黃博瑜 方函 陳璇 黃真池

(嶺南師范學(xué)院，湛江，524048)

桉樹(EucalyptusrobustaSmith)為3大人工林樹種之一，是南方短周期工業(yè)原料林的主要造林樹種，在華南地區(qū)栽培廣泛[1-2]。桉樹人工林木材產(chǎn)量超全國木材總量1/3，廣泛應(yīng)用于鋸材、膠合板材、造船材和紙漿材等方面，在促進(jìn)經(jīng)濟(jì)發(fā)展、保障我國木材安全、生態(tài)防護(hù)等方面發(fā)揮重要作用[3-4]。其中，尾葉桉及其雜交無性系因速生性好、豐產(chǎn)、干形優(yōu)美、適應(yīng)性廣泛而栽培面積最大[5]。隨著桉樹種植面積的擴(kuò)大，對具有適應(yīng)極端環(huán)境、抗病、高優(yōu)材質(zhì)等優(yōu)良性狀新品種的需求也不斷增強。桉樹常規(guī)育種技術(shù)受制于遺傳雜合性高、許多數(shù)量性狀受多基因控制、遺傳機理不明等因素，故彌補其不足的基因工程技術(shù)手段得到極大重視與發(fā)展[6-7]。

建立高效再生體系是桉樹轉(zhuǎn)基因育種的基礎(chǔ)。再生型愈傷組織的誘導(dǎo)是不定芽分化或體細(xì)胞胚胎發(fā)生的前提。人工合成的嘌呤類細(xì)胞分裂素6-芐基氨基嘌呤(6-BA)因活性強，化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定，價格低廉在組織培養(yǎng)中廣泛使用。合成脲類細(xì)胞分裂素，N-苯基-N’-[6-(2-氯苯并噻唑)基]脲(PBU)，能有效抑制尾葉桉愈傷組織褐變并促進(jìn)不定芽分化[8]。龐碧瀅等[9]發(fā)現(xiàn)PBU誘導(dǎo)產(chǎn)生的桉樹再生型愈傷組織的過氧化物酶(POD)活性顯著升高。除POD外，植物細(xì)胞中的保護(hù)酶還包括超氧化物歧化酶(SOD)和過氧化氫酶(CAT)等。保護(hù)酶和抗氧化劑共同調(diào)節(jié)活性氧(ROS)代謝平衡。植物細(xì)胞中ROS代謝與細(xì)胞分裂、分化及發(fā)育等密切相關(guān)[10]。外植體在切傷刺激和離體培養(yǎng)時會導(dǎo)致ROS過度積累，引起植物細(xì)胞膜系統(tǒng)等細(xì)胞結(jié)構(gòu)的氧化損傷和生物大分子功能喪失，ROS代謝失衡是外植體褐化的重要因素之一[11]。

SOD廣泛存在需氧原核生物和真核生物中，是活性氧清除系統(tǒng)中第一個發(fā)揮作用的抗氧化酶，能與POD、CAT協(xié)同運作將有害的超氧自由基轉(zhuǎn)化成完全無害的水，在ROS代謝中占有重要地位[12-13]。在西洋枸杞[14]和藏紅花[15]中發(fā)現(xiàn)，胚狀體分化初期，SOD酶活性提升。歐陽樂軍等[16]發(fā)現(xiàn)尾巨桉胚性愈傷組織SOD酶活性較高，清除活性氧自由基的能力強。

目前，鮮見桉愈傷分化與SOD基因表達(dá)關(guān)系的研究報道。本研究檢測PBU誘導(dǎo)尾葉桉愈傷分化過程中SOD酶活性及基因表達(dá)的變化，探討PBU有效抑制褐化，促進(jìn)再生型愈傷組織形成的機理，嘗試為桉樹高效再生體系的建立提供思路。

