唐秀麗 韓利峰 程秀蓮 趙 娜

張家口市第一醫(yī)院消化科 (河北 張家口， 075000)

肝癌是全球癌癥相關(guān)死因中主要原因，我國肝癌的發(fā)病率及死亡率都占全球50%以上[1]。乙型肝炎病毒(HBV)和丙型肝炎病毒(HCV)的慢性感染是肝癌的主要危險因素，其中HBV相關(guān)性肝癌占2/3以上。早期診治該病能及時阻斷病情的進展，從而促進改善患者的預(yù)后[2,3]。病理學(xué)活檢為該病診斷的金標準，但是為有創(chuàng)性檢查，而影像學(xué)診斷雖然有一定的敏感性，但是診斷特異性一直有待提高[4]。已有研究顯示乙型肝炎發(fā)展到乙型肝炎相關(guān)性肝癌是一個多步驟、多因素、多階段相互作用的復(fù)雜過程，涉及許多的基因與腫瘤標志物在不同節(jié)點的表達[5]。CEA、CA199等腫瘤標志物在一些惡性腫瘤的的診斷、病情判斷以及療效監(jiān)測方面具有一定臨床價值[6]。但由于HBV相關(guān)性肝癌在臨床癥狀體征、發(fā)病機制方面存在顯著個體差異，目前常規(guī)標志物種類雖多，檢測的特異性、敏感度均不甚理想，還需要尋找更加可靠、準確的腫瘤標記物，從而完全滿足臨床診斷的需要[7]。乳脂肪球表皮生長因子8蛋白(MFGE8)作為一種分泌性糖蛋白，在巨噬細胞、內(nèi)皮細胞、肌上皮細胞、樹突狀細胞等都有廣泛分布，但MFGE8分泌量較低[8]。MFGE8在腫瘤組織中表達明顯高于正常組織，其表達分布與病程長短密切相關(guān)，可能成為判斷腫瘤患者預(yù)后的特異性指標，但是在肝癌中的應(yīng)用還無相關(guān)報道。本文具體探討了HBV相關(guān)性肝癌臨床病理學(xué)特征與MFGE8表達的相關(guān)性，以明確HBV相關(guān)性肝癌的發(fā)生機制，促進早期檢出該病?，F(xiàn)總結(jié)報道如下。

1 資料與方法

1.1 研究對象 本研究得到了醫(yī)院倫理委員會的批準與所有入選患者的知情同意。選擇2014年8月到2018年5月在張家口市第一醫(yī)院消化科診治的HBV相關(guān)性肝癌患者123例作為研究對象。納入標準：無合并膽管細胞癌；經(jīng)病理確診為肝癌；首次發(fā)病；臨床與隨訪資料完整；術(shù)前未接受介入、射頻消融等任何有創(chuàng)性治療；臨床與病理資料完整。排除標準：合并HCV感染的患者；切緣陽性的患者；嚴重心、腎功能異常患者；臨床與病理資料缺乏者。

123例患者年齡50～78歲，平均年齡(58.22±3.19)歲；平均病程(4.11±0.82)年；平均體重指數(shù)(21.47±1.27)kg/m2；臨床分期：Ⅰ期65例，Ⅱ期35例，Ⅲ期23例；組織學(xué)分化：高分化67例，中分化42例，低分化14例；淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移45例；淋巴管癌栓44例。

1.2 免疫組化檢測MFGE8表達 免疫組化試劑盒購自福建邁新生物技術(shù)開發(fā)有限公司，MFGE8兔抗人多克隆抗體(工作濃度1∶200)購于Abcam生物技術(shù)有限公司。PBS代替一抗作為陰性對照，用已知的MFGE8陽性的惡性腫瘤組織切片為陽性對照。

取所有患者的病灶組織標本與癌旁組織標本，病灶組織標本均取自患者手術(shù)標本中，癌旁組織經(jīng)病理證實非腫瘤組織。存檔組織標本蠟塊應(yīng)用組織陣列儀打孔取材，每塊取兩點，切片機連續(xù)切片，厚度3 μm，65℃烤片4 h。按照免疫組化檢測試劑盒說明書所示步驟進行，切片經(jīng)檸檬酸緩沖液高壓抗原熱修復(fù)預(yù)處理。取出抗原修復(fù)盒，待修復(fù)液自然冷卻，PBS洗滌3次，把3% H2O2滴加在組織切片上，室溫靜置10 min；PBS洗滌3次，滴加正常山羊血清封閉液，室溫10～15 min。滴加抗MFGE8抗體2 μl，置于濕盒內(nèi)，4℃過夜。PBS洗滌3次，滴加復(fù)合二抗2 μl，室溫靜置20 min；PBS洗滌3次后DAB顯色3～5 min；蘇木精復(fù)染，脫水、透明、中性樹膠封片，鏡檢。

