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        鼎湖血桐的酚性成分研究

        2022-11-28 03:01:16孫振宇陳源思張興杰張芮菡李宏亮肖偉烈李曉莉

        孫振宇,陳源思,張興杰,張芮菡,李宏亮,肖偉烈,李曉莉

        (云南大學(xué) 教育部自然資源藥物化學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,云南省天然產(chǎn)物轉(zhuǎn)化與應(yīng)用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,云南大學(xué) 化學(xué)科學(xué)與工程學(xué)院/醫(yī)學(xué)院,云南 昆明 650091)

        據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道,血桐屬植物很多具有藥用價(jià)值,如抗腫瘤、抗炎等功效,富含異戊烯基黃酮、二苯乙烯衍生物、香豆素和甾體等多種結(jié)構(gòu)類型化學(xué)成分[1-2].鼎湖血桐(Macaranga sampsonii)是大戟科(Euphorbiaceae)血桐屬植物,國(guó)內(nèi)主要分布在福建西部和南部、廣東、廣西中部和南部,海拔200~500(~800)m 的山地或山谷常綠闊葉林中[3].李曉花等[4]從采自廣東的鼎湖血桐枝葉中得到了異戊烯基黃酮類化合物,Quynh等[5]從越南產(chǎn)的鼎湖血桐果實(shí)中分離得到了糖苷和香豆素等成分.本課題組在血桐屬植物的研究方面積累了豐富的經(jīng)驗(yàn)[6-10],在此基礎(chǔ)上,我們對(duì)采自云南的鼎湖血桐枝葉的化學(xué)成分進(jìn)行了系統(tǒng)研究,從中分離得到了13 個(gè)酚性成分.分別鑒定為:香葉木素(1)[11]、蜜橘素(2)[12]、川陳皮素 (3)[12]、5,4′-二羥基-3,6,7-三甲氧基黃酮 (4)[13]、貓眼草酚D (5)[14]、甘草苷元 (6)[15]、表兒茶素(7)[16]、兒茶素 (8)[16]、異甘草苷元 (9)[17]、根皮素 (10)[18]、根皮苷 (11)[18]、反式白藜蘆醇-3-Oβ-D-吡喃葡萄糖苷(12)[19]、厚樸酚 (13)[20],均為首次在該植物中分離得到,化合物結(jié)構(gòu)見(jiàn)圖1.

        圖1 化合物的結(jié)構(gòu)Fig.1 Structures of the compounds

        我們對(duì)分離得到的所有化合物進(jìn)行了抗腫瘤活性測(cè)試,其中化合物4 和13 對(duì)MCF-7 和HCT-116 腫瘤細(xì)胞株表現(xiàn)出一定的抑制活性.

        1 儀器與材料

        AV-400、AV-Ⅲ-600 HD 核磁共振儀(德國(guó)Bruker 公司);旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(東京理化公司);薄層層析分析GF254型硅膠板、0.054~0.077 mm(200~300 目)柱色譜硅膠、0.172~0.216 mm(80~100 目)柱色譜硅膠(青島海洋化工有限公司);75~150 μm MCI 填料(日本三菱化工公司);Sephadex LH-20(瑞士Pharmacia 公司);Agilent1260 分析型高效液相色譜、Zorbax SB-C18(φ9.4 mm×250 mm)半制備柱、Zorbax SB-C18(φ4.6 mm×250 mm)分析柱(美國(guó)Agilent 公司);色譜純乙腈溶劑(CINC 公司);UPLC-IF-TOF 質(zhì)譜儀(美國(guó)Agilent 公司);所用溶劑均為分析純(昆明騰科科技有限公司).

        鼎湖血桐于2013 年采自云南省紅河州綠春縣,標(biāo)本保存于云南大學(xué)教育部自然資源藥物化學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室.

        2 提取與分離

        鼎湖血桐干燥枝葉 20 kg,粉碎后用80%甲醇/水溶液室溫浸提3次,每次72 h,提取液濃縮后,用乙酸乙酯萃取3次,得到乙酸乙酯部分浸膏551 g.浸膏采用硅膠柱色譜,以氯仿-丙酮-甲醇(體積比100∶0∶0→0∶0∶100)的比例進(jìn)行梯度洗脫,得到A、B 和C 等3 個(gè)餾分段.

