曹俊杰，董榕貴，楊昌彪，于 霞，馬 凱，黃永橋，簡(jiǎn)銀池，肖雄楓

(1貴州省檢測(cè)技術(shù)研究應(yīng)用中心，貴州 貴陽 550014；2貴州省分析測(cè)試研究院，貴州 貴陽 550014)

氯霉素、氟苯尼考、甲砜霉素(以下簡(jiǎn)稱氯霉素類)是一種對(duì)革蘭氏陰陽性菌、桿副傷寒桿菌、沙門氏菌等有作用的廣譜抑菌抗生素[1-2]，主要用于敏感細(xì)菌所致的禽肉、畜肉及水產(chǎn)品細(xì)菌性疾病，尤其對(duì)呼吸系統(tǒng)感染和腸道感染療效顯著。氯霉素會(huì)抑制骨髓造血功能，導(dǎo)致再生障礙性貧血[3-4]，而甲砜霉素會(huì)抑制紅細(xì)胞、白細(xì)胞和血小板的生成[5-6]，在國(guó)內(nèi)外對(duì)其在動(dòng)物體內(nèi)的使用都有限量要求[7-10]。氯霉素在所有食品動(dòng)物中不得檢出，甲砜霉素在牛、羊、豬、雞及其內(nèi)臟和魚的限量為50 μg/kg，氟苯尼考在畜禽肉、副產(chǎn)品和魚肉限量200～2500 μg/kg，產(chǎn)蛋和奶產(chǎn)品不得檢出。而氟苯尼考因?qū)?dòng)物胚胎有毒理，在妊娠期動(dòng)物禁用[11-13]。近幾年，張鳳清、張靜、鄒淼和莊姜云對(duì)液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定動(dòng)物肌肉組織、牛奶、飼料和蜂蜜中的氯霉素、氟苯尼考、甲砜霉素進(jìn)行分析[15-19]。國(guó)家在煙熏肉制品[14]中規(guī)定了氯霉素的限量，但甲砜霉素和氟苯尼考未作要求。本文通過雙泵雙柱UPLC/MSMS法對(duì)煙熏肉制品中氯霉素、氟苯尼考和甲砜霉素的穩(wěn)定性分析，為批量樣品的檢測(cè)分析提供技術(shù)支撐，為規(guī)范煙熏肉制品行業(yè)的發(fā)展具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 試劑與材料

氯霉素(純度99.24%，德國(guó)Dr.Ehrenstorfer)；氟苯尼考(純度99.82%，德國(guó)Dr.Ehrenstorfer)；甲砜霉素(純度99.24%，德國(guó)Dr.Ehrenstorfer)；甲醇(色譜純，德國(guó)Merck公司)；乙酸乙酯(天津科密歐)、氨水(25%～28%)、無水硫酸鈉等均為分析純；超純水；氨化乙酸乙酯(乙酸乙酯+氨水=100∶3)臘肉、香腸。

1.2 儀器與設(shè)備

Agilent 1290-6470超高效液相色譜-三重四級(jí)桿串聯(lián)質(zhì)譜儀，配有ESI源(美國(guó)Agilent公司)Agilent1260二元泵(G1312B)；十通閥；Thermo Acclaim TRINITY P1離子交換色譜柱(50 mm×2.1 mm，3 μm)；電子分析天平(上海卓精電子科技有限公司)；Milli-Q超純水機(jī)(美國(guó) Millipore SAS公司)；L550臺(tái)式低速離心機(jī)(湖南湘儀實(shí)驗(yàn)室開發(fā)有限公司)；XW-80A/80B旋渦混合器(上海米青科室實(shí)業(yè)有限公司)；OA-HEAT5085氮吹儀(美國(guó)OrgsnOmation)；0.22 μm濾膜(上海安譜實(shí)驗(yàn)科技股份有限公司)。

(1)色譜柱條件：流動(dòng)相A：超純水，B：色譜級(jí)甲醇；流速：0.3 mL/min；柱溫：40 ℃；進(jìn)樣體積：5.0 μL；梯度洗脫程序見表1。

表1 高效液相色譜梯度洗脫程序

(2)質(zhì)譜條件：離子源：ESI；掃描方式：負(fù)離子；監(jiān)測(cè)方式：多反應(yīng)監(jiān)測(cè)(MRM)；干燥器溫度：325 ℃；干燥氣流速7.0 L/min，鞘氣溫度300 ℃，鞘氣流速10 L/min，電子噴霧離子源(ESI-)霧化氣流速1000 L/h。氯霉素類定性離子對(duì)、定量離子對(duì)、去簇電壓及碰撞能量見表2。

表2 氯霉素類的定性、定量離子對(duì)，去簇電壓和碰撞能量

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的配置

氯霉素類混合標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液：準(zhǔn)確稱取適量的標(biāo)準(zhǔn)品，分別用甲醇配制成1.00 mg/mL，-18 ℃保存；10.00 μg/mL標(biāo)準(zhǔn)溶液配制：從1.00 mg/mL標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液中移取0.10 mL至10 mL容量瓶中，用甲醇定容至刻度，-18 ℃保存；50.00 ng/mL標(biāo)準(zhǔn)溶液配制：從10.00 μg/mL標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液中移取0.05 mL至10 mL容量瓶中，用甲醇定容至刻度，-18 ℃保存。

準(zhǔn)確稱取9份5 g陰性樣品，2份作為基質(zhì)空白對(duì)照，其余7份樣品分別加入混合標(biāo)準(zhǔn)溶液50.00 ng/mL，體積分別為0.10 mL、0.20 mL、0.40 mL、0.80 mL、1.20 mL、1.60 mL、2.00 mL，同樣品一起處理。最終標(biāo)準(zhǔn)曲線的濃度分別是：0.5 ng/mL、1.0 ng/mL、2.0 ng/mL、4.0 ng/mL、6.0 ng/mL、8.0 ng/mL、10.0 ng/mL。

