衛(wèi)博文 李 城 張?zhí)鞁?魏佩煌 李 諾 李 健

北京中醫(yī)藥大學中醫(yī)學院 (北京， 100029)

雷公藤是衛(wèi)矛科植物，其木質(zhì)部入藥，性味苦、寒，歸肝、腎經(jīng)，有祛風除濕、活血通絡、消腫止痛、殺蟲解毒的功效[1]?，F(xiàn)代藥理學研究表明，雷公藤的主要活性成分雷公藤甲素(triptolide)具有抗炎、免疫調(diào)節(jié)等藥理作用[2]。近年來，越來越多的研究結(jié)果證實雷公藤甲素具有較強的廣譜抗腫瘤活性[3]，但其藥效與毒性難以分離，部分患者因使用不當可出現(xiàn)不同程度的肝損傷、腎損傷、生殖毒性等副反應[4]。

本課題組的前期研究發(fā)現(xiàn)，雷公藤多苷對正常和病理狀態(tài)機體毒性反應存在差異[5,6]，與《黃帝內(nèi)經(jīng)》中“有故無殞”理論相符合，為進一步研究其 “毒-效”相關性，本課題以CT26結(jié)腸癌小鼠為實驗研究對象，在評價雷公藤甲素抗腫瘤作用的同時，觀察比較其對正常及荷瘤小鼠的肝毒性反應，并初步探討其機制，為雷公藤的臨床應用及深度開發(fā)提供更多的資料。

1 材料和方法

1.1 實驗細胞及實驗動物 CT26 WT細胞株(ATCC ? CRL-2638TM)，購自中國醫(yī)學科學院細胞中心，DMEM培養(yǎng)基(10%胎牛血清、1%雙抗)常規(guī)培養(yǎng)；BALB/c小鼠，5～6周齡，清潔級，雄性，購自北京維通利華實驗動物公司。

1.2 實驗儀器及試劑 自動脫水機ASP300S，德國LEICA；BD FACSCanto Ⅱ電子天平，德國Sartorius AG；HistocoreArcadia H包埋機，德國LEICA ；DM3000正置顯微鏡，德國LEICA；RM2265超薄切片機，德國LEICA；DW-86L729 -86℃超低溫保存箱，中國海爾。Annexin Ⅴ-FITC/PI 細胞凋亡檢測試劑盒，購自賽默飛世爾科技(Thermo)公司；CCK-8試劑盒、MDA試劑盒、SOD試劑盒及GSH-PX試劑盒均購自南京建成生物公司；iNOS及Nrf2抗體，Abcam產(chǎn)品。

1.3 實驗藥物 雷公藤甲素，購自南京澤朗醫(yī)藥科技有限公司(純度≥99%)；

1.4 雷公藤甲素體內(nèi)外抑瘤實驗

1.4.1 CCK-8法檢測細胞增殖抑制率 CT26細胞接種于96孔板，5 000/孔，孵育24 h后給藥，經(jīng)雷公藤甲素(50 nM)處理24 h后用CCK-8試劑盒測定不同處理組CT26細胞450 nm處吸光度并計算細胞的增殖抑制率，計算公式：細胞增殖抑制率(%)=(A對照組-A實驗組)/A對照組×100%(A表示吸光度)。

1.4.2 傷口愈合實驗檢測細胞遷移能力 CT26細胞接種于6孔板，待細胞融合至70%～80%時，用1 ml吸頭垂直于培養(yǎng)板底部劃痕并給予雷公藤甲素(50 nM)處理，于0 h、24 h觀察并拍照，用Image J測量劃痕之間的距離比較不同處理組對細胞遷移的影響并計算細胞遷移抑制率，計算公式：細胞遷移抑制率=(1-L實驗組/L對照組)×100%(L表示遷移距離)。

1.4.3 流式細胞術檢測細胞凋亡率 CT26細胞種于6孔板，孵育24 h后加藥，經(jīng)雷公藤甲素(50 nM)處理24 h后用細胞凋亡試劑盒和流式細胞術檢測并計算不同處理組對CT26細胞凋亡的影響。

中國人的消費水平有豪華型、富裕型、一般型、困難型、貧困型五個層次，其中后三種為平民消費，因此,在設計夜游項目時,要考慮到消費層次的多樣化，既要有高端夜游產(chǎn)品,如音樂會、講座、沙龍等，也要有適合平民消費的旅游產(chǎn)品,如廣場休閑、商業(yè)街購物等。如今,夜游活動趨向大眾化，不同年齡階段的人群均參與夜間旅游，考慮到不同年齡消費群體的不同特征，夜間旅游活動既要有適宜年輕人群消費的KTV、酒吧、健身所等時尚場所，又要有適合中老年人群的公園、河湖等較為寧靜的場所。總之，在夜游產(chǎn)品的設計上應有動有靜、有高端有低端，以滿足消費群體的多樣化需求。

