李琳 夏洪蓮 張月順 胡春陽 崔曉爽 蘆相玉

牡丹江醫(yī)學院附屬紅旗醫(yī)院麻醉科，黑龍江牡丹江 157011

褪黑素在牛的松果體中提取，其能分泌一種具有神經(jīng)內(nèi)分泌活性的物質，進入血液中，參與血液循環(huán)，從而對身體各器官和組織細胞發(fā)揮對應的作用。目前許多研究證實，褪黑素可以參與許多生物調(diào)節(jié)過程，如節(jié)律性、免疫、神經(jīng)內(nèi)分泌調(diào)節(jié)，甚至用于腫瘤的防治、催眠鎮(zhèn)痛、清除自由基及延緩衰老等[1-4]。術后認知功能障礙（post operative cognitive dysfunction，POCD）是指術后記憶力、學習力、認知力等功能受到一過性甚至永久性損傷，致使社會活動能力減退[5]。但POCD 發(fā)生機制尚未完全明確，目前對POCD 的發(fā)生機制主要傾向于應激、創(chuàng)傷所引起的炎性反應，多數(shù)認為血清中腫瘤壞死因子（tumor necrosis factor-alpha，TNF-α）、白細胞介素-10（interleukin-10，IL-10）的釋放與POCD的產(chǎn)生密切相關[6,7]，因褪黑素與免疫、內(nèi)分泌調(diào)節(jié)和清除自由基功能有關[8,9]，故本實驗旨在探討褪黑素是否可以通過免疫調(diào)節(jié)來降低 POCD 的發(fā)生，現(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

褪黑素（西亞化學科技有限公司），Rat IL-6 ELISA 試劑盒（欣博盛生物科技有限公司），DW-2000 型小型動物呼吸機（上海嘉鵬科技有限公司）、Morris 水迷宮視頻分析系統(tǒng)（北京眾實迪創(chuàng)科技發(fā)展有限公司）、低溫冰箱（SANYO MDF-436）。

1.2 實驗動物

選擇健康雄性老年大鼠64 只（24 月齡，體質量300～350g），飼養(yǎng)環(huán)境22～26℃，濕度40%～47%，無聲、光等刺激，充足食物及水分供應，光照時間12h，黑暗循環(huán)，64 只大鼠均按清潔級標準飼養(yǎng)，由牡丹江醫(yī)學院動物實驗中心提供，實驗動物許可證號：SYXK（黑）2019-006。大鼠來源于SPF 級動物房，黑白周期各為12h，自由攝食飲水。經(jīng)牡丹江醫(yī)學院紅旗醫(yī)院倫理委員會許可，操作符合實驗動物倫理學要求。

1.3 實驗分組

采用隨機數(shù)字表法分4 組，每組16 只（n=16），分為空白組（blank group，B 組）、對照組（control group，C 組）、氯化鈉組（sodium chloride group，NS 組）和褪黑素組（melatonin group，MT 組）。

1.4 模型制備

根據(jù)Murata等[10]缺血再灌注模型制備方法加以利用改進，予5%戊巴比妥鈉溶液，以50mg/kg 劑量腹腔注射誘導麻醉，實驗過程中使用加溫毯，將體溫保持37℃。為了壓縮雙側后肢，根據(jù)Murata等[10]的修改方法，將Rosenthal13 用于小鼠的卡式止血帶制備一對橡膠止血帶。在金屬圓筒（外徑22mm、內(nèi)徑20mm、長70mm）上纏繞5 圈，承受重量2kg，施加寬2.4cm、厚1mm 的橡膠止血帶。將大鼠腹面向上舉起，其腳通過金屬圓筒落下。通過將止血帶推到大鼠大腿上來誘導后肢壓迫一段時間后，通過切割和取下止血帶解除壓迫。止血帶拉力等同于3kg 重物的壓力，5h 后撤除止血夾恢復擠壓肢體血流灌注，其間大鼠能自由獲取食物與水。

1.5 藥物干預

空白組（B 組）除腹腔予5% 戊巴比妥鈉（上海上藥新亞藥業(yè)有限公司，生產(chǎn)批號：國藥準字：H31020240）麻醉外無任何處理、對照組（C 組）擠壓肢體前無藥物干預、氯化鈉組（NS 組）擠壓肢體前30min 予10ml/kg 生理鹽水和褪黑素組（MT 組）擠壓肢體前30min 予10ml/kg 褪黑素溶液，給藥方式均通過大鼠尾靜脈5min 內(nèi)推注。

