徐文豪，李萬成 (.成都市第一人民醫(yī)院，四川 成都 60000；.成都醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院，四川 成都 60000)

MicroRNAs(miRNAs)是真核生物中一類長度約20～24個核苷酸的功能性非編碼單鏈小RNA,是由具有發(fā)夾結(jié)構(gòu)的約70～90個堿基組成的pre-miRNA經(jīng)過Dicer酶剪切產(chǎn)生,miRNAs與目標 mRNA 的 3'非編碼區(qū)(3'URT)相結(jié)合,抑制翻譯過程或降解目標mRNA,從而抑制相關(guān)基因的表達,具有調(diào)節(jié)多細胞多種生物學(xué)功能的作用[1-3]。一個miRNA可以作用于多個靶點，多個miRNA也可以共同調(diào)控一個基因的表達[4]。

特發(fā)性肺纖維化(IPF)是一種慢性、進展性、纖維性間質(zhì)性肺疾病,病變部位局限于肺部,其肺組織學(xué)和胸部高分辨率CT表現(xiàn)與一般間質(zhì)性肺炎相似。IPF的病理生理機制是各種原因?qū)е路闻萆掀ぜ毎茐模瑥亩疒吇蜃?、蛋白酶、TGF-β等導(dǎo)致纖維化的細胞因子釋放,成纖維細胞和肌成纖維細胞激活、聚集,肺泡上皮細胞向間質(zhì)轉(zhuǎn)化，細胞外基質(zhì)大量沉積,最終肺實質(zhì)破壞、被纖維組織替代,引起呼吸衰竭,確診后中位生存期為3至5年[5]。肺纖維化發(fā)病率、患病率以及死亡率正逐年上漲[6]。

目前肺纖維化的機制尚不十分明確，許多研究表明miRNAs在IPF的發(fā)病過程中起重要作用。miR-21在IPF模型小鼠肺組織和IPF患者的肺中顯著上調(diào)，miR-21參與了肺的纖維化過程[7]。Yang等[8]發(fā)現(xiàn)在IPF模型小鼠和IPF患者成纖維細胞中miR-31的表達減少,而將miR-31引入肺內(nèi)可顯著減輕模型鼠的肺纖維化,表明miR-31c是IPF發(fā)病機制中的重要調(diào)節(jié)因子,可能成為治療IPF患者的潛在靶點。

近年來研究表明microRNAs(miRNAs)在IPF的發(fā)生發(fā)展中起重要作用,參與了肺纖維化過程中的肺上皮修復(fù)、上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)、成纖維細胞活化、肌成纖維細胞分化、巨噬細胞極化、肺泡上皮細胞(AECs)衰老和膠原生成。miRNA表達中的長非編碼RNA(LncRNAs)和miRNAs之間的相互作用以及miRNA與DNA甲基化的相互作用在IPF過程中起重要調(diào)控作用。本文就miRNAs在IPF中的作用的最新研究進展作一系統(tǒng)綜述。本次研究經(jīng)過本院醫(yī)學(xué)倫理委員會同意。

1 miRNAs與肺上皮修復(fù)

AEC損傷后本應(yīng)該由上皮細胞更頻繁的增殖從而修復(fù)損傷，但上皮細胞的增殖是有限度的，頻繁損傷或大的損傷后上皮細胞增殖不夠，從而成纖維細胞會參與異常修復(fù)的過程，從而導(dǎo)致肺纖維化。而這種過度的損傷將會導(dǎo)致的上皮修復(fù)不良負反饋激活成纖維細胞產(chǎn)生大量細胞外基質(zhì)[9]。研究表明,IPF患者AECs中miR-29c表達下調(diào),IPF動物模型AECs中的miR29c表達降低導(dǎo)致細胞凋亡增加,上皮更新減少,而miR-29c過表達作用于Foxo3a靶點導(dǎo)致AECs大量增殖、存活率提高,從而使體內(nèi)纖維化減少[10]。Ge等[11]的研究發(fā)現(xiàn)，miR-323a-3p在IPF患者的AECs中比對照組降低12.5倍，博萊霉素誘導(dǎo)的肺纖維化小鼠肺上皮細胞miR-323A-3p的表達也下降，使用miR-323a-3p模擬物可以抑制小鼠肺纖維化,而使用miR-323A-3p的拮抗劑可以促進肺纖維化，而這一過程可能是miR-323a-3p作用于Smad2減弱轉(zhuǎn)化生長因子(TGF)-β信號以及抑制半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3mRNA的表達有關(guān)。有證據(jù)表明,在IPF發(fā)展過程中,AECs中的miR-30a表達下降,而人為上調(diào)miR-30a可抑制依賴DRP-1的線粒體分裂而抑制AECs-Ⅱ凋亡,miR-30a可以通過堿基配對和3'非翻譯區(qū)的互補位點來調(diào)節(jié)DRP-1啟動子的羥甲基化，從而抑制TET1的表達，最終抑制肺纖維化[12-13]。

