唐光美，楊馨語，張小樂，李弘星，李蕾，郭嘉航，官會林，黃晶心**

(1.云南師范大學(xué) 高原特色中藥材種植土壤質(zhì)量演變退化與修復(fù)云南省野外科學(xué)觀測研究站，云南 昆明 650500；2.云南師范大學(xué) 云南省農(nóng)村能源工程重點(diǎn)實驗室，云南 昆明 650500；3.云南開放大學(xué) 公共基礎(chǔ)教學(xué)部，云南 昆明 650500)

蓮藕是中國的傳統(tǒng)農(nóng)作物，分布極廣，南北各地均有種植，以長江流域、珠江三角洲、洞庭湖、太湖等地為主產(chǎn)區(qū).除水田外，低洼田、池塘和湖蕩也可種植.云南種植蓮藕歷史悠久，主要分布在安寧、呈貢、澄江、玉溪、江川、文山、丘北等地[1-2].蓮藕腐敗病又稱蓮藕枯萎病、蓮瘟，是蓮藕種植區(qū)發(fā)病普遍、危害嚴(yán)重的病害之一.腐敗病發(fā)生時可導(dǎo)致蓮藕減產(chǎn)20%～60%，甚至絕收，嚴(yán)重影響蓮藕的產(chǎn)量和品質(zhì)[3].據(jù)報道蓮藕腐敗病由多種真菌引起，主要有尖鐮孢菌蓮?；停‵usarium oxysporumSchl.f.sp.nelumbicola）[4]、喙腐霉（Pythium rostratum）、刺腐霉（Pythium spinosum）[5]、旋柄腐霉（Phytopythium helicoides）[6]、串珠鐮刀菌（Fusarium moniliforme）、腐皮鐮刀（Fusarium poae）和接骨木鐮刀菌（Fusarium sambucinum）[7]等.目前，蓮藕腐敗病的防治方法主要為化學(xué)防治.陰筱等[6]研究發(fā)現(xiàn)代森錳鋅對蓮藕腐敗病致病菌旋柄腐霉具有較好的抑制作用.梁志懷等[8]研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)硫磺多菌靈和惡霉靈對蓮藕腐敗病致病菌尖孢鐮刀菌防治效果較好.雖然李文峰等[9]開發(fā)了蓮藕病蟲害智能診治系統(tǒng)，但不同區(qū)域蓮藕腐敗病防治效果存在差異，限制了當(dāng)前研究成果的推廣與應(yīng)用.

本研究的發(fā)病蓮藕取自云南省安寧市，該地蓮藕栽培歷史悠久，蓮藕及其產(chǎn)品的售賣為當(dāng)?shù)剞r(nóng)戶的主要經(jīng)濟(jì)來源.據(jù)當(dāng)?shù)剞r(nóng)戶反映，蓮藕發(fā)病于每年的6—10月，3～7 d 中便會使水田30%～50%的蓮藕發(fā)病，嚴(yán)重影響了蓮藕的品質(zhì)和產(chǎn)量.據(jù)觀察，發(fā)病蓮藕表面有黑色斑點(diǎn)，斑點(diǎn)及周圍有黑水流出，切開蓮藕后發(fā)現(xiàn)通氣組織中有明顯白色菌絲.當(dāng)?shù)剞r(nóng)戶通過換種、藕田翻耕、晾曬土壤、隨機(jī)噴灑藥劑等方式防治，但效果并不理想.為了解決當(dāng)?shù)厣徟焊瘮栴}，減輕病害對當(dāng)?shù)厣徟寒a(chǎn)業(yè)的影響，本研究采集了云南省安寧市的腐敗蓮藕，通過形態(tài)學(xué)和分子生物學(xué)方法鑒定蓮藕腐敗病病原微生物，并用6 種農(nóng)藥進(jìn)行抑菌實驗，篩選防治效果較好的藥劑，確定藥劑的最佳施用濃度，為當(dāng)?shù)厣徟翰『Φ姆乐翁峁┛茖W(xué)指引.