1.6 水迷宮實驗測試

水迷宮實驗測試即學習記憶功能測試，于術前、術后1～5d 測試，時間定為每天上午9 點，根據(jù)測定方法進行[11]，測試儀自動得出逃避潛伏期、跨越平臺次數(shù)以及目標象限停留時間百分比。

1.7 TNF-α、IL-10 水平檢測

術前、術后1d、3d、5d 采集尾靜脈血1ml，采用酶聯(lián)免疫吸附法（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）測定TNF-α、IL-10 水平。

1.8 統(tǒng)計學方法

采用SPSS 20.0 統(tǒng)計學軟件對數(shù)據(jù)進行處理分析，多組間比較采用重復測量設計的方差分析，計量資料以均數(shù)±標準差（）表示，P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 定位航行實驗結果

4 組大鼠實驗過程中均無死亡，均未見麻醉相關并發(fā)癥發(fā)生。4 組游泳速度比較，差異無統(tǒng)計學意義，說明無疼痛等干擾水迷宮測試結果。

通過方差分析定位航行實驗結果顯示，隨著時間的推移，各組潛伏期逐漸縮短，說明認知能力逐漸恢復中。除空白組及褪黑素組術后5d 外，與術前1d 比較，其他5 個時點潛伏期均顯著延長（P＜0.05），與空白組比較，其他3 組潛伏期顯著延長（P＜0.05），與對照組比較，褪黑素組的潛伏期顯著縮短（P＜0.05），與氯化鈉組比較，褪黑素組的潛伏期顯著縮短（P＜0.05），見表1。

表1 各組潛伏期比較（）

表1 各組潛伏期比較（）

注：與術前1d 比較，*P＜0.001；與B 組比較，#P＜0.001；與C 組比較，ΔP＜0.05；與NS 組比較，▲P＜0.05

2.2 空間探索實驗結果

定位航行實驗包括目標象限停留時間百分比和穿越平臺次數(shù)，通過記錄120s 內(nèi)在目標象限探索時間和準確穿越平臺的次數(shù)，算出目標象限停留時間百分比，其反映實驗對象的記憶功能。百分比越低，穿越平臺次數(shù)越少，記憶功能越差。第6 天空間探索實驗軌跡直觀地顯示了大鼠的穿越平臺次數(shù)和目標象限（第3 象限）停留時間，見表2、表3。

與空白組比較，對照組和氯化鈉組穿越平臺次數(shù)顯著減少（P＜0.001），與對照組比較，褪黑素組穿越平臺次數(shù)顯著增加（P＜0.01），與氯化鈉組比較，褪黑素組穿越平臺次數(shù)顯著增加（P＜0.05），見表2。

表2 穿越平臺次數(shù)與目標象限停留時間百分比（）

表2 穿越平臺次數(shù)與目標象限停留時間百分比（）

注：與B 組比較，*P ＜0.001；與C 組比較，#P ＜0.05，與NS 組比較，ΔP＜0.05

與空白組比較，對照組和氯化鈉組目標象限停留時間百分比顯著減少（P＜0.001），與對照組比較，褪黑素組目標象限停留時間百分比顯著增加（P＜0.01），與氯化鈉組比較，褪黑素組目標象限停留時間百分比顯著增加（P＜0.01），見表2。

與B 組比較，MT 組趨向性較好，兩組差異無統(tǒng)計學意義，C 組和NS 組相對穿越平臺次數(shù)和目標象限停留時間較B 組和MT 組少。

2.3 炎癥因子水平

2.3.1 血清IL-10 水平的變化 與術前1d 比較，對照組、氯化鈉組、褪黑素組術后1、3、5d IL-10 水平顯著升高（P＜0.05）；與空白組比較，其他3 組術后1、3、5d IL-10 水平顯著升高（P＜0.001）；與對照組比較，褪黑素組IL-10 水平顯著降低（P＜0.05）；與氯化鈉組比較，褪黑素組IL-10 水平顯著降低（P＜0.05），見表3。

