVision二步法(ELPS)檢測TRPV4和TGF-β1的表達(dá)水平。實(shí)驗(yàn)結(jié)果由兩名病理醫(yī)生隨機(jī)雙盲閱片和評(píng)分。采用判定準(zhǔn)則：以綜合染色強(qiáng)度與陽性細(xì)胞總量比例作為評(píng)價(jià)。積分?jǐn)?shù)=陽性染色細(xì)胞百分比評(píng)分×染色強(qiáng)度評(píng)分。百分比判定標(biāo)準(zhǔn)：0%～5%(0 分)、6%～25%(1 分)、26%～50%(2 分)、51%～75%(3 分)、76%～100%(4 分)。染色強(qiáng)度評(píng)分：無色(0 分)，淡黃色(1 分)，黃色(2 分)，棕黃色(3 分)，棕褐色(4 分)。陽性等級(jí)：0～4為陰性(-)，5～8為弱陽性(+)，9～12為陽性(++)。以(+～++)為陽性，(-)為陰性。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

使用SPSS 23.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，OSCC組織中TRPV4和TGF-β1的表達(dá)水平和臨床病理特征間的相關(guān)性用χ2檢驗(yàn)進(jìn)行比較。 ROC曲線和AUC用于評(píng)估TRPV4和TGF-β1表達(dá)對(duì)于預(yù)測口腔鱗狀細(xì)胞癌的特異性和靈敏度。使用Kaplan-Meier方法對(duì)患者隨訪的生存情況進(jìn)行分析。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)含義。做圖時(shí)均使用了Graphpad 5.0軟件。

2 結(jié) 果

2.1 TRPV4和TGF-β1在OSCC及癌旁正常組織中的表達(dá)

TRPV4和TGF-β1在OSCC及癌旁正常組織中的表陽性率分別為69.90%、74.76%和24.24%、19.70%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，表 1，圖 1)。TRPV4、TGF-β1在OSCC及癌旁正常組織評(píng)分等級(jí)間的差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，表 2，圖 2)。

表 1 OSCC及癌旁正常組織中TRPV4和TGF-β1的表達(dá)

表 2 OSCC及癌旁正常組織中TRPV4和TGF-β1的表達(dá)差異

圖 1 TRPV4和TGF-β1在不同組織中的表達(dá)(ELPS)

圖 2 TRPV4和TGF-β1在不同組織中的表達(dá)

2.2 TRPV4,TGF-β1在OSCC組織中的表達(dá)與臨床病理因素之間的關(guān)聯(lián)

TRPV4的表達(dá)與TNM分期，分化程度密切相關(guān)(P<0.05)，與年齡、性別、浸潤深淺、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移無相關(guān)性(P>0.05)；TGF-β1的表達(dá)與浸潤深度和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)(P<0.05)(表 3)。

表 3 TRPV4,TGF-β1表達(dá)與OSCC臨床病理因素之間的關(guān)聯(lián)

2.3 TRPV4,TGF-β1在OSCC組織中表達(dá)的相關(guān)性

經(jīng)Spearman等級(jí)的相關(guān)分析，TRPV4與TGF-β1的表達(dá)，在103例OSCC組織中均呈正相關(guān)(r=0.211、P=0.033)(表 4)。

表 4 TRPV4和TGF-β1在口腔鱗狀細(xì)胞癌中表達(dá)的相關(guān)性

2.4 TRPV4,TGF-β1表達(dá)與OSCC的ROC曲線分析

本實(shí)驗(yàn)使用ROC曲線分析TRPV4,TGF-β1在OSCC及對(duì)照組中免疫組化評(píng)分的診斷價(jià)值。結(jié)果顯示TRPV4,TGF-β1表達(dá)在OSCC的表達(dá)曲線下AUC值為(0.842，0.857)(圖 3)，用診斷臨界值確定OSCC的靈敏度和特異性。(診斷臨界點(diǎn)為5)。

圖 3 ROC分析TRPV4,TGF-β1在OSCC及對(duì)照組中免疫組化評(píng)分 圖 4 TRPV4,TGF-β1表達(dá)與OSCC患者預(yù)后的生存分析

2.5 TRPV4,TGF-β1表達(dá)與患者預(yù)后的關(guān)系

103 例OSCC中，74 例患者獲得臨床隨訪信息。Kaplan-Meier生存曲線比較OSCC中TRPV4,TGF-β1表達(dá)和患者預(yù)后的關(guān)系，結(jié)果如圖 4，高表達(dá)TRPV4,TGF-β1的OSCC患者生存時(shí)間顯著少于低表達(dá)患者(P=0.019 3、P<0.000 1)。