1 材料與方法

1.1 實驗材料于2018 年10月，采集云南省安寧市的發(fā)病蓮藕，洗凈后存放于自封袋，立即帶回實驗室進(jìn)行病原菌分離、純化.

1.2 方法

1.2.1 病原菌的分離、純化 用組織分離法和直接挑取法分離、純化發(fā)病蓮藕的病原菌.使用滅菌手術(shù)刀切取蓮藕發(fā)病組織與健康組織交界處的樣品，為1～2 cm，用70%乙醇浸泡20～30 s后，使用無菌水漂洗3次，然后將漂洗后的樣品轉(zhuǎn)接于PDA 培養(yǎng)基中，置于28 ℃恒溫中培養(yǎng)7 d，待長出菌落后挑取、純化3～5 次.將純化好的菌株轉(zhuǎn)接于PDA 斜面培養(yǎng)基上，28 ℃培養(yǎng)3 d，于4 ℃保藏備用.

1.2.2 病原菌的形態(tài)學(xué)鑒定 將分離得到的真菌接種于PDA 培養(yǎng)基平板上，28 ℃培養(yǎng)7 d.使用接種針挑取菌落邊緣的菌絲于載玻片上，滴上1～2 滴無菌水，蓋上蓋玻片后使用顯微鏡進(jìn)行觀察、拍照.參照《真菌鑒定手冊》[10]，根據(jù)菌落特征、菌絲形狀、孢子特征等對分離得到的真菌進(jìn)行初步鑒定.

1.2.3 病原菌的分子生物學(xué)鑒定 通過分析真菌ITS 序列對其進(jìn)行分子生物學(xué)鑒定.將純化后的真菌接種于PDA 培養(yǎng)基上，28 ℃培養(yǎng)5 d，使用SK8255 kit (Sagan Corporation，Shanghai)試劑盒提取DNA 用于PCR 序列擴(kuò)增.擴(kuò)增ITS 序列所用引物 為ITS4 (5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′)和 ITS5(5 ′-GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG-3)，具體PCR 擴(kuò)增程序和方法按照參考文獻(xiàn)[11]所述.擴(kuò)增所得片段使用SanPrep 柱式DNA 凝膠回收試劑盒（上海生工，SK8131）進(jìn)行回收，回收后的片段使用pMD?18-T Vector 試劑盒（Takara，D101A）構(gòu)建克隆文庫，送交上海生工進(jìn)行測序.

使用Bio Edit (7.0.5.3)軟件對測序結(jié)果進(jìn)行整理.使用BLAST（https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）進(jìn)行序列搜索，并下載相關(guān)序列.通過Mega 軟件（V7.0.26）進(jìn)行比對，采用N-J 方法構(gòu)建基于真菌ITS 序列的系統(tǒng)發(fā)育樹，采用Bootstrap 方法對系統(tǒng)發(fā)育樹進(jìn)行評估.通過系統(tǒng)發(fā)育樹確定真菌種屬信息.

1.2.4 致病性測定 采用柯赫氏法則確定蓮藕腐敗病致病菌.具體步驟分3 步.①消毒，取健康蓮藕，用自來水將其表面的泥土沖洗干凈，75%酒精浸泡2 min，無菌水清洗3次，2%次氯酸鈉溶液浸泡2 min，無菌水清洗3 次.②接種，用滅菌后的接種針等量挑取6 種真菌刺入蓮藕，深度約0.5 mm，每塊蓮藕刺8 次.③培養(yǎng)及觀察，將接上真菌的蓮藕在室溫下培養(yǎng)15 d，觀察蓮藕的發(fā)病情況，選擇與田間腐敗蓮藕相似癥狀的蓮藕組織，并從該組織上分離對應(yīng)真菌，確認(rèn)該菌為蓮藕腐敗病的致病菌.