1.3.2 樣品處理

準(zhǔn)確稱取5 g試樣，精確至0.01 g。置于50 mL離心管中，加入一顆瓷石，加入20 mL氨化乙酸乙酯，超聲10 min、震蕩2 min，4000 r/min常溫離心5 min，取上清液10 mL轉(zhuǎn)移至15 mL離心管中，40 ℃水浴氮?dú)獯蹈桑?1+9)乙腈+水定容5 mL，加3 mL正己烷去油脂，重復(fù)一次，過0.22 μm水系膜，上機(jī)待測(cè)。

2 結(jié)果與分析

2.1 樣品出峰時(shí)間及定性定量離子譜圖(圖譜橫軸為時(shí)間/min，縱軸為響應(yīng)值/mAU)

圖1 甲砜霉素、氟苯尼考、氯霉素的總離子色譜圖

2.2 雙泵的作用效果

雙泵雙柱和十通閥相結(jié)合，控制十通閥，來回切換進(jìn)樣柱和平衡柱，同一時(shí)間，一個(gè)泵帶動(dòng)一根柱子工作，另一個(gè)泵帶動(dòng)另一根柱子平衡。效率提高了一倍，縮短了檢測(cè)周期。

圖2 空白樣品色譜圖

圖3 加標(biāo)樣品色譜圖

圖4 甲砜霉素特征離子色譜圖

圖5 氟苯尼考特征離子色譜圖

2.3 樣品提取與優(yōu)化

樣品在用乙酸乙酯提取的同時(shí)，加入瓷石，有利于充分均質(zhì)樣品，充分提取出目標(biāo)物。由于煙熏制品中的油脂比較多，在去油脂凈化時(shí)用50 mL的離心管，兩次用飽和乙腈正己烷去油脂。從樣品提取到分析樣品的過程中，乙酸乙酸提取優(yōu)于乙腈，減少對(duì)人員的傷害；加入瓷石有利于均質(zhì)樣品，使目標(biāo)物得到充分的提??；取到離心管中直接氮吹，減少對(duì)器皿的污染，節(jié)約了成本。

圖6 氯霉素特征離子色譜圖

2.4 方法的線性范圍及檢出限

氯霉素類在0.5～10.00 μg/L的質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)(R2)在0.997～0.998之間。不同化合物的曲線回歸方程及相關(guān)系數(shù)如表3所示。同時(shí)按3倍信噪比(S/N)計(jì)算方法的檢出限。

表3 氯霉素類的線性范圍、方程、R2、檢出限和定量限

2.5 精密度實(shí)驗(yàn)和回收率

精選臘肉陰性樣品，分別對(duì)氯霉素類進(jìn)行加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)和精密度實(shí)驗(yàn)，按0.2 μg/kg、2.0 μg/kg、4.0 μg/kg進(jìn)行加標(biāo)實(shí)驗(yàn)，每個(gè)添加量水平做6個(gè)平行，按照1.3.2樣品前處理方法進(jìn)行提取凈化。

空白樣品和加標(biāo)樣品色譜圖見圖2和圖3，結(jié)果見表4，三個(gè)添加水平的平均回收率為89.3%～103.7%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(D)小于等于13.3%。

表4 氯霉素類回收率及相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(n=6)

2.6 穩(wěn)定性試驗(yàn)

精選臘肉和香腸的陰性樣品，按照0.2 μg/kg、2.0 μg/kg、4.0 μg/kg進(jìn)行加標(biāo)，每批添加水平做6個(gè)平行，添加4批，冷藏保存，以10天為周期進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，4個(gè)周期后分別對(duì)其含量進(jìn)行檢測(cè)分析。結(jié)果如表5、表6。

表5 第1天到30天回收率(n=6)

表6 第1天到30天相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(n=6)

1)通過30天4次對(duì)香腸臘肉加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)，回收率在80%～110%之間，滿足檢測(cè)實(shí)驗(yàn)要求。

2)從氯霉素類物穩(wěn)定性開始是第1天，相對(duì)偏差小于14%；第10天相對(duì)偏差小于15%，第20天相對(duì)偏差小于14%；第30天相對(duì)偏差小于13%?？偟南鄬?duì)偏差小于15%，可以得出氯霉素類物質(zhì)在30天周期內(nèi)穩(wěn)定。

2.7 實(shí)際樣品

共檢測(cè)26批次煙熏制品，其中1批次檢測(cè)出氯霉素，含量在1.3 μg/kg；檢出氟苯尼考為2批次，含量在0.10～3.8 μg/kg；檢出甲砜霉素2批次，含量在0.04～1.5 μg/kg。說明煙熏制品中存在氯霉素、氟苯尼考和甲砜霉素污染的風(fēng)險(xiǎn)。而且氟苯尼考和甲楓霉素含量較高，相關(guān)部門在煙熏品中沒有規(guī)定限量。予以源頭給予調(diào)控，市場(chǎng)流通給予控制。

3 結(jié)論

本次方法研究煙熏制品中氯霉素、氟苯尼考和甲砜霉素殘留量，從樣品前處理和質(zhì)譜條件進(jìn)行優(yōu)化。方法具有操作便捷、精密度和靈敏度高、定量準(zhǔn)確、可靠、檢測(cè)周期短和批量檢測(cè)，對(duì)基質(zhì)干擾、穩(wěn)定性、加標(biāo)回收和精密度實(shí)驗(yàn)進(jìn)行驗(yàn)證，檢出限和定量限滿足國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)要求，滿足煙熏制品中氯霉素、氟苯尼考和甲砜霉素殘留量的檢測(cè)。