        對(duì)B 餾分段用MCI 填料進(jìn)行反相劃段的同時(shí),除去葉綠素,以甲醇-水為洗脫劑,得到B1~B8 共計(jì)8 個(gè)組分.

        組分B1 經(jīng)LH-20 凝膠柱用甲醇洗脫,得到3個(gè)組分B1a、B1b 和B1c.B1a 經(jīng)過(guò)0.172~0.216 mm硅膠柱色譜多次分離純化,得到化合物4(15.0 mg)和5(2.2 mg).B1b 組分用MCI 反相填料,以甲醇-水為洗脫劑,析出2 個(gè)晶體,運(yùn)用重結(jié)晶和半制備HPLC,獲得化合物1(2.2 mg)和6(2.8 mg).B1c 段經(jīng)過(guò)硅膠柱,反復(fù)富集,得到化合物2(2.1 mg)和3(5.0 mg).

        B2 餾分段通過(guò)硅膠柱,運(yùn)用不同的洗脫體系,反復(fù)純化,分得化合物11(2.0 mg)和12(3.2 mg).

        組分B6 經(jīng)硅膠柱,用氯仿-甲醇(體積比50∶1→0∶1)洗脫,用TLC 檢測(cè),合并相同組分,得到B6a、B6b 和B6c 等3 個(gè)餾分段.B6a 段用LH-20 凝膠柱,以甲醇為溶劑洗脫,再通過(guò)0.054~0.077 mm 硅膠為填料的柱色譜,反復(fù)純化富集,分到化合物7(3.0 mg)和8(2.3 mg).

        B8 組分用0.054~0.077 mm 硅膠為填料,以氯仿-甲醇(體積比50∶1→0∶1)為洗脫劑進(jìn)行梯度洗脫,合并相同組分,得到B8a 和B8b 兩個(gè)部分.組分B8a 經(jīng)過(guò)LH-20 凝膠柱和硅膠柱,運(yùn)用不同的洗脫劑,多次純化,分得化合物9(2.3 mg)、10(4.4 mg)和13(1.4 mg).

        3 結(jié)構(gòu)鑒定

        化合物1:淡黃色晶體,C16H12O6.m.p.252~253 ℃;1H NMR (600 MHz,DMSO-d6)δ: 12.94 (s,1H,5-OH),10.86 (s,1H,7-OH),9.47 (s,1H,3′-OH),7.55 (dd,J=8.4,2.3 Hz,1H,H-6′),7.43 (d,J=2.2 Hz,1H,H-2′),7.09 (d,J=8.5 Hz,1H,H-5′),6.79~6.73 (s,1H,H-3),6.47 (d,J=2.2 Hz,1H,H-8),6.21 (d,J=2.3 Hz,1H,H-6),3.87 (s,3H,4′-OCH3);13C NMR (150 MHz,DMSO-d6)δ: 182.2 (s,C-4),164.64 (s,C-7),164.0 (s,C-2),162.0 (s,C-9),157.8(s,C-5),151.6 (s,C-4′),147.3 (s,C-3′),123.5 (s,C-1′),119.2 (d,C-6′),113.4 (d,C-2′),112.7 (d,C-5′),104.2 (s,C-10),104.0 (d,C-3),99.3 (d,C-6),94.4(d,C-8),56.2 (q,4′-OCH3).以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[11]對(duì)比,鑒定為香葉木素.

