黃錦楨 王宇新 曾 華 童光東,△ 黃芙蓉 賴劍萍 陳團團

1.廣州中醫(yī)藥大學第四臨床醫(yī)學院 (廣東 深圳， 518033) 2.南京中醫(yī)藥大學附屬深圳市中醫(yī)院 3.深圳市中醫(yī)院肝病科

非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)與遺傳易感性和胰島素抵抗密切相關(guān)[1,2]。在中國大陸，18歲以上人群NAFLD患病率為20.09%，發(fā)病率為63.0/1 000人/年，全世界25%的人口被認為患有NAFLD[3-5]。NAFLD在中醫(yī)屬于“脅痛”“痞滿”等范疇，基本病機以肝失疏泄，脾氣虧虛為本，病位主要在肝脾腎[6]。根據(jù)五行理論，肝屬木，脾屬土，當肝臟受邪，往往可見與脾胃相關(guān)的癥狀[7,8]?！督饏T要略》曰：“見肝之病，知肝傳脾，當先實脾”。因此，臨床在治療NAFLD時往往需要顧及脾胃。 “茯苓-白術(shù)”藥對(FB)始見于《傷寒雜病論》，是治療脾胃氣虛常用藥對[9]。根據(jù)參考文獻[6]，胃苓湯和逍遙散分別作為“濕濁內(nèi)停型”和“肝郁脾虛型”的推薦用方，這兩方中都含有茯苓、白術(shù)。此外，用藥規(guī)律分析研究亦挖掘到FB是治療NAFLD的主要藥物[10-12]?，F(xiàn)代藥理學研究表明茯苓具有保肝、抗衰老、抗炎等作用[13]，白術(shù)具有免疫調(diào)節(jié)、抗炎、抑制脂肪形成等作用[14]。但目前的研究多針對單味藥，對該藥對的研究較少。本研究將借助網(wǎng)絡藥理學的方法探討FB治療NAFLD的作用機制，為下一步研究提供基礎。

1 資料與方法

1.1 FB活性成分及相關(guān)靶點篩選 通過TCMSP(http：//lsp.nwu.edu.cn/tcmsp.php)檢索茯苓、白術(shù)的活性成分，以口服利用度(OB)≥30%且類藥性(DL)≥0.18進行篩選，將獲得的成分在TCMSP上匹配對應的蛋白質(zhì)靶點[15]。少數(shù)未能匹配到靶點的成分，將利用PubChem(http://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/)平臺及Swiss Target Prediction數(shù)據(jù)庫(http://www.swisstargetprediction.ch/)進行靶點預測；最后借助Uniprot數(shù)據(jù)庫(http://www.uniprot.org)標準化蛋白質(zhì)靶點信息。

1.2 NAFLD相關(guān)靶點篩選 在GeneCards(http://www.genecards.org/)和DisGeNET(http：//www.disgenet.org/2019版v6.0)數(shù)據(jù)中以“non-alcoholic fatty liver disease”或“NAFLD”為關(guān)鍵詞挖掘疾病靶點，將得到的靶點合并、去重得到NAFLD的潛在靶點。

1.3 蛋白相互作用(PPI)網(wǎng)絡構(gòu)建 對藥物與疾病的靶點繪制韋恩圖，將交集靶點上傳至STRING11.0數(shù)據(jù)庫(http://string-db.org)，將生物種類設定為“Homo sapiens”，選取minimum required interaction score>0.700，隱藏游離節(jié)點，其余為默認設置，得到PPI網(wǎng)絡。

1.4 GO和 KEGG分析 在DAVID6.7數(shù)據(jù)庫(http://david.ncifcrf.gov/)中上傳交集靶點,選定物種為“Homo sapiens”,進行GO(生物過程BP、分子功能MF、和細胞組成CC)和KEGG富集分析,以P<0.05初步篩選。利用Sangerbox平臺(http://www.sangerbox.com/Tool)對P值前10的GO及前20的通路結(jié)果可視化。

1.5 藥對成分-異常靶點-通路網(wǎng)絡圖的構(gòu)建 挖掘KEGG前20條通路上各自富集的靶點，并根據(jù)1.1的結(jié)果匹配對應的化學成分。借助CytoScape3.7.2構(gòu)建 “藥對成分-異常靶點-通路網(wǎng)絡圖”，利用軟件功能分析成分及靶點的網(wǎng)絡拓撲參數(shù)，包括連接度、介度及緊密度等，根據(jù)上述參數(shù)篩選核心靶點及核心活性成分。

