王屹侃 李鐘陳 金建強

膝關(guān)節(jié)骨關(guān)節(jié)炎（knee osteoarthritis，KOA）是一種常見的慢性退行性疾病，以疼痛、關(guān)節(jié)活動功能障礙為主要特征［1-2］。KOA發(fā)生后，軟骨磨損，關(guān)節(jié)間隙變窄，可出現(xiàn)畸形，其中內(nèi)翻畸形是膝關(guān)節(jié)常見的畸形表現(xiàn)［3］。內(nèi)、外側(cè)間室關(guān)節(jié)軟骨處于相同內(nèi)環(huán)境，在炎性關(guān)節(jié)液中長期暴露，但由于內(nèi)翻畸形，應(yīng)力集中于內(nèi)側(cè)間室。因此，臨床上常見內(nèi)側(cè)間室關(guān)節(jié)軟骨嚴(yán)重退變，而外側(cè)間室軟骨仍然良好［4］。目前國內(nèi)外關(guān)于間室軟骨退變分子生物學(xué)水平初步評價的報道尚少。因此，本研究初步探討內(nèi)翻畸形有、無外側(cè)間室關(guān)節(jié)軟骨病變的KOA患者關(guān)節(jié)液對軟骨細(xì)胞增殖、凋亡及自噬的影響，以期為臨床預(yù)防和干預(yù)KOA提供指導(dǎo)依據(jù)。本研究經(jīng)醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會批準(zhǔn)，所有患者簽署知情同意書，現(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 12只普通級新西蘭大白兔，4周齡，體質(zhì)量為0.42~0.45 kg，購于浙江中醫(yī)藥大學(xué)實驗動物研究中心，飼養(yǎng)于中心屏障系統(tǒng)內(nèi)，動物許可證號：［SYXK（浙）2013-0184］。本研究所涉及的動物操作獲得浙江中醫(yī)藥大學(xué)動物中心倫理委員會的批準(zhǔn)（倫理編號：ZSLL-2019-124）。

1.2 儀器及試劑 白細(xì)胞介素-1β（IL-1β）、白細(xì)胞介素-6（IL-6）、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、基質(zhì)金屬蛋白酶-13（MMP-13）ELISA試劑盒購于酶免公司；GAPDH抗體（批號：60004-1-1g）購于華安生物；甲苯胺藍(lán)試劑盒（批號：G3668）購于索萊寶；細(xì)胞增殖核抗原（PCNA）、Bcl-2、Bax、LC3B、P62、Beclin-1、BMP2、mTOR抗體購于Abcam公司；PI3K、AKT（批號：AF6242、AF6261）購于Affinity公司。AE2000倒置顯微鏡（Motic）， C6流式細(xì)胞儀（BD）。

1.3 軟骨細(xì)胞的分離與培養(yǎng) 無菌切取新西蘭大白兔關(guān)節(jié)軟骨，解剖刀剪成碎塊（1 mm×1 mm×1 mm），經(jīng)透明質(zhì)酸酶、胰蛋白酶、Ⅱ型膠原依次消化，加入含10% FBS的DMEM：F12（1∶1）培養(yǎng)液制成單細(xì)胞懸液，傳代培養(yǎng)，以甲苯胺藍(lán)染色進行軟骨細(xì)胞鑒定。

1.4 膝關(guān)節(jié)關(guān)節(jié)液標(biāo)本的收集與分組 按照中華醫(yī)學(xué)會骨科學(xué)分會制定的《骨關(guān)節(jié)炎診治指南（2018年版）》［5］，選取本院2019年5月至8月經(jīng)影像學(xué)確診為內(nèi)翻畸形伴有外側(cè)間室關(guān)節(jié)軟骨病變的KOA患者7例及內(nèi)翻畸形無外側(cè)間室關(guān)節(jié)軟骨病變的KOA患者10例。常規(guī)消毒，鋪單，沿髕骨下緣入路行膝關(guān)節(jié)穿刺，抽取5 mL關(guān)節(jié)液原液。關(guān)節(jié)液置于EP管，以3,000 r/min的速度在4 ℃下離心30 min，取上清液，經(jīng)0.45 μm和0.22 μm微孔濾過膜過濾，置于4℃冰箱保存?zhèn)溆谩?nèi)翻畸形伴有外側(cè)間室關(guān)節(jié)軟骨病變的KOA關(guān)節(jié)液設(shè)為觀察組，內(nèi)翻畸形無外側(cè)間室關(guān)節(jié)軟骨病變的KOA關(guān)節(jié)液設(shè)為對照組。