        化合物2:白色粉末,C20H20O7.m.p.153~154 ℃;1H NMR (400 MHz,Methanol-d4)δ: 7.99~7.91 (d,J=8.4 Hz,2H,H-2′/H-6′),7.12~7.06 (J=8.4 Hz,2H,H-3′/H-5′),6.65 (s,1H,H-3),4.10 (s,3H,5-OCH3),4.01 (s,3H,7-OCH3),3.92 (s,3H,6-OCH3),3.88 (overlap,6H 4′-OCH3/3′-OCH3);13C NMR (100 MHz,Methanol-d4)δ: 178.2 (s,C-4),162.9 (s,C-2),162.4 (s,C-4′),151.9 (s,C-9),147.9 (s,C-5),147.8(s,C-7),144.2 (s,C-6),138.3 (s,C-8),127.7 (d,C-2′/C-6′),123.1 (s,C-1′),114.3 (d,C-3′/C-5′),114.0(s,C-10),105.3 (d,C-3),61.2 (q,5-OCH3),61.2 (q,7-OCH3),60.8 (q,6-OCH3),60.8 (q,4′-OCH3),54.6(q,3′-OCH3).以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[12]對(duì)比,鑒定為蜜橘素.

        化合物3:白色粉末,C21H22O8.m.p.135~136 ℃;1H NMR (400 MHz,Methanol-d4)δ: 7.61 (d,J=8.4 Hz,1H,H-2′),7.49 (s,1H,H-6′),7.09 (d,J=8.4 Hz,1H,H-5′),6.66 (s,1H,H-3),4.10 (s,3H,5-OCH3),4.02 (s,3H,6-OCH3),3.96~3.77 (m,12H,7-OCH3,8-OCH3,3′-OCH3,4′-OCH3);13C NMR (100 MHz,Methanol-d4)δ: 178.1 (s,C-4),162.1 (s,C-2),152.5(s,C-4′),151.9 (s,C-7),149.4 (s,C-5′),148.0 (s,C-9),147.7 (s,C-5),144.2 (s,C-6),138.1 (s,C-8),123.3 (s,C-1′),119.7 (d,C-2′),113.9 (s,C-10),111.3 (d,C-3′),108.7 (d,C-6′),105.5 (d,C-3),61.2(q,5-OCH3),61.2 (q,6-OCH3),60.8 (q,7-OCH3),60.8 (q,8-OCH3),55.1 (q,3′-OCH3),55.1 (q,4′-OCH3).經(jīng)過(guò)與文獻(xiàn)[12]進(jìn)行數(shù)據(jù)對(duì)比,確定化合物3 的結(jié)構(gòu)為川陳皮素.

        化合物4:黃色固體,C18H16O8.m.p.235~236 ℃;1H NMR (400 MHz,Acetone -d6)δ: 12.71 (s,1H,5-OH),7.73 (dd,J=2.0 Hz,1H,H-2′),7.60 (dd,J=8.1,2.1 Hz,1H,H-6′),7.01 (dd,J=8.1,2.1 Hz,1H,H-5′),6.74 (s,1H,H-8),3.97 (s,3H,7-OCH3),3.87 (s,3H,3-OCH3),3.80 (s,3H,6-OCH3);13C NMR (100 MHz,Acetone -d6)δ: 178.8 (s,C-4),159.1 (s,C-7),156.0 (s,C-2),152.6 (s,C-5),152.2 (s,C-9),148.2(s,C-4′),145.0 (s,C-3′),138.3 (d,C-3),132.2 (d,C-6),122.1 (s,C-1′),121.3 (d,C-6′),115.5 (d,C-5′),115.4 (d,C-2′),106.1 (s,C-10),90.7 (d,C-8),,59.7(q,7-OCH3),59.3 (q,3-OCH3),55.9 (q,6-OCH3).以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[13]對(duì)比,鑒定為5,4′-二羥基-3,6,7-三甲氧基黃酮.

        化合物5:淡黃色粉末,C18H16O7.m.p.214~215 ℃;1H NMR (400 MHz,Pyridine-d5)δ: 8.21 (dd,J=8.4,2.0 Hz,2H,H-2′/H-6′),7.30 (dd,J=8.4,2.0 Hz,1H,H-3′/H-5′),6.71 (s,1H,H-8),4.00 (s,3H,3-OCH3),3.97 (s,3H,6-OCH3),3.90 (s,3H,7-OCH3);13C NMR (100 MHz,Pyridine-d5)δ: 179.0 (s,C-4),161.7 (s,C-4′),159.2 (s,C-7),156.5 (s,C-9),153.0(s,C-5),152.4 (s,C-2),138.4 (d,C-3),148.2 (s,C-4′),145.0 (s,C-3′),132.6 (d,C-6),130.8 (d,C-2′/C-6′),121.4 (s,C-1′),115.5 (d,C-5′),116.3 (d,C-3′/C-5′),106.6 (s,C-10),91.1 (d,C-8),60.7 (q,3-OCH3),59.7 (q,6-OCH3),56.2 (q,7-OCH3).以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[14]對(duì)比,與貓眼草酚D 的數(shù)據(jù)一致.