1.2.5 化學(xué)防治藥劑的篩選 通過查閱蓮藕腐敗病防治的相關(guān)文獻(xiàn)，對比分析多菌靈、百菌清、腐霉·福美雙、代森錳鋅、唑醚·甲菌靈和噁霉靈6種藥物的抑菌效果.具體方法為：致病菌培養(yǎng)5 d后，采用5 mm 打孔器，取菌落邊緣新生菌絲于PDA 培養(yǎng)基平板中央，在平板垂直方向分別打4個孔放入無菌濾膜過濾后的農(nóng)藥，置于28 ℃培養(yǎng)5 d，觀察菌落的生長情況，每種農(nóng)藥3 次重復(fù).6 種農(nóng)藥的有效成分、劑型及生產(chǎn)廠家如表1 所示，農(nóng)藥的使用濃度按照廠家說明.根據(jù)公式：

表1 6 種農(nóng)藥的劑型和廠商建議的使用稀釋倍數(shù)Tab.1 The dosage forms and manufacturer’s recommended dilution ratio of 6 pesticides

抑菌率（%）=（對照組菌落直徑-處理組菌落直徑）/對照組菌落直徑×100%[12]計算抑菌率，并用平均值和標(biāo)準(zhǔn)誤差作圖.

1.2.6 蓮藕腐敗病化學(xué)防治藥劑最佳施用濃度 為驗證1.2.5 中篩選出的百菌清對蓮藕致病菌的抑制效果，確定百菌清的最佳施用濃度.本研究在200 mL PDA 液體培養(yǎng)中添加無菌濾膜過濾后的百菌清.共設(shè)置5 個濃度處理，分別為稀釋600、1 200、2 400、4 800、9 600倍，以不添加百菌清為對照（CK），每個處理重復(fù)3次，每重復(fù)接種等量的致病菌菌餅，在28 ℃，180 r/min 下培養(yǎng)84、96、108、120、132、144 h 取樣，使用血球計數(shù)板計數(shù)培養(yǎng)液中致病菌的孢子.

2 結(jié)果

2.1 真菌的形態(tài)學(xué)鑒定本研究共分離、純化得到6 種真菌，分別記錄為L1、L2、L3、L4、L5、L6（圖1）.對培養(yǎng)了7 d 的菌落進(jìn)行觀察，發(fā)現(xiàn)L1 老化菌絲周圍培養(yǎng)基呈紅色，邊緣及氣生菌絲為白色，初步鑒定為鐮刀菌屬（Fusarium）.L2 菌絲呈灰白色，菌絲呈棉絮狀，初步鑒定為毛霉屬（Mucor）.L3菌絲生長緩慢，生長7 d 后菌落大小在4.5～7.0 cm，菌落中間為草綠色，周圍呈墨綠色，初步鑒定為青霉屬（Penicillium）.L4 菌放射狀生長，菌絲為純白色，致密、平鋪于PDA 培養(yǎng)基上，初步鑒定為地霉屬（Galactomyces）.L5 菌落呈斑塊狀生長，每個斑塊規(guī)則不一，菌落呈灰色，初步鑒定為漢遜酵母屬（Ogataea）.L6 氣生菌絲為白色，中間老化菌絲為紅色、金黃色，初步鑒定為鐮刀菌屬（Fusarium）.

圖1 6 種真菌在PDA 培養(yǎng)基上的形態(tài)Fig.1 Morphology of six pathogenic fungi on PDA medium plate

顯微鏡下（圖2），L1 菌株產(chǎn)生大量的大型孢子，孢子呈鐮刀形或棒球狀，有隔膜2～7個，頂端鈍圓或略微收縮，菌絲中存在孢子座，上部附著生多個大型孢子.L2 菌株孢子呈球形，黑色或褐色，破裂的孢子囊釋放出大量的短卵形胞囊孢子.L3 真菌分生孢子梗上有大量分生孢子，菌絲多分支，每個菌絲上均有明顯的隔膜.L4 真菌菌絲末端存在明顯的橢圓形孢子，成熟的孢子與菌絲斷裂，菌絲上有隔膜，多數(shù)菌絲分枝二叉.L5 菌株在顯微鏡下未見明顯的孢子，菌絲有分叉.L6 產(chǎn)生大量的大型分生孢子，孢子多有3 個橫隔，菌絲中存在隔膜，孢子的大小存在明顯差異.