1.5 關(guān)節(jié)液炎癥因子生化分析 參照相關(guān)試劑盒說明，采用ELISA法檢測觀察組及對照組關(guān)節(jié)液中IL-1β、TNF-α、IL-6及MMP-13的含量水平。

1.6 CCK-8法檢測軟骨細(xì)胞生長情況 取P1代軟骨細(xì)胞，接種于96孔板，3×103/孔，分3組各設(shè)6個復(fù)孔平行對照，培養(yǎng)12 h，棄去培養(yǎng)基。使用10%內(nèi)翻畸形伴有外側(cè)間室關(guān)節(jié)軟骨病變的KOA關(guān)節(jié)液+10%FBS的DMEM：F12（1∶1）培養(yǎng)液設(shè)為實驗組，使用10%內(nèi)翻畸形無外側(cè)間室關(guān)節(jié)軟骨病變的KOA關(guān)節(jié)液+10% FBS的DMEM：F12（1∶1）培養(yǎng)液設(shè)為陰性對照組，2 d/次進行換液；使用只含10% FBS的DMEM：F12（1∶1）培養(yǎng)液設(shè)為空白組。各組分別于0、1、2、3 d避光條件下加入CCK-8試劑，3 h后，采用酶標(biāo)儀在450 nm波長下檢測吸光度（OD）值，用以分析細(xì)胞增殖能力。

1.7 流式細(xì)胞術(shù)檢測軟骨細(xì)胞凋亡 于6孔板接種對數(shù)生長期軟骨細(xì)胞，細(xì)胞貼壁后，使用培養(yǎng)液，按上述分組，處理24 h后，胰酶消化，離心棄上清液，預(yù)冷PBS洗滌，調(diào)整細(xì)胞濃度至1×106個/mL，5 μL的Annexin V-FITC混勻后，避光，室溫孵育15 min，上機前5 min，加入5 μL PI染色。采用流式細(xì)胞儀檢測軟骨細(xì)胞凋亡率，實驗重復(fù)3次。

1.8 免疫熒光法檢測軟骨細(xì)胞LC3B及P62蛋白表達 選取第3代軟骨細(xì)胞爬片，細(xì)胞貼壁后按上述分組處理后，加預(yù)冷4% PFA固定，PBS漂洗；加0.5%Triton X-100通透細(xì)胞膜，加3% BSA封閉液封閉，加一抗（LC3B，P62），孵育，PBS漂洗，加二抗，室溫下避光孵育0.5 h，PBS漂洗，加DAPI對細(xì)胞核進行染色，抗熒光淬滅劑封片，倒置熒光顯微鏡下觀察拍照。

1.9 Western blot法檢測軟骨細(xì)胞自噬及凋亡相關(guān)蛋白的表達 軟骨細(xì)胞以RIPA裂解液冰上裂解30 min后，BCA法測定蛋白濃度，5% SDS-PAGE濃縮膠電泳分離蛋白，轉(zhuǎn)PVDF膜。封閉液封閉，TBST洗膜3次，加入含一抗，4 ℃振蕩過夜孵育，加入相應(yīng)二抗，室溫孵育1~2 h，TBST洗膜3次。以GAPDH為內(nèi)參，ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒處理，Chemi capture軟件拍攝處理圖像。