        化合物6:黃色粉末,C15H12O4.m.p.181~182 ℃;1H NMR (400 MHz,Methanol-d4)δ: 7.75 (d,J=8.7 Hz,1H,H-5),7.38~7.30 (d,J=8.4 Hz,2H,H-2′/H-6′),6.88~6.81 (d,J=8.4 Hz,2H,H-3′/H-5′),6.52(dd,J=8.7,2.2 Hz,1H,H-6),6.37 (d,J=2.2 Hz,1H,H-8),5.38 (dd,J=13.1,2.9 Hz,1H,H-2),3.07 (dd,J=17.0,2.9 Hz,1H,H-3a),2.70 (dd,J=17.0,2.9 Hz,1H,H-3b);13C NMR (100 MHz,Methanol-d4)δ:192.2 (s,C-4),165.4 (s,C-7),164.2 (s,C-9),157.6(s,C-4′),129.9 (s,C-1′),128.5 (d,C-5),127.6 (d,C-2′/C-6′),114.9 (d,C-3′/C-5′),113.6 (s,C-1′),110.4(d,C-6),102.4 (d,C-8),79.6 (d,C-2),43.5 (t,C-3).以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[15]對(duì)比,鑒定為甘草苷元.

        化合物7:白色粉末,C15H14O6.m.p.235~236 ℃;1H NMR (600 MHz,Methanol-d4)δ: 6.97 (d,J=1.9 Hz,1H,H-2′),6.79 (dd,J=8.1,2.0 Hz,1H,H-6′),6.75 (d,J=8.1 Hz,1H,H-5′),5.94 (d,J=2.0 Hz,1H,H-8),5.91 (d,J=2.0 Hz,1H,H-8),4.81 (s,1H,H-2),4.17 (d,J=4.1 Hz,1H,H-3),2.86 (dd,J=16.7,4.6 Hz,1H,H-4a),2.73 (dd,J=16.8,3.0 Hz,1H,H-4b);13C NMR (150 MHz,Methanol-d4)δ: 156.6 (s,C-7),156.3 (s,C-5),156.0 (s,C-9),144.6 (s,C-4′),144.4(s,C-3′),130.9 (s,C-1′),118.0 (d,C-5′),114.5 (d,C-6′),114.0 (d,C-2′),98.7 (s,C-10),95.1 (d,C-6),94.5 (d,C-8),78.5 (d,C-2),66.1 (d,C-3),27.9 (t,C-4).以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[16]對(duì)比基本相同,因此鑒定為表兒茶素.

        化合物8:白色粉末,C15H14O6.m.p.213~214 ℃;1H NMR (400 MHz,Acetone-d6)δ: 8.34 (s,1H,5-OH),8.15 (s,1H,7-OH),8.01 (s,2H,3′-OH/4′-OH),6.91 (d,J=1.9 Hz,1H,H-2′),6.83-6.75 (dd,J=8.1,2.0 Hz,2H,H-6′/H-4a),6.04 (d,J=8.1 Hz,1H,H-5′),5.89 (d,J=2.3 Hz,1H,H-8),4.58 (d,J=7.7 Hz,1H,H-2),4.09 (d,J=4.8 Hz,1H,H-3),2.93 (dd,J=16.1,5.5 Hz,1H,H-10),2.55 (dd,J=16.1,8.4 Hz,1H,H-4b);13C NMR (100 MHz,Acetone-d6)δ: 156.8(s,C-5),156.3 (s,C-7),156.0 (s,C-9),144.8 (s,C-4′),144.8 (s,C-3′),131.2 (s,C-1′),119.2 (d,C-6′),114.8 (d,C-5′),114.4 (d,C-2′),99.7 (s,C-10),95.3(d,C-6),94.5 (d,C-8),81.8 (d,C-2),67.5 (d,C-3),27.9 (t,C-4).以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[16]對(duì)比,數(shù)據(jù)與兒茶素基本相同,鑒定為兒茶素.

