符仲標(biāo) 陳 瓊 王 勇 劉昌江 唐明亮 吳智明

海南醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院 (海南 ?？冢?570311)

近10年來，我國(guó)的肝癌發(fā)病人數(shù)占全球肝癌的55%，依然位居榜首，且5年生存率無明顯提高[1]。而肝癌位于我國(guó)惡性腫瘤發(fā)病譜第4位，死亡率第2位，因此肝癌的防治形勢(shì)還是相當(dāng)嚴(yán)峻[2]。針對(duì)肝癌的治療，現(xiàn)如今還是以傳統(tǒng)放化療為主，但是已逐漸進(jìn)入瓶頸期，效果不甚理想。因此探索肝癌的新型療法是一項(xiàng)艱巨但很有意義的任務(wù)[3,4]。近幾年，環(huán)狀RNA(circ RNA)應(yīng)用于肝癌治療的研究探索越來越多，并已逐漸成熟[5-7]。Circ RNA是一類非經(jīng)典剪接方式、缺少多聚腺苷酸尾的內(nèi)源性閉環(huán)非編碼RNA,具有高度的穩(wěn)定性和保守性,在多種疾病特別是惡性腫瘤中常常異常表達(dá)[8-10]。研究發(fā)現(xiàn)，circTADA2A可在肺癌、骨肉瘤、結(jié)腸癌等多種惡性腫瘤中異常表達(dá)，對(duì)疾病有著一定的診斷價(jià)值[11-13]。但是circTADA2A在肝癌中的表達(dá)及作用還沒有明確，因此本研究主要探索circTADA2A在肝癌組織中的表達(dá)及其對(duì)肝癌細(xì)胞凋亡的影響。

1 資料與方法

1.1 一般資料 收集2019年10月至2020年12月入住我院的80例肝癌患者的相關(guān)資料，包括年齡、性別、腫瘤大小、腫瘤T分期、分化程度等臨床資料，同時(shí)采集患者距肝癌病灶約2 cm外的癌旁組織作為對(duì)照。納入標(biāo)準(zhǔn)：①診斷為原發(fā)性肝癌； ②尚未接受治療；③ 無高血壓、糖尿病等重大慢性疾??；排除標(biāo)準(zhǔn)：①病程已進(jìn)入晚期，并伴隨癌細(xì)胞大面積轉(zhuǎn)移；② 患者本人及家屬拒絕參與該研究。本研究經(jīng)本院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，患者均已知情同意并簽署知情同意書。

1.2 主要材料

名稱來源人肝癌HepG2細(xì)胞美國(guó)ATCC細(xì)胞庫pCDNA3.1-circTADA2A過表達(dá)質(zhì)粒上海生工pCNDA3.1空白質(zhì)粒上海生工RT-qPCR試劑盒日本TaKaRa公司Anti- Casapase3抗體美國(guó)CST公司Anti- GAPDH抗體美國(guó)CST公司反轉(zhuǎn)錄試劑盒日本TaKaRa公司circTADA2A及GAPDH引物上海生工Lip3000轉(zhuǎn)染試劑日本TaKaRa公司

1.3 RT-qPCR法檢測(cè)肝癌組織和癌旁組織的circularTADA2A表達(dá)水平 首先利用TRIzol法提取組織中的總RNA，分光光度計(jì)檢測(cè)RNA的濃度和純度。隨后進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄(RT-PCR)合成cDNA，反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系為：上游與下游隨機(jī)引物(10 pmol/L)各2 μl，dNTP(2 mM)4 μl,10×PCR butter 5 μl，Taq酶(2 u/uL)1 μl，加入水至體積為50 μl；主要程序?yàn)椋?5℃ 10 min,37℃ 60 min,70℃ 10 min。獲得cDNA后進(jìn)行qPCR，其中circTADA2A上游引物序列為：5′-TGTGCACCAAGACCTTCGAG-3′，circTADA2A下游引物序列5′-AGGAAGGCCTGAAGTAGTGA-3′;GAPDH上游引物序列為：5′-ACAGCATTCAGACCGGAGAG-3′,GAPDH下游引物序列5′-TTCAGGCCTGAAGTAGCAC-3′,采用2-△△Ct法計(jì)算 circTADA2A 的相對(duì)表達(dá)量。qPCR反應(yīng)體系為：2×SYBR Mixture(1×)25 μl，上游引物(10 μmol/L)1 μl，下游引物(10 μmol/L)1 μl，cDNA 2 μl，加入水至體積為50 μl；主要程序?yàn)椋?5℃ 5 min，95℃ 15s-60℃ 1 min-72℃ 30 s(35個(gè)循環(huán))，4℃ 5 min。