1 材料與方法

本試驗材料為國家林草局桉樹中心提供的尾葉桉U6(Eucalyptusurophylla)種子。

無菌苗培養(yǎng)：尾葉桉種子自來水浸泡2 h，0.2% Triton-100浸泡25 min，用蒸餾水沖洗后消毒。先用70%酒精消毒30 s，再用適量10% NaClO溶液消毒2次(7 min/次)，再用無菌水洗凈殘留消毒液后，將種子播種到0.5倍MS培養(yǎng)基，置于25 ℃暗處萌發(fā)。

愈傷組織誘導(dǎo)：將10 d苗齡幼苗20 μmol·m-2·s-1光下處理2 d，切下長約0.6～0.8 cm下胚軸莖段接種于含0.57 μmol/L IAA，并添加不同類型細(xì)胞分裂素的SPCa培養(yǎng)基中(a.4.56 μmol/L PBU；b.4.56 μmol/L 6-BA；c.3.99 μmol/L PBU+0.57 μmol/L 6-BA)。外植體在溫度(25±2)℃暗處理2周后，置于人工氣候箱進(jìn)行培養(yǎng)，誘導(dǎo)愈傷組織形成和分化(培養(yǎng)條件為16 h光照/8 h黑暗、光合有效輻射50 μmol·m-2·s-1，溫度(26±2)℃)。每2周更換新鮮培養(yǎng)基，待愈傷組織分化出肉眼可見的不定芽后，轉(zhuǎn)移到含0.44 μmol/L 6-BA、0.54 μmol/L NAA和0.3 μmol/L GA3的SPCa培養(yǎng)基促進(jìn)芽增殖和伸長，培養(yǎng)條件與愈傷誘導(dǎo)及分化條件相同。

酶液提取、蛋白質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)測定及SOD活性檢測：稱取0.2 g材料液氮研磨成細(xì)粉，加100 mg PVPP，4 mL酶提取液(50 mmol/L pH7.0 Tris-HCl緩沖液，1 mmol/L EDTA，5 mmol/L MgCl2，1 mmol/Lβ-巰基乙醇)，冰浴勻漿。4 ℃，8 000 r/min，離心10 min，所得上清即為酶提取液。酶液蛋白質(zhì)含量采用考馬斯亮藍(lán)法[17]測定。SOD酶活性采用四氮唑藍(lán)(NBT)光化還原法測定[18]，在560 nm下測定試驗組的吸光度，以抑制NBT光化還原的50%作為1個酶活性單位(U)。所有測定3個生物學(xué)重復(fù)。

超氧陰離子產(chǎn)生速率和過氧化氫質(zhì)量摩爾濃度檢測：以6周齡愈傷組織為材料，用羥胺法[2]檢測超氧陰離子產(chǎn)生速率，用二甲酚橙法[5]檢測過氧化氫質(zhì)量摩爾濃度。所有測定3個生物學(xué)重復(fù)。

基因選擇及引物設(shè)計：從NCBI數(shù)據(jù)庫(https://www.ncbi.nlm.nih.gov)檢索到桉樹8個已知序列的SOD基因，選擇EEF33688.1為內(nèi)參基因[19]。將基因的CDS序列輸入Primer3Plus軟件設(shè)計qPCR引物,其中有6個基因能用尾葉桉cDNA做模板有效擴(kuò)增(表1)。

表1 內(nèi)參基因和SOD基因編號、對應(yīng)酶類型、qPCR引物序列

總RNA提取、反轉(zhuǎn)錄、qRCR：稱取3種類型愈傷組織各100 mg于液氮中研磨成細(xì)粉(每種樣品重復(fù)3次)，根據(jù)Fruit-mateTMfor RNA Purification試劑盒(TaKaRa)的使用說明配合RNAiso Plus提取總RNA，并用Nanodrop 2000c檢測總RNA的質(zhì)量和濃度。反轉(zhuǎn)錄按文獻(xiàn)[19]的方法進(jìn)行，得到初始cDNA，冰箱-80 ℃貯存?zhèn)溆?。qPCR反應(yīng)體系為25 μL(SYBR Premix TaqTMⅡ 12.5 μL,10 μmol/L Primer F和Primer R各1 μL，ddH2O 8.5 μL，cDNA模板2 μL)；擴(kuò)增儀器為CFX-96Touch(Bio-Rad)；擴(kuò)增程序：94 ℃，10 s；55 ℃，10 s；72 ℃，15 s。設(shè)第2周尾葉桉愈傷組織的各SOD基因表達(dá)水平為1，采用相對定量的Pfaffl法[20]，計算各基因的相對表達(dá)量。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同激素組合處理對愈傷組織分化的影響