        化合物9:黃色粉末,C15H12O4.m.p.197~198 ℃;1H NMR (600 MHz,Acetone-d6)δ: 13.53 (s,1H,4-OH),9.18 (s,2H,4′-OH/6′-OH),7.99 (d,J=8.9 Hz,1H,H-2′),7.71 (d,J=15.3 Hz,1H,H-β),7.62 (d,J=15.3 Hz,1H,H-α),7.62~7.59 (d,J=8.2 Hz,2H,H-2/H-6),6.83~6.78 (d,J=8.2 Hz,2H,H-3/H-5),6.34(dd,J=8.9,2.4 Hz,1H,H-3′),6.25 (d,J=2.4 Hz,1H,H-5′);13C NMR (150 MHz,Acetone-d6)δ: 192.0 (s,C=O),166.7 (s,C-4′),164.7 (s,C-2′),160.2 (s,C-4),144.3 (d,C-β),132.4 (d,C-6′),130.9 (d,C-2/C-6),126.7 (s,C-1),117.4 (d,C-α),115.9 (d,C-3/C-5),113.6 (s,C-1′),107.8 (d,C-5′),102.9 (d,C-3′).以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[17]中異甘草苷元對(duì)比基本一致,鑒定為異甘草苷元.

        化合物10:黃色粉末,C15H14O5.m.p.262~263℃;1H NMR (600 MHz,Methanol-d4)δ: 7.09~7.02(d,J=8.2 Hz,2H,H-2/H-6),6.75~6.69 (d,J=8.2 Hz,2H,H-3/H-5),5.83 (d,J=2.1 Hz,2H,H-3′/H-5′),3.31~3.25 (t,J=7.9 Hz,2H,H-β),2.85 (t,J=7.9 Hz,2H,H-α);13C NMR (150 MHz,Methanol-d4)δ: 205.1(s,C=O),164.7 (s,C-2′),164.4 (s,C-4′/C-6′),155.0(s,C-4),132.7 (s,C-1),128.9 (d,C-2/C-6),114.7(d,C-3/C-5),104.0 (s,C-1′),94.4 d,C-3′/C-5′,45.9(t,C-α),30.1 (t,C-β).以上數(shù)據(jù)經(jīng)過(guò)與文獻(xiàn)[18]對(duì)比,鑒定為根皮素.

        化合物11:白色粉末,C21H24O10.m.p.107~108 ℃;1H NMR (400 MHz,Methanol-d4)δ: 7.12~7.05 (d,J=7.6 Hz,2H,H-3′/H-5′),6.75~6.68 (d,J=7.6 Hz,2H,H-2′/H-6′),6.20 (d,J=2.2 Hz,1H,H-5),5.98 (d,J=2.2 Hz,1H,H-3),5.06 (d,J=7.1 Hz,1H,H-1′),3.93 (dd,J=12.1,2.0 Hz,1H,H-αa),3.74(dd,J=12.1,5.3 Hz,1H,H-αb),3.55~3.30 (m,6H,H-2′/H-3′/H-4′/H-5′/H-6′),2.90 (t,J=7.6 Hz,2H,H-β);13C NMR (100 MHz,MeOD)δ:205.2 (s,C=O),166.1 (s,C-2),164.5 (s,C-4),160.9 (s,C-6),154.9(s,C-4′),132.5 (s,C-1′),129.0 (d,C-2′/C-6′),114.7(d,C-3′/C-5′),105.4 (s,C-1),100.7 (d,C-1′),97.0(d,C-3),94.1 (d,C-5),77.1 (d,C-3′),77.0 (d,C-5′),73.3 (d,C-2′),69.7 (d,C-4′),61.0 (t,C-6′),45.6 (t,C-α),29.4 (t,C-β).以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[18]對(duì)比,鑒定為根皮苷.