圖2 6 種真菌分生孢子的形態(tài)Fig.2 The conidial morphologies of six pathogenic fungi

2.2 致病菌的分子鑒定對6 種真菌的ITS 片段進(jìn)行比對、分析，采用鄰位相連法（Neighbor-Joining法）構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹（圖3）.鑒定結(jié)果顯示L1 菌株為禾谷鐮刀菌（Fusarium graminearum），L2 菌株為卷枝毛霉（Mucor circinelloides），L3 菌株為團(tuán)青霉（Penicillium commune），L4 菌株為白地霉（Galactomyces candidum），L5 菌株為漢遜酵母（Ogataea polymorpha），L6 菌株為三線鐮刀菌（Fusarium tricinctum）.

圖3 基于ITS 序列構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.3 Phylogenetic tree constructed based on the ITS sequences

2.3 致病菌的致病性測定回接蓮藕7 d后，6 種真菌僅有L1 菌株能使蓮藕染?。▓D4）.L1 回接3 d 后蓮藕表皮產(chǎn)生明顯黑斑，5 d 后蓮藕變黑、腐敗，切開蓮藕后通氣組織孔道中有許多白色菌絲.上述癥狀與在安寧采集的發(fā)病蓮藕癥狀完全相同，菌絲經(jīng)分離純化和L1 完全相同.由此，根據(jù)柯赫氏法則可認(rèn)定L1 菌株為引發(fā)蓮藕腐敗病的致病菌.

圖4 田間發(fā)病蓮藕（a）和試驗室回接發(fā)病蓮藕（b）組織圖片F(xiàn)ig.4 The tissue pictures of the diseased lotus root in the field(a) and the laboratory (b)

2.4 化學(xué)農(nóng)藥防治的篩選由圖5 可知，6 種農(nóng)藥均能抑制禾谷鐮刀菌生長，且不同農(nóng)藥抑制效果存在顯著差異（P＜0.05）.百菌清的抑菌效果最好，抑菌率為56.49%，分別是代森錳鋅、噁霉靈、唑醚·甲菌靈的1.88、2.1、2.22 倍.

2.5 百菌清的最佳施用濃度由圖6 可知，不同濃度百菌清對禾谷鐮刀菌的產(chǎn)孢抑制程度不同.稀釋600 倍可完全抑制禾谷鐮刀菌產(chǎn)孢，稀釋1 200、2 400、4 800、9 600 倍分別在120、96、96、84 h 內(nèi)抑制禾谷鐮刀菌產(chǎn)孢.這說明百菌清對禾谷鐮刀菌的產(chǎn)孢抑制效果隨著稀釋倍數(shù)的增加而降低，為完全抑制禾谷鐮刀菌產(chǎn)孢，百菌清的施用濃度需達(dá)到600 倍稀釋液濃度.

3 討論

蓮藕腐敗病可由多種真菌引起，但發(fā)病癥狀大致相同，主要為蓮藕地下莖逐漸變褐，通氣組織中充滿白色、絮狀菌絲，地下莖后期呈褐色至紫黑色腐敗[3-4,6]，例如串珠鐮孢菌、旋柄腐霉和尖孢鐮刀菌均能引發(fā)蓮藕腐敗病.本研究發(fā)現(xiàn)引發(fā)云南省安寧市蓮藕腐敗病的病原微生物為禾谷鐮刀菌.禾谷鐮刀菌為叢梗孢目，瘤痤孢科，鐮刀菌屬微生物，可引發(fā)禾本科作物發(fā)病，例如玉米穗腐病[13]、小麥莖腐病[14]等.有研究表明禾谷鐮刀菌還能引發(fā)十字花科植物擬南芥病變[15]、茄科植物煙草枯萎[16]，豆科植物大豆腐敗[17-18]，是一種多宿主致病真菌.禾谷鐮刀菌菌絲能在植物的輸導(dǎo)組織、通氣組織及植物表面快速繁殖、擴(kuò)散，短時間內(nèi)造成植物枯萎、腐敗等[19-20].禾谷鐮刀菌的分生孢子可通過土壤、空氣、水等傳播，短時間內(nèi)造成作物大面積染病[21-22]，目前關(guān)于禾谷鐮刀菌引發(fā)蓮藕腐敗病的研究尚未見報道.本研究結(jié)果顯示禾谷鐮刀菌能夠在短期內(nèi)侵染蓮藕，可能是因為該菌菌絲侵入蓮藕的通氣組織和輸導(dǎo)組織，該菌分生孢子經(jīng)水傳播至其他區(qū)域，進(jìn)而引發(fā)蓮藕腐敗，造成大面積的損失.