切取0.6～0.8 cm幼苗下胚軸作外植體，接種在添加不同激素組合的SPCa愈傷誘導(dǎo)培養(yǎng)基中。前6周愈傷組織僅分化成白色愈傷和褐化愈傷，8周時觀察到愈傷組織已分化出綠色、白色和褐色愈傷組織(圖1A,B,C)。綠色愈傷組織表面濕潤有光澤、細(xì)胞團(tuán)致密，可見顆粒狀突起，是再生型愈傷組織，可分化出不定芽(圖1D)。白色愈傷組織表面有光澤但較為暗淡，細(xì)胞團(tuán)疏松；褐色愈傷組織呈褐色至深褐色，表面干燥無光澤。10周后統(tǒng)計愈傷組織分化情況。6-BA誘導(dǎo)愈傷組織褐化嚴(yán)重，無再生型愈傷組織形成。PBU和PBU+6-BA的激素組合中愈傷組織褐化比例分別為30.56%和24.67%，胚性愈傷組織比例分別為41.67%和48.67%。顯然，PBU能顯著降低褐化率、高效促進(jìn)再生型愈傷組織形成。

A.綠色愈傷；B.白色愈傷；C.褐色愈傷；D.綠色愈傷組織分化出的不定芽(圖中參照線長5 mm)。圖1 尾葉桉綠色、白色、褐色愈傷組織及不定芽

2.2 尾葉桉愈傷組織SOD酶活性及ROS量

2.2.1不同激素組合誘導(dǎo)尾葉桉愈傷組織的SOD酶活性

以尾葉桉外植體作對照，檢測各激素組合誘導(dǎo)所得的2周齡愈傷組織的SOD酶活性(表2)。愈傷組織的SOD酶活性顯著高于外植體，說明在愈傷組織的分化過程伴隨著SOD酶活性升高。PBU誘導(dǎo)得到的愈傷組織SOD酶活性顯著高于僅用6-BA或PBU和6-BA共同誘導(dǎo)所得愈傷組織的SOD酶活性。顯然，PBU能夠提升愈傷組織SOD酶活性，對分化及抗褐化有利。

表2 不同激素組合處理2周后誘導(dǎo)所得尾葉桉愈傷組織SOD酶活性比較

2.2.2PBU誘導(dǎo)所得愈傷組織不同分化階段的SOD酶活性變化

檢測PBU誘導(dǎo)出的愈傷組織在2、4、6、8和10周時的SOD酶活性(表3)。6周之前愈傷組織的SOD酶活性變化不明顯，活性介于182.34～192.76 U/mg蛋白之間；觀察發(fā)現(xiàn)6周是愈傷組織分化出不同類型愈傷組織的關(guān)鍵分界點。保持白色愈傷組織狀態(tài)的8周齡愈傷組織SOD酶活性顯著下降，僅為50.67 U/mg。如果6周齡白色愈傷組織分化成綠色愈傷組織，10周時檢測到其SOD酶活性高達(dá)968.70 U/mg，為6周愈傷組織酶活的5.03倍。說明桉樹愈傷組織SOD酶活性高低顯著影響愈傷組織的分化。