        化合物12:白色粉末,C22H26O6.m.p.223~224 ℃;1H NMR (400 MHz,Methanol-d4)δ: 7.38 (d,J=8.6 Hz,2H,H-2/H-6′),7.04 (d,J=16.3 Hz,1H,Hβ),6.87 (d,J=16.3 Hz,1H,H-α),6.83~6.77 (m,3H,H-3′/H-5′/H-2),6.64 (t,J=1.8 Hz,1H,H-6),6.48 (t,J=2.2 Hz,1H,H-4),3.95 (dd,J=12.0,2.1 Hz,1H,H-1′),3.78~3.71 (m,1H,H-6′a),3.54~3.31 (m,5H,H-2′/H-3′/H-4′/H-5′/H-6′b);13C NMR (100 MHz,Methanol-d4)δ: 159.05 (s,C-3),158.2 (s,C-5),157.0 (s,C-4′),140.0 (s,C-1),128.9 (s,C-1′),128.6(d,C-8),127.5 (d,C-2′/C-6′),125.3 (d,C-7),115.1(d,C-3′/C-5′),107.0 (d,C-6),105.7 (d,C-4),102.7(d,C-2),101.0 (d,C-1′),76.8 (d,C-5′),76.6 (d,C-3′),73.6 (d,C-2′),70.1 (d,C-4′),61.2 (t,C-6′).以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[19]對(duì)比,鑒定為反式白藜蘆醇-3-O-β-D-吡喃葡萄糖苷.

        化合物13:白色粉末,C18H18O2.m.p.102~103℃;1H NMR (400 MHz,Methanol-d4)δ: 7.11~6.95(d,J=8.4 Hz,4H,H-4/H-4′/H-6/H-6′),6.89 (t,J=8.4 Hz,2H,H-3/H-3′),6.07~5.87 (m,2H,H-8/H-8′),5.10~4.77 (m,6H,H-9/H-9′/H-7a/H-7′b),3.34 (m,2H,H-7b/H-7′b);13C NMR (100 MHz,Methanol-d4)δ: 151.9 (s,C-2/C-2′),138.0 (d,C-8/C-8′),131.8 (s,C-5/C-5′),131.3 (d,C-6/C-6′),128.4 (d,C-4/C-4′),126.3 (s,C-1/C-1′),116.0 (d,C-3/C-3′),114.2 (t,C-9/C-9′),39.1 (t,C-7/C-7′).以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[20]對(duì)比,鑒定為厚樸酚.

        4 抗腫瘤活性測(cè)試

        4.1 細(xì)胞培養(yǎng)

        4.1.1 細(xì)胞復(fù)蘇 ①快速?gòu)囊旱拗邪褍龃婀苋〕?,立即轉(zhuǎn)入37 ℃水浴鍋中;②用紙擦干凍存管表面的水滴并用酒精消毒后移至超凈工作臺(tái)中;③用無(wú)菌吸管將細(xì)胞懸液移至15 mL 離心管內(nèi),1 500 r/min 離心5 min,取出離心管,棄上層凍存液;④ 加入1 mL 培養(yǎng)基輕輕重懸細(xì)胞,將細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移至100 mm 細(xì)胞培養(yǎng)皿中,再加入9 mL 完全培養(yǎng)基;⑤ 按十字交叉法將細(xì)胞搖晃均勻,培養(yǎng)皿上標(biāo)記細(xì)胞類型、操作者、時(shí)間,放入37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱進(jìn)行培養(yǎng);⑥細(xì)胞培養(yǎng)24 h 以后,在倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài),若懸浮細(xì)胞較多的話可以進(jìn)行細(xì)胞換液,用巴氏管吸取PBS 緩沖液清洗細(xì)胞,更換新鮮培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng).

