楊從武，羅九鳳

(1黔東南苗族侗族自治州食品藥品檢驗檢測中心，貴州 凱里 556000；2貴州醫(yī)科大學第二附屬醫(yī)院(原418醫(yī)院)，貴州 凱里 556000)

油麻血藤藥材為我省少數(shù)民族習用藥材，是豆科植物常春油麻藤MucunasempervirensHemsl.的干燥藤莖，全年均可采收，除去枝葉切段或片，曬干，具有活血補血、疏通經絡、治療風濕疼痛、四肢麻木、血虛、月經不調、閉經等功效[1]。油麻血藤對土壤要求不嚴，喜肥沃，生長于亞熱帶森林灌木、溪谷等地，耐陰、耐旱、耐貧薄的特點[2]。主要分布于亞熱帶、溫帶地區(qū)，產中國貴州、云南、陜西等[3]。我省主產凱里爐山鎮(zhèn)、興義萬峰林、荔波佳榮鎮(zhèn)等地。據(jù)文獻報道，主要含多種脂肪酸，占1%～10%[4]，總黃酮類占12.43%[5](主要有刺芒柄花素、大豆黃素、3，7-二羥基-6-甲氧基二氫黃酮)。同時含有酚類、鞣質、揮發(fā)油等成分。

1 儀器與材料

1.1 藥材

油麻血藤于2017年4月采自貴州荔波。經貴州中醫(yī)藥大學孫慶文教授準確鑒定為豆科植物常春油麻藤MucunasempervirensHemsl.的干燥藤莖。憑證標本存放于貴州中醫(yī)藥大學生藥實驗室。取干燥藥材打粉過四號篩，密封存儲于廣口瓶中，備用。

1.2 儀器

紫外分光光度計(UV-2600)；超聲波清洗器(SK8200HP)；電熱恒溫水浴鍋(單列六 5L-DK-98-ⅡA)；500克搖擺式高速中藥粉粹機(DFY-500)；電子天平(XPE205)。

1.3 試劑

蘆丁(中國食品藥品檢定研究院，含量：92.4%(UV)，批號：10080-201811)，甲醇，95%乙醇，乙酸乙酯、氫氧化鈉、亞硝酸鈉、硝酸鋁均購自國藥集團化學試劑有限公司，均為分析純。

2 方法與結果

2.1 對照品溶液及標準曲線制備

精密稱取標準物質0.01175 g(蘆丁92.4%(UV)，批號：10080-201811)，置50 mL量瓶中，加85%甲醇適量，超聲溶解，放冷，加85%甲醇至刻度，搖勻，即得(每1 mL含蘆丁0.21714 mg)。量取上述溶液1.00 mL、2.00 mL、3.00 mL、4.00 mL、5.00 mL、6.00 mL，分別置25 mL量瓶中，各加水至6 mL[6]，加5%亞硝酸鈉溶液1 mL，搖勻，放置6 min[6]，加10%硝酸鋁溶液1 mL，搖勻，放置6 min[6]，加氫氧化鈉試液10 mL，再加水至刻度，搖勻，放置15 min[6]，即得。立即在510 nm處測定各個溶液的吸光度，以吸光度為縱坐標，濃度為橫坐標，繪制標準曲線[7]。其回歸方程為Y=0.01379X-0.01920，r=0.99966，在測定濃度為8.686～52.114 μg/mL范圍內線性關系良好，可以進行定量分析。

2.2 供試品溶液的制備

精密取油麻血藤約0.25 g，置于具塞錐形瓶中，精密加入85%甲醇100 mL，密塞，稱重，超聲30 min，放冷，再次稱重，用85%甲醇補足減失補重，搖勻，濾過，精密量取續(xù)濾液5 mL置25 mL量瓶中，照2.1項下方法，自“加水至6 mL”起依法操作，并測定吸光度，從標準曲線上讀出供試品溶液中蘆丁的重量[6]。

2.3 單一因素試驗考察

2.3.1 不同提取溶劑對油麻血藤總黃酮含量的影響

精密稱取油麻血藤3份，各約0.25 g，置具塞錐形瓶中，各精密加甲醇、乙醇、乙酸乙酯100 mL，超聲提取30 min照2.2項下依法操作，并計算其總黃酮含量。

2.3.2 不同溶劑比例對油麻血藤總黃酮含量的影響

精密稱取油麻血藤4份，各約0.25 g，置于具塞錐形瓶中，各精密加入100%、85%、60%、20%的甲醇溶液各100 mL，超聲30 min，照2.2項下依法操作，并計算其總黃酮含量。