1.6 分子對接驗證 對1.5獲得的核心靶點及成分進行分子對接。借助RSCB PDB(http://www.rcsb.org/)及ZINC(http://zinc.docking.org/)數(shù)據(jù)庫分別獲取靶點蛋白3D及成分2D結(jié)構(gòu)。應用Autodock Tolls軟件進行除水、加極性氫等處理， Autodock Vina實現(xiàn)分子對接，以結(jié)合能≤-5.0 kcal/mol作為有效結(jié)合的篩選依據(jù)；最后利用Pymol軟件對結(jié)果可視化。

2 結(jié)果

2.1 FB活性成分及相關(guān)靶點的獲取 初步篩選后得到化學成分茯苓14種、白術(shù)7種；剔除少許未匹配到靶點的活性成分，最終得到重要活性成分茯苓15種、白術(shù)5種，見表1。通過數(shù)據(jù)庫預測補充，共得到成分作用靶點：茯苓198個、白術(shù)68個，刪除重復靶點后得到FB靶點206個。

表1 茯苓-白術(shù)藥對活性成分基本信息

2.2 NAFLD靶點的獲取 通過Genecards和DisGeNET數(shù)據(jù)庫檢索，分別得到疾病靶點1 532個、1 058個，匯總并刪除重復值，最終得到靶點2 088個。

2.3 PPI網(wǎng)絡構(gòu)建 藥物與疾病交集靶點為88個，見圖1。交集靶點PPI見圖2。結(jié)果顯示PPI網(wǎng)絡圖中共有83個節(jié)點，228條邊，平均節(jié)點度值5.49。

圖1 茯苓-白術(shù)藥對與NAFLD靶點韋恩圖

圖2 PPI網(wǎng)絡圖

2.4 GO和KEGG分析 結(jié)果顯示GO中涉及生物過程的有152條，如類固醇激素介導的信號通路、RNA聚合酶II對轉(zhuǎn)錄的正調(diào)控等。涉及分子功能的有53條，如類固醇激素受體活性類固醇結(jié)合等。涉及細胞組成的有18條，如膜筏、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜等，見圖3。

圖3 BP、CC、MF三合一柱狀圖

KEGG得到信號通路62條，顯著性較高的前20條通路見圖4。結(jié)合文獻檢索，篩選出可能與NAFLD有關(guān)的通道，并補充相關(guān)性較高但P值排名靠后的通道。結(jié)果顯示：相關(guān)信號通路涉及胰島素信號通路(hsa04910)、PPAR信號通道(hsa03320)、胰島素抵抗(hsa04931)、花生四烯酸代謝(hsa00590)、T細胞受體信號通道(hsa04660)、脂肪細胞因子信號通路(hsa04920)、TNF信號通路(hsa04668)、NOD樣受體信號通道(hsa04621)、HIF-1信號通道(hsa04066)。

圖4 KEGG前20條通路氣泡圖

2.5 藥對成分-NAFLD異常靶點-通路網(wǎng)絡圖的構(gòu)建 運用軟件構(gòu)建網(wǎng)絡圖，見圖5。結(jié)果表明齒孔酸、多孔菌酸C、茯苓酸C、去氫齒孔酸的連接度、介度和緊密度為前四，故預測這4個成分為核心活性成分，見表2。同理，靶點中前4位的為TNF、MAPK3、PIK3CA、NR1H3，預測這4個為核心靶點，見表3。

圖5 藥對成分-NAFLD異常靶點-生物通路網(wǎng)絡圖

表2 主要化合物成分網(wǎng)絡節(jié)點參數(shù)

表3 主要靶點網(wǎng)絡節(jié)點參數(shù)

2.6 分子對接結(jié)果 結(jié)果顯示靶點與成分的結(jié)合能均≤-5.0 kcal/mol，說明具有較好的親和力，見表4。關(guān)鍵靶點與其結(jié)合活性最好的化合物可視化結(jié)果見圖6。