1.4 瞬時(shí)轉(zhuǎn)染circTADA2A過表達(dá)質(zhì)粒 培養(yǎng)人肝癌HepG2細(xì)胞2盤(100 cm2)，待達(dá)到50%～60%的密度，將1 μg空白質(zhì)粒和circTADA2A過表達(dá)質(zhì)粒分別與3 μl Lip3000轉(zhuǎn)染試劑預(yù)混，靜置15 min后加入人肝癌HepG2細(xì)胞，放置于5% CO2,37℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h。

1.5 Western blot檢測(cè)人肝癌HepG2細(xì)胞凋亡指標(biāo)Casapase3 收取轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞，裂解后提取蛋白，SDS-PAGE電泳60 min，半干轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)印120 min后，牛奶封閉60 min，抗體孵育，發(fā)光顯色檢測(cè)凋亡指標(biāo)Casapase3相對(duì)表達(dá)量。

2 結(jié)果

2.1 circTADA2A在肝癌組織及癌旁組織中的表達(dá) 見表1。

表1 circTADA2A在肝癌組織及癌旁組織中的表達(dá)比較

2.2 circTADA2A表達(dá)與肝癌組織臨床病理特征的關(guān)系 見表2。

表2 肝癌組織臨床病理特征與circTADA2A表達(dá)的關(guān)系

2.3 瞬時(shí)轉(zhuǎn)染質(zhì)粒的凋亡指標(biāo)Casapase3表達(dá) 將轉(zhuǎn)染空白質(zhì)粒和circTADA2A過表達(dá)質(zhì)粒的人肝癌HepG2細(xì)胞提取蛋白后，進(jìn)行Western blot檢測(cè)人肝癌HepG2細(xì)胞凋亡指標(biāo)Casapase3。結(jié)果顯示，circTADA2A過表達(dá)的HepG2細(xì)胞凋亡指標(biāo)Casapase3相對(duì)表達(dá)量明顯低于空白對(duì)照HepG2細(xì)胞(3.106±0.346<5.552±0.145，t=9.265，P=0.015)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見圖1。

A：空白質(zhì)粒組 B：circTADA2A過表達(dá)組

3 討論

近年來發(fā)現(xiàn)，環(huán)狀RNA是一類共價(jià)封閉的非編碼RNA，可調(diào)控真核生物的基因表達(dá)。環(huán)狀RNA在惡性腫瘤中?？僧惓１磉_(dá)，這可能為惡性腫瘤的臨床診斷和治療提供一定的幫助[14，15]。已發(fā)現(xiàn)環(huán)狀RNA TADA2A在肺癌、結(jié)腸癌及乳腺癌中呈異常表達(dá)，并且可以輔助多種惡性腫瘤的初步診斷和臨床治療[12,16，17]。但是環(huán)狀RNA TADA2A在肝癌中的表達(dá)及作用，還沒有被明確研究結(jié)果。

因此，本研究通過探索環(huán)狀RNA TADA2A在肝癌組織中的表達(dá)及其對(duì)肝癌細(xì)胞凋亡的影響來明確其在肝癌組織中的表達(dá)及臨床作用,以期對(duì)肝癌的臨床診斷和治療提供一定的幫助。本研究發(fā)現(xiàn)肝癌組織中環(huán)狀RNA TADA2A較癌旁組織表達(dá)明顯增高，且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。這說明在肝癌組織中，環(huán)狀RNA TADA2A有異常的高表達(dá)。與此同時(shí)，我們又發(fā)現(xiàn)環(huán)狀RNA TADA2A與腫瘤T分期和分化程度顯著相關(guān)，這說明RNA TADA2A表達(dá)高低與肝癌某些臨床病理特征相關(guān)。最后，我們發(fā)現(xiàn)，環(huán)狀 RNA TADA2A過表達(dá)的HepG2細(xì)胞凋亡指標(biāo)Casapase3相對(duì)表達(dá)量明顯低于空白對(duì)照HepG2細(xì)胞，這表明環(huán)狀 RNA TADA2A過表達(dá)可以抑制人肝癌HepG2細(xì)胞凋亡，這與肝癌組織中環(huán)狀 RNA TADA2A高表達(dá)相吻合。但是，本研究的患者例數(shù)較少，并且未指明環(huán)狀RNA TADA2A在肝癌中異常高表達(dá)的具體分子學(xué)機(jī)制。因此本研究有一定的局限性，有待于后續(xù)進(jìn)一步探索。

綜上，circTADA2A在肝癌組織中的高表達(dá)，并且與腫瘤T分期及分化程度呈顯著相關(guān)性，同時(shí)可以抑制人肝癌HepG2細(xì)胞凋亡，這為臨床上肝癌診斷和治療提供了一個(gè)新的思路。