MFGE8陽性為以胞漿或胞核中顯示棕黃色顆粒，各選取5個高倍鏡視野(×400)作陽性細胞計數(shù)，判斷標準為陽性細胞數(shù)≤10%為陰性，>10%為陽性。

1.3 Western blot檢測MFGE8蛋白表達 取肝癌組織組織，加入RIPA組織裂解液，對組織進行打碎處理通過勻漿器，時長為5 min的冰浴處理；13 000 r/min離心處理，時長為10 min，取上清，進行蛋白濃度定量檢測后對蛋白進行稀釋。后進行蛋白分離，腹膜，室溫下進行封閉處理(TBST液，5%)，時長為2 h，后在對應(yīng)1∶1 000一抗稀釋液中孵育PVDF膜，第2日取出，TBST液洗滌，加入1∶10 000二抗，2 h孵育，加發(fā)光液DAB，凝膠成像儀記錄灰度值，β-Actin為內(nèi)參，計算目的蛋白相對表達。

1.4 調(diào)查資料 調(diào)查所有患者的一般資料，包括性別、年齡、體重指數(shù)、糖尿病史、高血壓病史、病程、Child-Pugh分級、吸煙史、飲酒史等。記錄所有患者的實驗室檢查結(jié)果數(shù)據(jù)，包括谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)、谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)、谷氨酰氨基轉(zhuǎn)移酶(GGT)、乳酸脫氫酶(LDH)、堿性磷酸酶(ALP)、甲胎蛋白(AFP)、癌胚抗原(CEA)、腫瘤抗原199(CA199)等?；颊叩呐R床病理學(xué)特征指標包括臨床分期、組織學(xué)分化、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、癌栓等。從術(shù)后病檢確診日期開始，到患者死亡或隨訪截止日期為止，隨訪截止日期為2019年5月31日。

1.5 統(tǒng)計學(xué)方法 在統(tǒng)計分析時應(yīng)用的軟件是SPSS 22.00，通過百分比以及均數(shù)±標準差來表示計量數(shù)據(jù)與計數(shù)數(shù)據(jù)，χ2檢驗和獨立樣本t檢驗來進行對比，相關(guān)性分析應(yīng)用的是直線相關(guān)分析，多因素采用Logistic回歸分析，檢驗水準α<0.05。

2 結(jié)果

2.1 臨床特征 在123例患者中，Child-Pugh分級為A級73例，B級50例；糖尿病史32例、高血壓病史25例、吸煙史54例、飲酒史43例。

入院隔日凌晨抽取患者空腹靜脈血2～4 ml檢測實驗室指標：ALT(78.24±11.59)IU/L，AST(67.21±12.04)IU/L，GGT(118.03±22.71)IU/L，LDH(220.19±32.71)IU/L，ALP(132.19±34.19)U/L，AFP(872.71±128.29)μg/L，CEA(4.92±0.31)mg/L，CA(199 58.22±14.29)U/ml。

2.2 MFGE8表達比較 病灶組織的MFGE8表達陽性率為54.5%，顯著高于癌旁組織的2.4%(P<0.05)。見圖1。

圖1 人肝癌組織與癌旁組織中MFGE8表達

2.3 MFGE8表達與臨床病理特征的相關(guān)性 在123例患者中，不同年齡、吸煙史、組織學(xué)分化、臨床分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、癌栓患者的MFGE8表達陽性率對比差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見表1。

表1 患者一般資料、不同病理特征HBV相關(guān)性肝癌的MFGE8表達陽性率 (n)

2.4 相關(guān)性分析 直線相關(guān)分析顯示患者的MFGE8表達與組織學(xué)分化、臨床分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、癌栓、吸煙、AFP成顯著相關(guān)性(P<0.05)。見表2。

2.5 預(yù)后情況 所有患者隨訪到2019年5月，平均隨訪時間(31.72±2.28)個月，123例患者中死亡65例，死亡率為52.85%。

表2 HBV相關(guān)性肝癌患者MFGE8表達與其他指標的相關(guān)性 (n=123)

2.6 影響因素分析 在123例患者中，以患者隨訪預(yù)后是否死亡作為因變量，進行二元Logistic回歸分析。顯示MFGE8、組織學(xué)分化、吸煙等為影響患者預(yù)后死亡的主要危險因素(P<0.05)。見表3。