1.4.4 荷瘤小鼠模型的建立、分組給藥及腫瘤體積和重量的測量 BALB/c小鼠隨機分為空白對照組、腫瘤模型組、雷公藤甲素干預組(每組20只)。常規(guī)細胞培養(yǎng)擴增CT26細胞，收獲對數(shù)生長期細胞、計數(shù)后接種于腫瘤模型組和雷公藤甲素干預組小鼠右前肢下的皮下部位，建立皮下荷瘤小鼠模型(1×107個/100 μl)，空白對照組小鼠皮下注射等劑量溶劑(0.01 M PBS)。雷公虅甲素干預組小鼠自移植腫瘤細胞當天腹腔注射雷公藤甲素(0.4 mg/kg)，空白對照組和腫瘤模型組給予同等體積的蒸餾水，連續(xù)給藥25天。自移植腫瘤第6天，用游標卡尺測量荷瘤小鼠皮下腫瘤的長度和寬度并計算體積。取材時剝離皮下腫瘤，稱重、拍照，計算抑瘤率。

1.5 雷公藤甲素對正常及荷瘤小鼠的肝毒性反應

1.5.1 血清中丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)的檢測 收集小鼠血液4℃冰箱靜置4 h，4℃，3 000 rpm/min離心10 min，分離血清，釆用比色法，全自動生化分析儀依照常規(guī)方法檢測血清中ALT的含量。

1.5.2 肝組織勻漿液中丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-PX)的檢測 依照試劑盒內(nèi)的操作說明書進行檢測。

1.5.3 肝組織病理學觀察 依照常規(guī)方法制備肝組織石蠟切片，HE染色、誘導型一氧化氮合酶(iNOS)及核轉(zhuǎn)錄因子E2相關因子2(Nrf2)免疫組化顯色，光鏡觀察并攝片分析。

2 結(jié)果

2.1 雷公藤甲素的體內(nèi)外抑瘤作用

2.1.1 雷公藤甲素的體外抑瘤作用 采用CCK-8法檢測雷公藤甲素對CT26細胞增殖的抑制作用，結(jié)果顯示：與空白對照組相比，雷公藤甲素組(50 nM)對CT26細胞的增殖抑制率顯著升高，24 h抑制率為51.46%(圖1B)。傷口愈合實驗結(jié)果表明，雷公藤甲素(50 nM)處理CT26細胞24 h能顯著抑制CT26細胞的遷移行為(圖1A)。流式細胞術檢測結(jié)果表明，雷公藤甲素能顯著誘導CT26細胞凋亡(圖1C,D)。

圖1 雷公藤甲素的體外抑瘤作用 注：A.傷口愈合實驗檢測CT26細胞遷移能力；B.CCK-8檢測CT26細胞增殖抑制率；C.D.流式細胞術檢測CT26細胞凋亡

2.1.2 雷公藤甲素的體內(nèi)抑瘤作用 見表1、2。

表1 小鼠腫瘤體積變化

表2 小鼠皮下腫瘤重量

2.2 雷公藤甲素對正常及腫瘤小鼠的肝毒性反應

2.2.1 各組小鼠血清中ALT含量 見表3。

表3 各組小鼠血清中ALT含量

2.2.2 各組小鼠肝組織勻漿液中MDA、SOD、GSH-PX表達見表4。

表4 各組小鼠肝組織勻漿液中MDA、SOD、GSH-PX表達

2.2.3 肝組織HE染色 正常對照組及腫瘤模型組小鼠的肝組織內(nèi)可見完整的肝小葉結(jié)構(gòu)，其肝索排列整齊、肝細胞形態(tài)正常，未見明顯異常變化(圖2-A,B)；正常+雷公藤甲素組小鼠肝小葉結(jié)構(gòu)消失，肝索排列紊亂，肝細胞形態(tài)異常，如肝細胞體積增大、腫脹變圓，胞漿空亮，細胞界限不清，大量炎性細胞浸潤(圖2-C)；腫瘤+雷公藤甲素組小鼠出現(xiàn)細胞腫脹，炎性細胞浸潤等變化(圖2-D)，但其肝小葉結(jié)構(gòu)損傷程度輕于正常+雷公藤甲素組。

2.2.4 免疫組化法檢測肝組織中iNOS表達情況 與正常對照組及腫瘤模型組比較，雷公藤甲素處理后小鼠肝組織中iNOS的平均光密度值均顯著增加，且正常組高于腫瘤組(P<0.05或P<0.01，圖3，表5)。