2.3.3 不同提取方式對油麻血藤總黃酮含量的影響

精密稱取油麻血藤3份，各約0.25 g，置具塞錐形瓶中，各精密加入85%的甲醇100 mL，分別超聲30 min，水浴回流1 h，冷浸過夜，照2.2項下依法操作，并計算其總黃酮含量。

2.3.4 不同超聲時間對油麻血藤總黃酮含量的影響

基于“2.3.3”項下85%甲醇超聲提取30 min，精密稱取油麻血藤2份，各約0.25 g，置于具塞錐形瓶中，各精密加入85%的甲醇100 mL，分別超聲15 min、60 min，取出，放冷，照2.2項下依法操作，并計算其總黃酮含量。

2.3.5 不同料液比對油麻血藤總黃酮含量的影響

基于“2.3.3”項下85%甲醇超聲提取30 min，精密稱取油麻血藤約0.5 g和約0.125 g，置于具塞錐形瓶中，分別加入85%的甲醇100 mL，超聲30 min，照2.2項下依法操作，并計算其總黃酮含量。

2.4 正交試驗

通過對不同提取溶劑、不同溶劑比例、不同提取方式、不同超聲時間、不同料液比進行考察，選擇對貴州產油麻血藤總黃酮提取影響較大的因素進行正交試驗，篩選最優(yōu)試驗方案進行驗證[7]。

2.5 單一因素試驗結果

經考察不同提取溶劑對總黃酮含量的影響為：甲醇>乙醇>乙酸乙酯。不同提取溶劑比例對總黃酮含量的影響為：85%>60%>100%>20%。不同提取方式對總黃酮含量的影響為：超聲>回流>冷浸。不同超聲時間對總黃酮含量的影響為：30 min>60 min>15 min。不同料液比對總黃酮的含量的影響為：1∶400>1∶800>1∶200。

2.6 正交試驗結果

單一因素試驗考察發(fā)現(xiàn)，料液比(A)、超聲時間(B)、甲醇濃度(C)對提取量影響較大，因此選擇提取時間、料液比、甲醇體積分數(shù)3個因素進行正交試驗設計，每個因素均設置4個水平[7-8](表1)。

表1 L16(43)因素水平

3 數(shù)據(jù)分析

3.1 因素水平直觀分析

由表2中RA=0.45，RB=0.07，RC=0.73，得出油麻血藤總黃酮的提取影響因素為C(甲醇濃度)>A(料液比)>B(超聲時間)。

表2 正交試驗結果

3.2 方差分析

由表3中離差平方和項可看出，試驗誤差對本次正交試驗提取總黃酮含量的影響甚微，主要影響因素還是各提取條件。同時查“十三五”規(guī)劃教材《醫(yī)藥數(shù)理統(tǒng)計》第5版附表8[7]得F0.05(3，9)=3.86，F(xiàn)0.01(3，9)=6.99，再結合表中F值項下FA、FB、FC值表明：因素A(料液比)對油麻血藤總黃酮的提取有顯著影響；因素B(超聲提取時間)對油麻血藤總黃酮的提取影響很??；因素C(甲醇濃度)對油麻血藤總黃酮提取影響非常明顯。由表2和表3綜合分析得出，A4B2C2最佳，即料液比1∶400(g∶mL)；超聲30 min；85%甲醇100 mL。

表3 方差分析

3.3 驗證試驗

根據(jù)正交試驗得到A4B2C2方案，照2.2項下方法，重復測定6份貴州荔波縣產油麻血藤，其總黃酮的平均含量是7.06%，RSD=0.96%。

4 結果

通過單一因素試驗考察及正交試驗結果可知，影響總黃酮含量的因素為：因素A(料液比)對總黃酮的提取有顯著影響；因素B(超聲提取時間)對總黃酮的提取影響不顯著；因素C(甲醇濃度)對荔波常春油麻藤總黃酮的提取影響非常顯著。另外，料液比為1∶400，對藥材中總黃酮的提取雖然提取率高，但應用于實踐存在一定困難，在下一步研究中我們會改進。綜上所述，該提取方法較為簡便、易于重現(xiàn)，可作為貴州產油麻血藤藥材質量評價的依據(jù)。