2miRNAs與EMT

EMT參與了胸膜間皮細胞(PMC)的遷移和胸膜下肺纖維化的形成,在博萊霉素處理的PMC中miR-18a-5p的表達下調(diào),PMC的EMT增加,進一步研究表明,IPF模型小鼠中miR-18a-5p過度表達,作用于TGF-β受體Ⅱ的3'UTR區(qū)阻止博萊霉素誘導(dǎo)的PMC的EMT，從而抑制博萊霉素誘導(dǎo)的胸膜下纖維化[14]。有證據(jù)表明,miR-200家族(miR-200a、miR-200b和miR-200c)過表達,可抑制TGF-β1誘導(dǎo)的EMT,并且可以逆轉(zhuǎn)特發(fā)性肺纖維化的病理過程[15]。Yamada等[16]人報道，在IPF的發(fā)展過程中，miR-21在肺上皮細胞中的表達上調(diào)促進了EMT的發(fā)生。HMGA2是EMT過程中的一個關(guān)鍵因素,Liang等[17]的研究表明,IPF模型小鼠中miR26a的表達下調(diào)作用于HMGA2可以促進EMT過程。Wang等[18]的研究也表明，miR-221靶向作用于HMGA2,通過調(diào)節(jié)TGF-β1/Smad3誘導(dǎo)的EMT可抑制博萊霉素誘導(dǎo)的肺纖維化。

3 miRNAs與成纖維細胞活化

研究表明，miR-27b過表達通過靶向作用于TGF-β受體1和Smad3,減少膠原和α-平滑肌肌動蛋白的表達,從而減輕肺纖維化[19]。miR-29在成纖維細胞抵抗凋亡的機制中被認為是細胞外基質(zhì)(ECM)的調(diào)節(jié)因子。通過對轉(zhuǎn)染miR-29c模擬物和miR-29c抑制劑的研究表明，TGF-β可下調(diào)miR-29c和Fas受體的表達，抵抗細胞凋亡[20-12]。研究證實，在特發(fā)性肺纖維化發(fā)生發(fā)展過程中，miR-29a的下調(diào)導(dǎo)致LOXL2和SERPINH1的過度表達[22]。因此上調(diào)miR-29不但可以抑制細胞外基質(zhì)分泌,而且可以恢復(fù)肺成纖維細胞對凋亡的敏感性,從而減少肺纖維化。

4 miRNAs與肌成纖維細胞分化

Cui等[23]研究表明，與對照組相比，在肺纖維化患者的肺成纖維細胞中TGF-β1誘導(dǎo)的miR-27A-3p表達降低,miR-27A-3p的過表達抑制肺成纖維細胞向肌成纖維細胞的分化,而敲除miR-27A-3p后肌成纖維細胞表型標志物α平滑肌肌動蛋白表達增加,Smad2和Smad4作用增強,從而促進成纖維細胞向肌成纖維細胞的分化。Yang等[24]發(fā)現(xiàn)在TGF-β誘導(dǎo)的肺成纖維細胞和IPF患者的肺組織中,miR145表達上調(diào)，在肺成纖維細胞中轉(zhuǎn)染miR145模擬物可促進α-平滑肌肌動蛋白的表達,并促進局灶性粘連和纖維性粘連的形成，進成纖維細胞向肌成纖維細胞的分化，然而,miR-145表達陰性的小鼠不易被博萊霉素誘導(dǎo)為肺纖維化。由此可見，miR-27A-3p和miR-145可能通過促進成纖維細胞向肌成纖維細胞分化，從而促進肺纖維化。

5 miRNAs和巨噬細胞

巨噬細胞極化在人類疾病的發(fā)病機制中起著重要作用,而巨噬細胞極化受多種轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控,STAT1負責(zé)M1極化,STAT6負責(zé)M2激活,IL-4和IL-13通過激活STAT6通路從而促進M2極化[25]。IL-4和IL-13可誘導(dǎo)巨噬細胞上調(diào)miR-142-5p的表達，通過靶向STAT6磷酸化的負調(diào)控因子SOCS1，從而延長STAT6磷酸化，IL-4和IL-13可誘導(dǎo)巨噬細胞下調(diào)miR-130a-3p的表達，解除其對PPARγ的抑制,從而協(xié)調(diào)STAT6信號轉(zhuǎn)導(dǎo)。抑制miR-142-5p和增加miR-130a-3p可調(diào)節(jié)巨噬細胞促纖維化的能力,從而抑制博萊霉素誘導(dǎo)的小鼠肺纖維化[26]。