圖2 肝組織HE染色(× 200) 注：A.正常對照組；B.腫瘤模型組；C.正常+雷公藤甲素組；D.腫瘤+雷公藤甲素組

圖3 肝組織中iNOS的表達情況(× 200) 注：A.正常對照組；B.腫瘤模型組；C.正常+雷公藤甲素組；D.腫瘤+雷公藤甲素組

表5 肝組織中iNOS表達的平均光密度值

2.2.5 免疫組化法檢測肝組織中Nrf2表達情況 與正常對照組及腫瘤模型組比較，雷公藤甲素處理后小鼠肝組織中Nrf2的平均光密度值均顯著增加，且正常組高于腫瘤組(P<0.05或P<0.01，圖4，表6)。

表6 肝組織中Nrf2表達的平均光密度值

圖4 肝組織中Nrf2的表達情況(× 200) 注：A.正常對照組；B.腫瘤模型組；C.正常+雷公藤甲素組；D.腫瘤+雷公藤甲素組

3 討論

本研究以CT26結(jié)腸癌細胞及荷瘤小鼠為研究對象，探討雷公藤甲素對生理狀態(tài)及病理狀態(tài)小鼠的肝毒性反應。實驗結(jié)果表明：雷公藤甲素在一定程度上抑制CT26細胞的生長增殖、遷移，誘導細胞凋亡，同時，在動物體內(nèi)可顯著影響CT26皮下移植瘤的生長。雷公藤甲素可導致小鼠血清中ALT、肝組織勻漿液中MDA、SOD、GSH-PX表達顯著增加，肝組織損傷明顯，iNOS表達水平增加，且正常組的肝組織損傷程度明重于腫瘤組。免疫組化結(jié)果顯示，雷公藤甲素處理后小鼠肝組織中Nrf2表達顯著增加，提示雷公藤甲素的肝毒性發(fā)生機制與誘導氧化應激有關。

iNOS表達情況可間接評價雷公藤甲素對肝組織的損傷作用，iNOS產(chǎn)生的細胞毒性一氧化氮(NO)與超氧離子結(jié)合產(chǎn)生細胞毒作用，加重肝組織的損傷[7]。而氧化應激狀態(tài)下，線粒體呼吸鏈受到抑制，谷胱甘肽(GSH)及抗氧化酶(GST、GSH-PX、SOD等)表達降低， MDA活力增強[8]，Nrf2被激活，發(fā)揮對機體氧化應激損傷的防御保護作用[9]。

雷公藤甲素又稱雷公藤內(nèi)酯醇，屬于三環(huán)氧二萜內(nèi)酯類化合物。近年來研究顯示，雷公藤甲素具有廣譜抗腫瘤活性，能對60余種腫瘤細胞株有抑制作用。然而雷公藤甲素存在一定的毒副作用，臨床上部分患者出現(xiàn)肝損傷、腎損傷、生殖毒性等不良反應[4]。

中藥通常在“辨證論治”“因人制宜”等中醫(yī)理論的指導下使用[10]，其毒副作用隨著機體狀態(tài)或疾病狀態(tài)而變化。某些中藥可能對正常狀態(tài)的機體有毒副作用，但對病理狀態(tài)的機體沒有或僅有輕微的毒副作用，即“有故無殞”。“有故無殞”理論源自《黃帝內(nèi)經(jīng)》，《素問·六元正紀大論》云：“婦人重身，毒之何如…… 有故無殞，亦無殞也”，是有毒中藥合理使用的邏輯基礎?！坝泄薀o殞”理論一方面強調(diào)要對“病證”狀態(tài)使用中藥，另一方面也強調(diào)應重視 “中病即止”，該理論有助于理解中藥臨床不良反應的生物學本質(zhì)。

2011 年肖小河教授課題組發(fā)表了大黃提取物毒效相關性的研究成果，其結(jié)果表明大黃提取物對正常大鼠具有明顯的肝臟毒性，而對CCL4誘導肝損傷大鼠則表現(xiàn)出顯著的肝保護作用，為中醫(yī)“有故無殞”理論提供了確鑿的實證資料[11,12]。本課題組前期研究也發(fā)現(xiàn)不同劑量雷公藤多苷對正常大鼠和佐劑關節(jié)炎大鼠生殖、肝、腎等組織及細胞的毒性差異[6]，因此提出了對證控毒的研究策略，即中藥通常存在“毒-效”二重性；中藥毒效關系的研究應在“病證”狀態(tài)下[13]。

綜上，本研究通過離體實驗和整體實驗發(fā)現(xiàn)雷公藤甲素具有顯著的抗腫瘤作用，且相同劑量下，在荷瘤小鼠體內(nèi)產(chǎn)生的肝毒性反應較正常小鼠輕。