表3 影響HBV相關(guān)性肝癌患者預(yù)后死亡的因素 (n=123)

3 討論

肝癌為臨床上常見的惡性腫瘤之一，惡性程度高，預(yù)后差。HBV相關(guān)性肝癌是原發(fā)性肝癌中的一種最主要類型，所占比例在90%以上，在我國東南沿海地區(qū)高發(fā)，可發(fā)生于任何年齡段，其中以40～50歲為多見[9]。手術(shù)切除為HBV相關(guān)性肝癌最主要的治療手段，同時也是患者有望長期生存獲益最有效的措施。但是很多患者起病隱匿，早期缺乏典型癥狀，入院就診時往往已處于中晚期，且肝功能差，伴有癌栓與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況，使得根治性手術(shù)切除受到極大的限制，導(dǎo)致預(yù)后死亡率很高[10]。

在HBV相關(guān)性肝癌的檢出與預(yù)測預(yù)后中，影像學(xué)檢查應(yīng)用比較多，但是能反映出的只是形態(tài)學(xué)變化及病變大小，與患者的病理特征無顯著相關(guān)性[11]。AFP是肝臟疾病的特異檢查，然而并不是HBV相關(guān)性肝癌的特異性指標，其對該病的檢出具有一定幫助，但效果并不顯著[12]。MFGE8是一種存在于多種物種乳汁脂肪小球表面的親脂性糖蛋白，主要由膽固醇、磷脂、糖蛋白、蛋白脂構(gòu)成，主要由分化的乳腺上皮細胞合成，然后經(jīng)膜包被分泌人乳導(dǎo)管腔。MFGE8在乳腺癌細胞中發(fā)現(xiàn)MFGE8的分泌量顯著提高，可通過辨認暴露于凋亡上皮細胞表面的絲氨酸與凋亡的上皮細胞結(jié)，從而加快對凋亡細胞的清除[13]。MFGE8在惡性腫瘤的高表達還可抑制輪狀病毒促進凋亡上皮細胞的清除，從而促進腫瘤細胞的快速增殖與轉(zhuǎn)移[14]。本研究顯示病灶組織的MFGE8表達陽性率顯著高于癌旁組織；不同組織學(xué)分化、臨床分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、癌栓患者的MFGE8表達陽性率對比差異有統(tǒng)計學(xué)意義；直線相關(guān)分析顯示患者的MFGE8表達與組織學(xué)分化、臨床分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、癌栓、吸煙、AFP成顯著相關(guān)性。從機制上分析，MFGE8可以通過調(diào)節(jié)NF-kB、P53等多種轉(zhuǎn)錄因子與DNA的結(jié)合能力，加快血管內(nèi)皮生長因子的表達量，從而促進腫瘤細胞快速增長[15]。并且MFGE8可通過促使DNA前體合成、抑制由細胞黏附促發(fā)的應(yīng)激信號等多種途徑促進腫瘤細胞的增殖及生長[16]。

HBV相關(guān)性肝癌的惡性程度高、病情進展快、預(yù)后差，尋找有效的臨床病理指標在判斷該病患者的預(yù)后時具有重要價值[17]。本研究123例患者死亡率為52.85%；二元Logistic回歸分析顯示MFGE8、組織學(xué)分化、吸煙等為影響患者預(yù)后死亡的主要因素。從機制上分析，MFGE8的高表達通過結(jié)合腫瘤細胞膜上磷脂酰絲氨酸，促進細胞向前移動爬行，導(dǎo)致細胞的形態(tài)及骨架結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，從而加速細胞的侵襲，并且還通過增強對抗癌藥物的耐藥作用影響患者的預(yù)后[18]。并且MFGE8還可激活巨噬細胞和T淋巴細胞，改變胰島素敏感性，導(dǎo)致胰島素抵抗，促進惡性腫瘤細胞的增殖[19,20]。不過MFGE8在HBV相關(guān)性肝癌中的作用有一定的復(fù)雜性，在某種意義上從臨床組織得到的病理標本無法真實反映出MFGE8的表達譜。再者限于患者數(shù)量少及收集標本時間較短的原因，本次研究只納入了較少的病例，可能存在一定的研究偏倚，將在下一步進行深入分析。

總而言之，HBV相關(guān)性肝癌組織中MFGE8呈現(xiàn)高表達狀況，與患者的臨床病理特征顯著相關(guān)，也是影響患者預(yù)后死亡的主要因素。