郝妍 白相宇 霍峰 陳喜波

口腔癌是我國(guó)的一種高發(fā)癌癥，其發(fā)病率和死亡率逐年增加，對(duì)于患者的健康具有嚴(yán)重影響[1]?？谇话┙?jīng)過綜合治療后患者的生存期有所提高，但是總體預(yù)后依舊較差[2]。SET結(jié)構(gòu)域分支型1(SET domain bifurcated1，SETDBl)是賴氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶SUV39家庭中重要一員，參與基因的甲基化修飾，與多種腫瘤密切相關(guān)[3-9]。但是SETDB1在口腔癌發(fā)生發(fā)展中作用的相關(guān)研究卻鮮有文獻(xiàn)報(bào)道。本文通過檢測(cè)SETDB1在口腔癌中的表達(dá)并探討其與臨床病理特征的相關(guān)性，以期探討其在口腔癌的發(fā)生、發(fā)展中的作用機(jī)制。

1 資料與方法

1.1 標(biāo)本來源

納入2019 年1 月～2021 年1 月于承德醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院口腔外科手術(shù)切除的口腔鱗癌及癌旁組織47 例，術(shù)前均未接受過任何治療；取癌組織為實(shí)驗(yàn)組，癌旁正常口腔黏膜組織為對(duì)照組。47 例患者中(男36 例，女11 例)；≥60 歲42 例，<60 歲5 例；TNM分期：I期18 例，Ⅱ期18 例，Ⅲ期11 例；高分化10 例，中分化32 例，低分化5 例;有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移9 例，無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移38 例。本研究涉及人體組織標(biāo)本經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)通過。

1.2 主要試劑

SETDBl單克隆抗體(Abcam公司，英國(guó))；DNA提取試劑盒(北京伊塔生物科技有限公司)；免疫組化SP試劑盒、濃縮型DAB試劑(沈陽萬類生物科技有限公司)；RNA引物(上海博湖生物科技有限公司設(shè)計(jì))。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(qRT-PCR)

RNA提取試劑盒提取組織總RNA。取300 ng RNA，應(yīng)用反轉(zhuǎn)錄試劑盒進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。應(yīng)用SYBR?Green qPCR Master熒光定量試劑盒(廣州銳博生物科技有限公司)檢測(cè)PCAF、KAT5及P300/CBP mRNA的表達(dá)，相對(duì)表達(dá)量為2-ΔΔCt。

1.3.2 免疫組織化學(xué)染色SP法 石蠟切片脫蠟，3%甲醇-H2O2溶液及枸櫞酸鈉緩沖液加熱處理組織切片、山羊血清封閉后，I抗溫育(SETDB1單克隆抗體，1∶1 000)，II抗溫育，中間 PBS洗滌,DAB顯色，蘇木素染色，酒精脫水、二甲苯透明、中性樹膠封固。

1.3.3 Western blot 提取總蛋白，測(cè)定蛋白濃度；制備電泳蛋白上樣液，行SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳。電泳后，轉(zhuǎn)膜，加I抗4 ℃過夜(SETDB1單克隆抗體，1∶1 000；GAPDH抗體1∶2 000)；次日孵育II抗，重復(fù)洗膜3 次后顯影。

1.3.4 免疫組化結(jié)果評(píng)分標(biāo)準(zhǔn) 根據(jù)切片染色程度和著色陽性細(xì)胞所占百分率進(jìn)行評(píng)價(jià)計(jì)分(每張切片高倍鏡下隨機(jī)觀察10 個(gè)視野)；染色強(qiáng)度評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)(A)：無色(0 分)，淡黃色 (1 分)，棕黃色(2 分)，棕褐色(3 分)。著色陽性細(xì)胞所占百分率評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)(B)：<10%為1 分，10%～50%為2 分，50%～75%為3 分，>75%為4 分。以A+B所得分?jǐn)?shù)作為評(píng)判標(biāo)準(zhǔn)：0～2分為陰性，≥3分為陽性。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié) 果

2.1 口腔癌和癌旁組織中SETDB1 mRNA的相對(duì)表達(dá)

qRT-PCR結(jié)果顯示口腔癌組織中SETDB1 mRNA相對(duì)表達(dá)量(3.54±0.12)顯著高于癌旁組織(0.42±0.07)(P<0.05)。

2.2 口腔癌組織和癌旁組織中SETDB1蛋白的表達(dá)

免疫組化結(jié)果顯示，口腔癌組織中SETDB1陽性表達(dá)率為 87.23%(41/47)，癌旁組織陽性表達(dá)率僅為17.02%(8/47)(P<0. 05)(表 1，圖 1)。Western blot實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，口腔癌組織中SETDB1的蛋白表達(dá)量為(72.36±3.46)%，癌旁組織為(14.53±1.76)%(P<0. 05)(圖 2)。

表 1 口腔癌組織和癌旁組織SETDB1蛋白表達(dá)

圖 1 口腔癌和癌旁組織中SETDB1蛋白表達(dá) (SP, ×200)

圖 2 口腔癌和癌旁組織中SETDB1蛋白表達(dá) (Western blot)

2.3 口腔癌組織中SETDB1表達(dá)與臨床病理特征的相關(guān)性

SETDB1陽性與口腔癌TNM分期、組織分化及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)(P<0.05)，與性別、年齡與否無關(guān)(P>0.05)(表 2)。

表 2 口腔癌組織中SETDB1表達(dá)和臨床病理特征的關(guān)系

3 討 論

口腔癌是全世界范圍內(nèi)第六大常見的癌癥，也是我國(guó)一種常見的頭頸部惡性腫瘤，嚴(yán)重影響人民群眾的生命健康[10-12]。在惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程中，基因功能紊亂可以引起癌基因的激活和抑癌基因的失活[13-14]。多種不良因素均可引起口腔黏膜基因變異，導(dǎo)致調(diào)控失常，從而引起口腔癌的發(fā)生與發(fā)展。因此，從基因分子水平探究診治口腔癌已成為本領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)。