6 miRNAs與細胞衰老

研究表明,細胞衰老在IPF的發(fā)生發(fā)展中起著重要作用。AEC衰老的機制以及AEC衰老在IPF病理中的作用尚不清楚。有證據(jù)表明miR-34a、miR-34b和miR-34c可能是與細胞衰老有關(guān),這些miRNAs在IPF患者的Ⅱ型AECs中顯著上調(diào)。另一份研究表明,miR-34a在人和小鼠肺成纖維細胞中都顯著上調(diào),并且miR-34a基因敲除后會比野生型動物發(fā)生更嚴重的肺纖維化[27]。有趣的是，肺成纖維細胞中miR-34a的增加導(dǎo)致肺成纖維細胞的衰老表型，因為miRNA促進衰老標志物的表達，激活β半乳糖苷酶活性，并抑制細胞增殖。綜上所述，紊亂的miR-34a通過負反饋機制促進肺成纖維細胞的衰老，從而在IPF的發(fā)病機制中抑制肺纖維化過程[28]。

7 miRNA和TGF-β1信號轉(zhuǎn)導(dǎo)

研究表明TGF-β1可促進上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化、成纖維細胞激活聚集,細胞外基質(zhì)沉積最終導(dǎo)致肺纖維化,TGF-β1信號通路是介導(dǎo)肺纖維化的關(guān)鍵因素[29]。在肺纖維化模型中，TGF-β1誘導(dǎo)WISP1表達，miR-92a可逆轉(zhuǎn)TGF-β1誘導(dǎo)的WISP1表達，而miR-92a基因敲除可增加WISP1的表達，表明miR-92a可通過調(diào)節(jié)TGF-β1誘導(dǎo)的WISP1在肺纖維化中的表達，從而影響肺纖維華，這將有助于我們尋找新的IPF診斷和治療靶點[30]。Das等[31]發(fā)現(xiàn)，miR-326可以調(diào)節(jié)TGF-β1的表達，并且在肺纖維化中miR-326的水平與TGF-β1的蛋白水平呈負相關(guān)，轉(zhuǎn)染miR326模擬物可以抑制TGF-β1的表達,減輕肺纖維化,提示該miRNA對肺纖維化的發(fā)生、發(fā)展有一定的調(diào)節(jié)作用。此外,miR-326還可以直接下調(diào)促纖維化基因Ets1、Smad3和基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP)9,而上調(diào)抗纖維化基因Smad7。

8 miRNA和膠原的產(chǎn)生

IPF的特征是成纖維細胞異常增生,過度分泌Ⅰ型膠原沉積在肺泡壁,從而影響肺泡細胞的通氣功能,引起呼吸功能障礙。Hansen等[32]發(fā)現(xiàn)IPF中miR-29c的表達減少,而Ⅰ型膠原的表達增加,表明miR-29c可能通過影響Ⅰ型膠原而影響IPF的發(fā)病。Khalil等[33]進一步研究表明,IPF成纖維細胞中蛋白磷酸酶(PP)2A的功能異常低下,導(dǎo)致組蛋白脫乙?；?HDA)C4磷酸化,miR-29c降低,而過表達HDAC4可以恢復(fù)miR-29c的水平,并抑制Ⅰ型膠原的產(chǎn)生。