表4 分子對接結(jié)果 kcal/mol

圖6 最優(yōu)對接結(jié)果可視化圖

3 討論

目前西醫(yī)治療NAFLD的方法是改變生活方式、健康飲食和規(guī)律運動，同時以調(diào)節(jié)血脂作為輔助治療，然而效果并不理想，而中醫(yī)藥在防治NAFLD方面有獨特優(yōu)勢[16]。治未病是中醫(yī)整體觀的一部分，如張景岳以“肝邪之見,本由脾胃之虛,使脾胃不虛,則肝木雖強,必無乘脾之患”言肝脾關(guān)系。如葉天士曰：“夫木郁土，古人制肝補脾升陽散邪，皆理偏就和為治?！?因此，發(fā)揮中醫(yī)學整體觀的特色，從健脾法來指導中醫(yī)藥治療NAFLD患者具有重要意義。

本研究初步篩選出FB治療NAFLD的核心成分為齒孔酸、多孔菌酸C、茯苓酸C及去氫齒孔酸。研究表明齒孔酸能夠抑制Fas的表達水平，從而降低脂肪的積累；齒孔酸對高脂飼料喂養(yǎng)的糖尿病小鼠的胰島素抵抗有保護作用[17]。多孔菌酸能抑制小鼠巨噬細胞NO的產(chǎn)生，從而可能發(fā)揮抗炎作用[18]。去氫齒孔酸可能通過增強過氧化物酶體增殖物激活受體α(PPARα)和肉堿棕櫚酰轉(zhuǎn)移酶Ia(CPT-1a)的表達水平以及通過抑制肝臟和脂肪組織中成脂脂肪酸合成酶(FAS)的表達水平，從而導致肝臟中儲存脂肪的減少和甘油三酯含量的降低[19]。研究表明茯苓酸能通過抑制磷酸酶A2(PLA2) 、白三烯B4 分泌,降低彈性蛋白酶和COX-2的活性實現(xiàn)抗炎作用[20]。

靶點方面，F(xiàn)B治療NAFLD的主要核心靶點為TNF、MAPK3、PIK3CA、NR1H3，這些靶點以直接或者間接方式涉及NAFLD的發(fā)病機制。有研究表明TNF的亞型TNF-α是一種重要的促炎細胞因子，可誘導NF-κB通路的激活[21，22]；TNF也能激活NLRP3炎癥體，這些都會增強促炎效應而導致肝細胞壞死。自噬是一種細胞吞噬并降解受損細胞質(zhì)成分的細胞過程，MAPK3可通過刺激ATG7依賴性自噬，從而在肝脂質(zhì)代謝中發(fā)揮有益作用[23]。研究表明NR1H3可以通過促進膽固醇外排和抑制炎性基因，對細胞膽固醇加載過程中產(chǎn)生的氧甾醇產(chǎn)生反應，從而發(fā)揮抗炎作用[24]。

此外，藥對治療NAFLD涉及多條復雜的信號通路。其中，PPAR信號通路的PPARa亞型與肝臟組織的脂肪酸代謝密切相關(guān)，其配體激活的PPARa可以通過干擾AP-1和NFjB信號通路抑制細胞因子誘導的炎癥因子IL-6基因表達[25]；另外有研究表明PPARa激活可改善NASH動物模型的脂肪變性、炎癥和纖維化[26]。T細胞受體信號通道能激活調(diào)節(jié)性T細胞的分化，而后者在控制自身耐受和炎癥反應方面發(fā)揮著關(guān)鍵作用[27]。HIF-1信號通道可通過抑制中鏈和長鏈酰基輔酶A脫氫酶從而抑制脂肪酸的分解代謝[28]。另外，HIF1α水平升高可能會增強脂肪細胞中的胰島素信號傳導，從而促進葡萄糖向脂肪酸和甘油三酸酯的轉(zhuǎn)化，從而導致肥胖[29]。故推測茯苓-白術(shù)藥對可能通過抑制HIF-1信號通路從而降低脂肪的產(chǎn)生。在NAFLD發(fā)病機制中，炎癥是連接上游胰島素抵抗/脂肪變性和下游細胞損傷的中心事件，而NOD樣受體信號通道中包含多種炎性小體，如NLRP-1、NLRP-3、NLRP-4[30]。飽和的脂肪酸可誘導NLRP3炎癥體的激活，從而導致炎癥因子IL-1β和IL-18的釋放[31]。故推測茯苓-白術(shù)藥對可能抑制了NOD樣受體信號通道而發(fā)揮抗炎作用。