研究表明，賴氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶與多種腫瘤的形成有關(guān)，甲基轉(zhuǎn)移酶活性缺失或失調(diào)可能是導(dǎo)致腫瘤發(fā)生的原因[15]。SETDB1是賴氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶SUV39家族中重要一員，可以催化組蛋白3第9位點(diǎn)的賴氨酸殘基發(fā)生甲基化[16]。近年來的研究發(fā)現(xiàn), SETDB1在多種惡性腫瘤中均呈現(xiàn)高表達(dá)轉(zhuǎn)態(tài)，且與腫瘤的惡性程度和轉(zhuǎn)移程度密切相關(guān)[17]。Xiao等[18]通過生物信息學(xué)分析及系列實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)在乳腺癌中SETDB1顯著擴(kuò)增并高度表達(dá)且下調(diào)SETDB1基因能夠顯著抑制乳腺癌細(xì)胞的生物學(xué)功能。進(jìn)一步研究顯示，SETDB1編碼的mRNA 3′UTR區(qū)與MiR-7存在部分互補(bǔ), 過表達(dá)MiR-7會(huì)下調(diào)SETDB1, 同時(shí)上調(diào)c-MYC和cyclin D1，并通過抑制STAT3信號(hào)通路, 逆轉(zhuǎn)乳腺癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移途徑[19]。

SETDB1可以作為組蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶通過與TIAM1相互作用促進(jìn)肝癌細(xì)胞的增殖和遷移[20]，同時(shí)在結(jié)直腸癌中，SETDB1可能促進(jìn) Wnt/β-catenin 信號(hào)通路激活，促進(jìn)結(jié)直腸癌EMT進(jìn)程，進(jìn)而促進(jìn)結(jié)直腸癌發(fā)生[21]。早期非小細(xì)胞肺癌組織中SETDB1呈高表達(dá)狀態(tài), 與肺癌的病理學(xué)特征具有強(qiáng)相關(guān)性[22]。在肺癌組織中SETDB1呈現(xiàn)高表達(dá)狀態(tài)，且與肺癌的增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移相關(guān)；體外干擾下調(diào)SETDB1可以抑制肺癌細(xì)胞生物學(xué)功能，且抑制裸鼠模型中的肺腫瘤生長(zhǎng)，而過表SETDB1則可以增加肺癌細(xì)胞的侵襲性[23]。但其他研究者發(fā)現(xiàn)，在非小細(xì)胞癌中，SETDB1可以通過調(diào)控c-MYC表達(dá)而激活Wnt/β-caterin信號(hào)通路，進(jìn)而增強(qiáng)IRES介導(dǎo)與翻譯， 這表明SETDB1增強(qiáng)IRES介導(dǎo)的翻譯可能具有癌癥特異性[24]。董紅玲[25]研究發(fā)現(xiàn)卵巢癌中SETDBl表達(dá)水平異常升高，并與患者不良預(yù)后密切相關(guān)，SETDBl對(duì)卵巢癌患者具有一定的預(yù)后評(píng)價(jià)作用。

目前，SETDBl在口腔癌中的表達(dá)情況及臨床意義尚未見相關(guān)報(bào)道。本研究發(fā)現(xiàn)，口腔癌組織中SETDB1 mRNA相對(duì)表達(dá)量明顯高于癌旁正?？谇火つそM織；進(jìn)一步通過免疫組化和Western blot證實(shí)癌組織中SETDB1蛋白水平亦呈顯著增高，并與腫瘤分期、組織分化和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移臨床病理特征密切相關(guān)。SETDB1在口腔癌Ⅰ期的陽性表達(dá)低于Ⅱ期和Ⅲ期，而Ⅱ期的陽性表達(dá)率低于Ⅲ期，即隨著口腔癌TNM分期的增加SETDB1陽性表達(dá)也逐漸增加，說明SETDB1可能與口腔癌的惡性程度具有密切的相關(guān)性。隨著口腔癌分化程度的降低，SETDB1蛋白的陽性表達(dá)卻隨之增加，同時(shí)有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移同無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相比具有明顯差異性，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移中SETDB1蛋白的陽性表達(dá)顯著升高，說明SETDB1的陽性高表達(dá)可能促進(jìn)了口腔癌的惡性轉(zhuǎn)化，或抑制了口腔癌細(xì)胞自身的凋亡過程，使得口腔癌惡性程度增強(qiáng)，導(dǎo)致其發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移。因而，本研究推斷口腔癌中SETDB1的高表達(dá)抑制了癌細(xì)胞凋亡，促進(jìn)口腔癌細(xì)胞無限制生長(zhǎng)及腫瘤的惡性轉(zhuǎn)化，導(dǎo)致了其局部浸潤(rùn)和遠(yuǎn)處遷移，最終導(dǎo)致患者的生存期下降。同時(shí)也說明SETDBl參與了口腔癌的發(fā)生和發(fā)展，是一種重要的促癌蛋白，在促進(jìn)腫瘤轉(zhuǎn)移等方面具有重要作用。

綜上所述，SETDBl在口腔癌中高表達(dá)以及診斷具有一定的潛在價(jià)值。隨著分子生物學(xué)的發(fā)展，深入探討SETDBl與口腔癌發(fā)生發(fā)展、侵襲、轉(zhuǎn)移及預(yù)后的關(guān)系，對(duì)口腔癌的早期診斷及預(yù)后判斷提供分子生物學(xué)指標(biāo)意義重大。