表3 PBU組合誘導(dǎo)所得不同時間的尾葉桉愈傷組織SOD酶活性

2.2.3不同激素組合誘導(dǎo)尾葉桉愈傷組織超氧陰離子產(chǎn)生速率和H2O2質(zhì)量摩爾濃度

6周是愈傷組織分化成不同類型的關(guān)鍵分界點，推測不同激素組合誘導(dǎo)出的愈傷組織在這個時間段的ROS代謝較為活躍。以超氧陰離子產(chǎn)生速率和H2O2質(zhì)量摩爾濃度反映ROS量，本試驗用不同激素組合誘導(dǎo)的6周齡白色愈傷組織為材料進(jìn)行檢測(表4)。6-BA激素組合誘導(dǎo)出的愈傷組織超氧陰離子產(chǎn)生速率顯著高于PBU。過氧化氫質(zhì)量摩爾濃度由大到小表現(xiàn)為6-BA、PBU+6-BA、PBU，且有顯著性差異。SOD是ROS代謝中的關(guān)鍵酶，在超氧陰離子轉(zhuǎn)變?yōu)檫^氧化氫的過程中起著重要作用。不同激素誘導(dǎo)所得愈傷組織ROS的量差異預(yù)示：PBU通過影響ROS代謝相關(guān)酶的表達(dá)變化，調(diào)節(jié)愈傷組織ROS量和種類，決定著愈傷組織的分化方向。

2.3 PBU誘導(dǎo)愈傷組織SOD基因表達(dá)變化

桉樹愈傷組織SOD酶活性變化與愈傷組織的分化密切相關(guān)。SOD酶活性高低主要取決于SOD基因轉(zhuǎn)錄水平的調(diào)控。比較PBU誘導(dǎo)出的愈傷組織2、4、6、8和10周時的6個SOD基因(表1)相對表達(dá)量的變化如表5。

表4 不同激素組合處理6周后誘導(dǎo)所得尾葉桉白色愈傷組織ROS量

表5 PBU誘導(dǎo)不同時間的尾葉桉愈傷組織SOD基因相對表達(dá)變化

SOD1與SOD2基因編碼Mn-SOD，定位于線粒體。6周前，白色愈傷組織中SOD1與SOD2基因表達(dá)整體呈現(xiàn)上升趨勢。10周時取用綠色愈傷組織進(jìn)行檢測，SOD1、SOD2的相對表達(dá)量較前6周的白色愈傷組織均出現(xiàn)顯著升高，基因表達(dá)水平分別為24.45和8.18。SOD3與SOD4基因編碼Fe-SOD，定位于葉綠體。前6周的白色愈傷組織中SOD3、SOD4表達(dá)整體呈上升趨勢。與之前白色愈傷組織相比，10周綠色愈傷組織中2個基因相對表達(dá)量均顯著升高，SOD3和SOD4基因相對表達(dá)量分別為11.96和14.96。SOD5與SOD6基因編碼Cu/Zn-SOD，SOD5定位于葉綠體與細(xì)胞質(zhì)中，SOD6定位尚不明確。6周齡白色愈傷組織中SOD5相對表達(dá)明顯增強，10周齡綠色愈傷組織中SOD5基因表達(dá)顯著升高到7.22。2～6周SOD6的表達(dá)逐步升高，第6周時相對表達(dá)量為5.51，第8周下降到3.75；綠色愈傷組織中相對表達(dá)量僅為1.03。6個SOD基因中，SOD1、SOD2、SOD3、SOD4和SOD5的相對表達(dá)量均為綠色愈傷組織中最高。但是綠色愈傷組織中SOD6的表達(dá)水平與2周白色愈傷組織的相同，推測基因表達(dá)變化與其生理作用和在細(xì)胞中的定位有關(guān)。