        4.1.2 細(xì)胞傳代 ①待細(xì)胞生長(zhǎng)至覆蓋培養(yǎng)皿底部80%~90%,即可傳代;②提前把傳代用到的完全培養(yǎng)基、PBS 緩沖液、胰酶放入水浴鍋預(yù)熱5 min,用紙擦干瓶子表面的水滴并用酒精消毒后移至超凈工作臺(tái)中,待用;③取原代細(xì)胞入超凈工作臺(tái),吸掉原培養(yǎng)基,用巴氏管吸取4 mL PBS 緩沖液清洗細(xì)胞,吸掉PBS 緩沖液;④加入2 mL 胰蛋白酶消化細(xì)胞,消化2 min后,用移液槍吹打細(xì)胞,當(dāng)全部細(xì)胞被吹吸下來(lái)以后,再用槍頭吹打底部細(xì)胞數(shù)次(防止細(xì)胞聚集)使細(xì)胞懸浮,加入4 mL 的完全培養(yǎng)基終止消化(V(胰酶)∶V(培養(yǎng)基)=1∶2),用槍吹勻;⑤ 取用新的培養(yǎng)皿標(biāo)注上細(xì)胞名稱、日期、姓名,用槍吸取1mL 細(xì)胞懸液于新培養(yǎng)皿,加入9 mL 新鮮完全培養(yǎng)基(1∶6 傳代)或用槍吸取2 mL 細(xì)胞懸液于新培養(yǎng)皿,加入8 mL 新鮮完全培養(yǎng)基(1∶3 傳代)或用槍吸取3 mL 細(xì)胞懸液于新培養(yǎng)皿,加入7 mL 新鮮完全培養(yǎng)基傳代,一般至少傳2 皿備用,按十字交叉法輕輕將細(xì)胞搖晃均勻,放入培養(yǎng)箱中,常規(guī)方法進(jìn)行培養(yǎng).

        4.1.3 細(xì)胞凍存 ①把用胰酶消化過(guò)的細(xì)胞用巴氏管吸進(jìn)15 mL 離心管中,1 500 r/min 離心5 min使細(xì)胞沉淀;②棄上清液后,加入適量的細(xì)胞凍存液懸浮細(xì)胞,用巴氏管將細(xì)胞吹勻,分裝至滅菌的2 mL 凍存管中,于凍存管壁標(biāo)注細(xì)胞種類、凍存日期;③置于–80 ℃冰箱凍存過(guò)夜后,再移至液氮罐中長(zhǎng)期保存.

        4.2 細(xì)胞活力測(cè)定

        (1)4 mL PBS 緩沖液清洗細(xì)胞,2 mL 胰酶消化,4 mL 完全培養(yǎng)基中止,滴加10 μL 在計(jì)數(shù)板上計(jì)數(shù),MCF-7 和HCT-116 細(xì)胞以5×103個(gè)/孔的濃度接種在96 孔板中,放置培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h;

        (2)按細(xì)胞加藥的方法配置各種濃度的化合物4 和13 及陽(yáng)性對(duì)照物順鉑(cisplatin)(0,4,8,16,32,64 μmol/L),處理細(xì)胞 24 h.根據(jù)制造商的說(shuō)明書使用CCK-8 試劑盒評(píng)估細(xì)胞活力.將CCK-8 溶液(10 μL)加入每個(gè)孔中并在37 ℃下在黑暗中溫育1.5 h.在酶標(biāo)儀上以450 nm 吸光度讀取光密度(OD).

        4.3 結(jié)論我們對(duì)分離得到的13 個(gè)化合物,進(jìn)行了抗腫瘤活性篩選.實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,化合物4 和13對(duì)MCF-7 和HCT-116 細(xì)胞株,顯示了一定的抑制活性.見(jiàn)表1.

        表1 化合物的IC50 (μmol/L)

        5 討論

        本實(shí)驗(yàn)從云南產(chǎn)鼎湖血桐的枝葉中分離鑒定了13 個(gè)酚性成分,均為首次在該植物中分離得到,沒(méi)有得到該屬植物中報(bào)道較多的異戊烯基取代的黃酮類結(jié)構(gòu),說(shuō)明不同產(chǎn)地和不同采集部位的植物,在化學(xué)成分方面也會(huì)存在差異,可以為該屬植物的化學(xué)分類學(xué)研究提供一定的理論支持.通過(guò)抗腫瘤活性篩選,化合物4 和13 顯示了一定的抗腫瘤活性,豐富了該屬植物的藥理活性研究?jī)?nèi)容.

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