9 miRNA表達的調(diào)控機制

長非編碼RNA(Long Non-Coding RNAs，LncRNAs)影響miRNA的表達。lncRNAs廣泛分布于哺乳動物體內(nèi)，是一類具有200多個堿基的RNA分子，其功能類似于RNA，幾乎沒有蛋白質(zhì)編碼能力[34]。大多數(shù)lncRNAs是由RNA聚合酶II催化的，但它們的序列保守性較差，在組織和細胞中具有很強的特異性[35]。最近的研究表明,lncRNAa參與了許多重要的調(diào)控過程,如基因組印跡、染色質(zhì)修飾、X染色體沉默、轉(zhuǎn)錄激活、轉(zhuǎn)錄干擾和核轉(zhuǎn)運,這些調(diào)控作用也引起了廣泛的關(guān)注。有證據(jù)表明,lncRNAs在多個水平上參與細胞分化和個體發(fā)育調(diào)節(jié),并與人類疾病密切相關(guān),但目前尚不清楚lncRNAs是否參與IPF[36]。Huang等[37]利用IPF中表達異常的miRNAs,包括let-7d、miR-21、miR-29、miR-31、miR-101和miR-199,共鑒定出34個與這些miRNAs具有潛在結(jié)合位點的lncRNA,其中4個lncRNAs與這些紊亂的miRNAs呈負相關(guān),沉默lncRNA CD99P1可抑制肺成纖維細胞增殖和α-平滑肌肌動蛋白的表達,敲除lncRNAn341773可以增加肺成纖維細胞膠原表達,以上發(fā)現(xiàn)提示CD99P1和n341773參與了IPF的發(fā)病機制,lncRNAs和miRNAs的相互作用在IPF的發(fā)病機制中起重要作用,是IPF發(fā)病機制研究的新方向。

miRNA之間相互作用影響miRNA的表達。每個miRNA可以有多個靶基因，多個miRNA也可以調(diào)控同一個基因。這個復(fù)雜的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)可以是幾個miRNA的組合來精細調(diào)控一個基因的表達，也可以通過miRNA之間的相互調(diào)控來從而影響疾病的病理過程。Liang等[38]發(fā)現(xiàn)，Lin28B通過抑制Let-7d促進EMT，而抑制LIN28B則可以抑制TGF-β1誘導(dǎo)的肺纖維化和EMT。有趣的是，Lin28B是miR-26a的直接靶標之一，增加miR-26a可以通過抑制Lin28B而從而增強let-7d的表達，表明Lin28B介導(dǎo)了miR-26a對let-7d的調(diào)控作用。本研究提出了一種新的miRNA調(diào)控途徑，即一種miRNA與另一種miRNA相互作用可影響IPF的發(fā)病機制。

miRNAs和DNA甲基化的相互作用影響miRNA的表達。miRNA啟動子可能存在于DNA甲基化位點,miRNAs也可能通過抑制DNA甲基轉(zhuǎn)移酶(DNMT)參與DNA甲基化機制。在IPF患者的肺活檢和肺成纖維細胞中,miR-17～92的表達明顯低于對照組，而miR-17～92啟動子的DNMT 1表達和甲基化程度顯著高于對照組。結(jié)合其他數(shù)據(jù)，可以肯定在肺纖維化中，miR-17～92和DNMT 1之間存在一個新的表觀遺傳反饋環(huán)[39]。

10 結(jié)論與展望

miRNAs在IPF的發(fā)病機制中也發(fā)揮著重要作用。許多研究表明miRNA模擬物或抑制劑對多種人類疾病具有治療效果。不幸的是雙鏈RNA穩(wěn)定性很差，極易被RNase等酶修飾失去治療作用。一些核酸藥物由于特定的分子機制,如天然免疫反應(yīng)的激活,目前也無法用于臨床治療。最近,Yamaada等[40]開發(fā)了一種新型的miR-29b模擬物,它類似于“PNK-RNA”和“PSH-RNA”，并且這種新穎的RNA平臺結(jié)構(gòu)不僅可以適用于miR-29b，而且可以適用于所有的miRNAs。這種新型的模擬RNA“miR-29b PSH-Match”對博萊霉素誘導(dǎo)的小鼠肺間質(zhì)纖維化有明顯的治療作用，吸入miR-29b PSH-Match可用于IPF患者的治療。這種新型miRNA藥物的出現(xiàn)有著極其重要的價值，通過人們對miRNA的進步一步研究，miRNA藥物可能為治療IPF最有效的方式。

對部分miRNAs的研究表明,miRNAs參與了生命過程中的一系列重要過程,包括細胞增殖、凋亡、細胞死亡、脂肪代謝和細胞分化。根據(jù)我們的綜述,miRNAs在IPF患者的血液和肺組織中差異表達,并與IPF的發(fā)病機制密切相關(guān)。此外,miRNAs被證實參與IPF的病理機制,如肺上皮修復(fù)、EMT、成纖維細胞激活、肌成纖維細胞分化、巨噬細胞極化、AEC衰老和膠原生成等。此外,在IPF的病理過程中,許多因素被認為是miRNA異常表達的調(diào)節(jié)器。這些調(diào)節(jié)因子可以通過影響特異性miRNAs的表達來影響IPF的發(fā)病。這些發(fā)現(xiàn)提示miRNAs可能是IPF的診斷和治療靶點,也是IPF疾病預(yù)后的指標。miRNAs可能成為一種全新的治療IPF疾病的方法。