3 結(jié)論與討論

SODs是結(jié)合不同金屬離子的復(fù)合酶，多數(shù)SOD由核基因編碼，核糖體合成后通過N末端定位序列定位到亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)而起作用[26]。在高等植物中，錳超氧化物歧化酶(Mn-SOD)主要存在于線粒體中，鐵超氧化物歧化酶(Fe-SOD)存在于葉綠體中，銅、鋅超氧化物歧化酶(Cu/Zn-SOD)主要存在于葉綠體和細(xì)胞質(zhì)中[27]。本試驗中，除SOD6基因定位尚不明確外，其余SOD基因的酶類型定位與上述一致。王福祥等[28]發(fā)現(xiàn)在植物的非光合組織(根、分生組織、種子及花器官)中線粒體是ROS產(chǎn)生的關(guān)鍵來源。過多的ROS會攻擊細(xì)胞內(nèi)的生物大分子，造成不可避免的氧化損傷。本試驗中檢測PBU組合誘導(dǎo)的愈傷組織SOD基因的變化，發(fā)現(xiàn)定位在線粒體中屬于Mn-SOD的SOD1、SOD2基因在尾葉桉愈傷組織分化成綠色愈傷過程中表達(dá)顯著提高。推測SOD1、SOD2基因的高表達(dá)有利于清除線粒體ROS，保證了非光合組織功能的正常進(jìn)行，對愈傷分化有利。

在光合組織(葉片)中,葉綠體是植物中ROS的主要來源[29-30]。武立權(quán)等[31]發(fā)現(xiàn)水稻葉片中較高的SOD酶活性是保證葉片突變體轉(zhuǎn)綠和存活的主要生理因素，轉(zhuǎn)綠后出現(xiàn)Fe-SOD譜帶，突變體葉片轉(zhuǎn)變過程中葉綠體不斷地發(fā)育。清除超氧陰離子是葉綠體SOD的主要功能，鄭曉云等[32]發(fā)現(xiàn)在Fe-SOD表達(dá)較低的植物體，這一功能由Cu/Zn-SOD來完成。本研究中，定位中含有葉綠體的SOD3、SOD4和SOD5基因的表達(dá)在前期有逐漸升高的趨勢，且SOD酶活性在轉(zhuǎn)綠前的第6周和成功轉(zhuǎn)綠后都保持較高水平，說明尾葉桉愈傷組織轉(zhuǎn)綠的過程中葉綠體在不斷發(fā)育，期間定位在葉綠體的SOD酶活性維持在較高水平，SOD清除氧自由基有利于愈傷組織的轉(zhuǎn)綠以及葉綠體的發(fā)育與形成。在SOD酶活性最高的第10周綠色愈傷中，屬于Fe-SOD的基因SOD3、SOD4表達(dá)均高于屬Cu/Zn-SOD的SOD5、SOD6基因，推測Fe-SOD與Cu/Zn-SOD之間存在互補作用，共同維持SOD在葉綠體中的水平，防止ROS過多積累，起到保護(hù)葉綠體的作用。

除SOD6外，其他5個SOD基因在綠色愈傷組織中的表達(dá)水平顯著升高，其表達(dá)水平變化與酶活性變化相同。推測PBU誘導(dǎo)SOD基因表達(dá)增強，導(dǎo)致愈傷組織酶活性升高。Mn-SOD與Fe-SOD、Cu/Zn-SOD在細(xì)胞不同部位發(fā)揮作用，調(diào)節(jié)ROS在合適水平，表現(xiàn)出抗褐化和促分化的作用。尤其值得關(guān)注的是，6周后白色愈傷組織向綠色愈傷組織分化時SOD活性和基因表達(dá)顯著升高，而白色愈傷組織轉(zhuǎn)變?yōu)闊o分化能力的8周白色愈傷組織時，SOD酶活性和基因表達(dá)量均降低，酶活與基因表達(dá)變化結(jié)果同時證明SOD在桉樹愈傷組織分化中起著重要的作用。

本試驗發(fā)現(xiàn)PBU能夠誘導(dǎo)定位于葉綠體和線粒體中的SOD基因的高效表達(dá)，進(jìn)而提高SOD酶活性，從而維持ROS平衡，為再生型愈傷組織分化提供良好內(nèi)在條件，降低了褐化率。試驗結(jié)果可為探討脲類細(xì)胞分裂素的作用機理提供參考，為桉樹高效再生體系的建立提供借鑒。