目前蓮藕腐敗病的防治方法主要為化學(xué)藥劑防治和生物防治.大多數(shù)研究主要報道了浙江、湖北等地蓮藕腐敗病的防治[4,23-24]，關(guān)于西南地區(qū)蓮藕腐敗病防治的報道還較少.據(jù)本研究區(qū)域調(diào)查反映，塘泥翻曬、噴灑硫酸銅、換種等方法均不能有效防治該地區(qū)蓮藕腐敗.本研究結(jié)果表明，6 種農(nóng)藥中百菌清的抑制效果最好（圖5），且百菌清600倍稀釋液可完全抑制禾谷鐮刀菌產(chǎn)孢（圖6）.百菌清的主要成分四氯間苯二甲腈，它可與3-磷酸甘油醛脫氫酶中的半胱氨酸蛋白質(zhì)相結(jié)合，從而破壞磷酸甘油醛脫氫酶活性[25]，限制真菌細(xì)胞新陳代謝[18,26].研究表明百菌清對引發(fā)非洲菊枯萎病的尖孢鐮刀菌[27]具有良好抑菌效果，同時還能抑制楊樹潰瘍病菌絲生長及生物量[28]，對禾谷鐮刀菌具有較好抑制效果[29-30]，這些研究結(jié)果與我們研究結(jié)果相似.因此，百菌清相比于其他藥劑能更好地抑制禾谷鐮刀菌的生長和產(chǎn)孢，可用于安寧市蓮藕腐敗病的防控.

圖5 6 種農(nóng)藥對禾谷鐮刀菌的抑制效果Fig.5 Inhibitory effect of six pesticides on Fusarium graminearum

圖6 不同濃度百菌清對禾谷鐮刀菌產(chǎn)孢的抑制效果Fig.6 Inhibitory effect of different concentrations of chlorothalonil on sporulation of Fusarium graminearum

近年來，隨著蓮藕種植面積的逐漸增加，蓮藕腐敗病的發(fā)生日趨嚴(yán)重.蓮藕腐敗影響蓮藕的品質(zhì)和產(chǎn)量，甚至影響蓮藕的觀賞價值，對蓮藕種植業(yè)造成巨大經(jīng)濟(jì)損失[4].本研究結(jié)果表明，安寧市蓮藕腐敗病主要是由禾谷鐮刀菌引起，且百菌清600倍稀釋液可有效控制禾谷鐮刀菌產(chǎn)孢，但該結(jié)果推廣應(yīng)用于蓮藕大田種植仍需進(jìn)一步驗證.本研究結(jié)果可為云南省蓮藕地下莖腐敗病的防治提供科學(xué)指導(dǎo)，為后續(xù)科學(xué)研究提供指引.

4 結(jié)論

（1）從安寧市腐敗蓮藕中分離得到6 種真菌，其中禾谷鐮刀菌為引發(fā)蓮藕腐敗病的致病菌.

（2）在化學(xué)防治藥劑篩選中，百菌清對禾谷鐮刀菌的抑制效果最好，且稀釋600 倍的百菌清可完全抑制禾谷鐮刀菌產(chǎn)孢.