3 討 論

口腔鱗狀細(xì)胞是人類頭頸部常見的惡性腫瘤，發(fā)病率位于各種癌癥的第九位，并且近年來呈逐漸上升趨勢[5]。與其他腫瘤相似，OSCC的發(fā)生發(fā)展是受多因素共同參與的過程，如環(huán)境、飲食、遺傳等。近年來OSCC的預(yù)防、早期診斷和治療預(yù)后，已成為全球備受重視的公共衛(wèi)生問題。

TRP通道是Pak等[6]在1969 年在突變性果蠅眼底視網(wǎng)膜光感受器上首次被發(fā)現(xiàn)。TRP超家族跟其他種類的研究一樣展現(xiàn)在的面前[7]。其中TRPV是較大、最多樣化的重要亞基[8]。有研究證實(shí)TRPV亞家族成員TRPV4參與調(diào)節(jié)多種癌癥的發(fā)病、發(fā)展，其功能并不一致。Yamada等[9]研究表明，TRPV4在實(shí)驗(yàn)小鼠的膀胱尿路上皮基地細(xì)胞中高表達(dá)，4-aPDD激活TRPV4促進(jìn)腫瘤的形成。與這些研究的結(jié)果恰恰相反，Adapala等[10]表明TRPV4在肺腫瘤起源的內(nèi)皮細(xì)胞(TECs)中的表達(dá)明顯低于正常內(nèi)皮細(xì)胞(ECs)促進(jìn)血管形成與成熟，抑制腫瘤的生長。TRPV4在其他腫瘤領(lǐng)域已經(jīng)廣泛研究，然而有關(guān)TRPV4在OSCC的表達(dá)情況報(bào)道卻鮮少。本研究結(jié)果顯示，TRPV4在OSCC中呈高表達(dá)，且表達(dá)明顯高于癌旁正常組織，結(jié)果與Fujii等[11]在OSCC中TRPV4高表達(dá)的研究結(jié)果一致，表明TRPV4表達(dá)很可能與OSCC的發(fā)生和進(jìn)展相關(guān)。本研究還顯示TRPV4的表達(dá)水平和腫瘤的分化程度，以及與TNM分期相關(guān)(P<0.05)，高中分化OSCC組織中TRPV4的表達(dá)程度比低分化OSCC組織低，表明TRPV4可能參與了OSCC的惡變過程。

TGF-β1是TGF-β多功能多肽家族成員之一[12]，在多種腫瘤組織中表達(dá)異常，與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展和預(yù)后密切相關(guān)。在本研究中發(fā)現(xiàn)OSCC組織中TGF-β1的表達(dá)明顯高于癌旁正常組織中(P<0.05)，結(jié)果與孫樂剛等[13]研究結(jié)果一致。宋陽等的研究表明[14]，TGF-β1誘導(dǎo)活化HSC-T6細(xì)胞，結(jié)果活化的HSC中TRPV4表達(dá)明顯升高。本研究經(jīng)Spearman等級(jí)的相關(guān)分析，結(jié)果顯示TRPV4和TGF-β1在OSCC中的表達(dá)則呈正相關(guān)，提示二者可能對(duì)OSCC的發(fā)生、發(fā)展具有協(xié)同促進(jìn)作用。本實(shí)驗(yàn)通過ROC曲線分析，表明TRPV4和TGF-β1有較高診斷效能，并用ROC曲線確定了診斷臨界值，為今后診斷OSCC提供一種新的生物學(xué)檢測方法。在本研究中作者對(duì)納入患者進(jìn)行隨訪，應(yīng)用Kaplan-Meier法對(duì)患者生存分析，結(jié)果顯示TRPV4和TGF-β1高表達(dá)組患者的術(shù)后生存時(shí)間明顯低于低表達(dá)組，證明了TRPV4和TGF-β1與OSCC的患者生存率密切相關(guān)。

綜上所述，TRPV4和TGF-β1在OSCC中表達(dá)顯著升高，且TRPV4和TGF-β1高表達(dá)提示OSCC患者預(yù)后差，可能是診斷和預(yù)后判斷的潛在生物標(biāo)志物。但是TRPV4和TGF-β1在OSCC中的作用機(jī)制及內(nèi)在關(guān)系還需進(jìn)一步深入研究。