表3 大鼠各時點血清IL-10 水平比較（，pg/ml）

表3 大鼠各時點血清IL-10 水平比較（，pg/ml）

注：與術前1d 比較，*P＜0.05；與B 組比較，#P＜0.001；與C 組比較，ΔP＜0.05；與NS 組比較，▲P＜0.05

2.3.2 血清TNF-α 水平的變化 與術前1d 比較，對照組、氯化鈉組、褪黑素組術后1、3、5d TNF-α 水平顯著升高（P＜0.05）；與空白組比較，其他3 組術后1、3、5d TNF-α 水平顯著升高（P＜0.001）；與對照組比較，褪黑素組 TNF-α 水平顯著降低（P＜0.05）；與氯化鈉組比較，褪黑素組TNF-α 水平顯著降低（P＜0.05），見表4。

表4 大鼠各時點TNF-α 水平比較（，pg/ml）

表4 大鼠各時點TNF-α 水平比較（，pg/ml）

注：與術前1d 比較，*P＜0.001；與B 組比較，#P＜0.001；與C 組比較，ΔP＜0.05；與NS 組比較，▲P＜0.05

3 討論

POCD 的發(fā)病機制目前尚未完全闡明，但研究證實，炎癥因子可以影響POCD 的發(fā)生[11]。雌激素具有抗炎作用，缺血再灌注、麻醉和應激反應引起圍術期非特異性炎性反應，POCD 患者血漿IL-6、白細胞介素-8（interleukin-8，IL-8）、TNF-α 等水平均高于未發(fā)生POCD 的水平[12]。

本研究對老年大鼠骨骼肌進行缺血再灌注造模[7]，此種造模引起炎癥相關細胞的激活和機體炎性反應狀態(tài)對中樞神經(jīng)系統(tǒng)產(chǎn)生多重影響，導致神經(jīng)功能和神經(jīng)膠質平衡的變化[13,14]。缺血再灌注與外周器官組織損傷引起神經(jīng)炎癥造成海馬區(qū)受損，是圍術期老年患者認知障礙的關鍵因素[15]。本實驗選擇水迷宮測試大鼠空間探索來檢測其認知功能，首先術前排除不會游泳的老年大鼠，著重從行為學、炎癥介質變化等方面進行觀察。本研究選擇褪黑素，因其具有抗氧化、抗炎活性[16-17]，近年來，褪黑素在缺血再灌注損傷相關實驗中廣泛應用，其具有對缺血再灌注局部及遠隔器官損傷的保護作用[18,19]。多數(shù)學者認為，褪黑素的這種保護作用與抑制氧自由基釋放、中性粒細胞的激活及炎性細胞因子的大量釋放密切相關，進而保護遠隔器官[20]。同時，缺血再灌注誘發(fā)全身炎性反應，可以導致神經(jīng)元損傷進而出現(xiàn)認知功能的減退，故認為褪黑素可以通過抑制炎性反應，抑制氧自由基的釋放，減輕神經(jīng)元的損傷從而降低認知功能障礙的發(fā)生率。

本研究發(fā)現(xiàn)，術后采用Morris 水迷宮實驗測試大鼠學習記憶能力，結果表明，4 組大鼠術后的游泳速度無顯著差異（游泳速度是用來評判疼痛程度及運動功能障礙引起的潛伏期改變），表明術后疼痛沒有干擾水迷宮的測試結果。與空白組比較，其他3組潛伏期顯著延長，說明造模對大鼠術后行為及認知功能具有一定影響；與對照組和氯化鈉組比較，褪黑素組的潛伏期顯著縮短、穿越平臺次數(shù)顯著增加、目標象限停留時間百分比顯著增加、術后1、3、5d TNF-α、IL-10 水平明顯降低，說明褪黑素可以明顯降低炎性反應水平，通過抑制炎性反應，抑制氧自由基的釋放，減輕神經(jīng)元的損傷從而降低認知功能障礙的發(fā)生率。本實驗結果表明，褪黑素預處理能夠抑制炎癥反應，減輕炎癥因子對中樞神經(jīng)系統(tǒng)的損害，降低術后POCD 的發(fā)生，更有利于提高患者的術后生存狀態(tài)和生活質量。

綜上所述，褪黑素預處理能夠減少老年大鼠骨骼肌缺血再灌注后認知功能障礙的發(fā)生率，降低應激炎性反應，提高術后生存質量。