1.10 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS 16.0統(tǒng)計軟件。計量資料多組間用One-way-ANOAY單因素方差分析，組間比較采用SNK分析。方差不齊者采用Kruskal-Wallis H檢驗。所有數(shù)據(jù)以均值（）表示，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組關(guān)節(jié)液IL-1β、TNF-α、IL-6及MMP-13含量水平比較 采用ELISA法測定兩組關(guān)節(jié)液中IL-1β、TNF-α、IL-6及MMP-13的含量水平，觀察組關(guān)節(jié)液IL-1β、TNF-α、IL-6、MMP-13水平顯著高于對照組（P＜0.01）。見表 1。

表1 兩組關(guān)節(jié)液IL-1β、TNF-α、IL-6及MMP-13含量水平比較［pg/mL，（）］

表1 兩組關(guān)節(jié)液IL-1β、TNF-α、IL-6及MMP-13含量水平比較［pg/mL，（）］

注：與觀察組相比，*P＜0.05

組別 n IL-1β TNF-α IL-6 MMP-13觀察組 7 64.65±10.32 106.48±8.15 76.54±14.6 230.57±61.14對照組 10 41.05±5.64* 65.36±7.65* 51.26±4.68* 176.72±53.16*

2.2 軟骨細(xì)胞形態(tài)觀察 軟骨細(xì)胞分離培養(yǎng)第5天時正常貼壁生長，光鏡下觀察可知細(xì)胞呈多邊形，經(jīng)甲苯胺藍(lán)染色鑒定細(xì)胞為軟骨細(xì)胞來源。見圖1。

圖1 軟骨細(xì)胞形態(tài)觀察（×400）

2.3 CCK-8法檢測軟骨細(xì)胞增殖 與空白組相比，第1天細(xì)胞活力無顯著差異（P＞0.05），第2、3天實驗組OD值顯著降低（P＜0.01），生長減緩，而陰性對照組較空白組無顯著差異（P＞0.05）。見圖2。

圖2 CCK-8法檢測共培養(yǎng)軟骨細(xì)胞增殖

2.4 流式細(xì)胞術(shù)檢測軟骨細(xì)胞凋亡與空白組相比，實驗組軟骨細(xì)胞的凋亡率顯著升高（P＜0.01），而陰性對照組軟骨細(xì)胞凋亡率無顯著變化（P＞0.05）。與陰性對照組相比，實驗組軟骨細(xì)胞凋亡率顯著升高（P＜0.01）。見圖3。

圖3 共培養(yǎng)軟骨細(xì)胞凋亡率比較

2.5 免疫熒光法檢測軟骨細(xì)胞LC3B、P62蛋白表達 與空白組比較，實驗組軟骨細(xì)胞LC3B熒光強度顯著加強（P＜0.01），P62 熒光強度顯著減弱（P＜0.01），陰性對照組LC3B和P62熒光強度差異不顯著（P＞0.05）；且實驗組與陰性對照組間LC3B、P62熒光強度有顯著差異（P＜0.01）。見圖 4。

圖4 共培養(yǎng)軟骨細(xì)胞LC3B和P62蛋白表達水平比較

2.6 Western blot法檢測軟骨細(xì)胞自噬相關(guān)蛋白的表達 與空白組相比，實驗組與陰性對照組軟骨細(xì)胞中PCNA、Bcl-2、P62與BMP-2的蛋白表達水平均顯著降 低（P＜0.05）；Bax、LC3、Beclin-1、PI3K、AKT 與mTOR的蛋白表達水平均顯著升高（P＜0.05）。與陰性對照組相比，實驗組軟骨細(xì)胞中PCNA、Bcl-2、P62、BMP-2蛋白表達水平顯著降低（P＜0.05）；Bax、LC3蛋白表達水平顯著升高（P＜0.05）。見圖5。

圖5 共培養(yǎng)軟骨細(xì)胞PCNA、Bcl-2、Bax、LC3Ⅱ、P62、Beclin-1、BMP-2、PI3K、AKT與mTOR蛋白表達水平

3 討論

KOA是一種以關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞受到損傷，膠原降解丟失，形成骨贅等為主要病理特征的慢性退行性疾?。?］。臨床上，內(nèi)翻畸形內(nèi)、外側(cè)間室關(guān)節(jié)軟骨退變程度差異顯著，但相關(guān)分子生物學(xué)研究報道較少。研究表明，IL-1β、TNF-α、IL-6等炎性介質(zhì)在OA進展中具有重要作用［7］。TNF-α及IL-1β可干擾軟骨細(xì)胞正常代謝，參與軟骨吸收，進而破壞軟骨關(guān)節(jié)［8］。本研究通過分別收集內(nèi)翻畸形有、無外側(cè)間室關(guān)節(jié)軟骨病變KOA患者的關(guān)節(jié)液，發(fā)現(xiàn)觀察組的IL-1β、TNF-α、IL-6及MMP-13水平較陰性對照組顯著升高，推測炎性因子水平升高可能促進KOA病變。研究表明，軟骨細(xì)胞數(shù)量的減少與KOA的進展密切相關(guān)［9］。本研究中，內(nèi)翻畸形伴有外側(cè)間室關(guān)節(jié)軟骨病變的KOA患者關(guān)節(jié)液抑制新西蘭兔軟骨細(xì)胞生長活力，具有抑制軟骨細(xì)胞增殖的作用。此外，伴有外側(cè)間室關(guān)節(jié)軟骨病變的KOA患者關(guān)節(jié)液較無外側(cè)間室關(guān)節(jié)軟骨病變的患者關(guān)節(jié)液更易誘導(dǎo)軟骨細(xì)胞凋亡。

PCNA可反映細(xì)胞增殖活動，Bax傳遞凋亡信號，為促凋亡蛋白，Bcl-2可與Bax形成異二聚體，阻斷凋亡信號，為抗凋亡蛋白［10］。本研究中，兩組KOA關(guān)節(jié)液均可顯著下調(diào)PCNA、Bcl-2、BMP-2蛋白表達水平，上調(diào)Bax蛋白表達，且實驗組作用更顯著，提示內(nèi)翻畸形KOA關(guān)節(jié)液具有抑制軟骨細(xì)胞增殖的作用。

自噬是一種分解代謝過程，可通過吞噬和降解受損的細(xì)胞器和蛋白質(zhì)來維持能量水平和更新細(xì)胞器，維持細(xì)胞內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定。研究發(fā)現(xiàn)，其參與的關(guān)節(jié)軟骨退化過程及軟骨細(xì)胞自噬缺陷與KOA的發(fā)生密切相關(guān)［11］。KOA病變初期，自噬相關(guān)蛋白LC3與自噬調(diào)節(jié)物Beclin-1在軟骨細(xì)胞中表達增加，自噬增強，可保護軟骨細(xì)胞；而KOA中后期，代償能力不足，自噬則被抑制，致細(xì)胞損傷［12］。此外，PI3K/AKT信號傳導(dǎo)，可調(diào)控mTOR參與自噬［13］。本研究中，KOA關(guān)節(jié)液可下調(diào)軟骨細(xì)胞中P62蛋白表達水平，上調(diào)LC3 、Beclin-1、PI3K、AKT與mTOR蛋白表達，提示內(nèi)翻畸形KOA關(guān)節(jié)液可激活軟骨細(xì)胞自噬機制，且伴有外側(cè)間室關(guān)節(jié)軟骨病變的KOA關(guān)節(jié)液增強細(xì)胞自噬的作用尤為顯著。

綜上所述，內(nèi)翻畸形的KOA關(guān)節(jié)液具有抑制體外軟骨細(xì)胞增殖，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，激活軟骨細(xì)胞自噬的作用，這可能是促進KOA進程的作用機制之一。然而，軟骨細(xì)胞深層的潛在作用機制仍有待進一步研究。