高亞東，張珒珒，劉光輝

武漢大學(xué)中南醫(yī)院過敏反應(yīng)科（武漢 430071）

近年來，過敏性疾病的發(fā)病率不斷上升[1]。過敏原檢測是診斷過敏性疾病的重要手段，目前常用的方法包括體內(nèi)和體外檢測兩大類。體內(nèi)檢測包括皮內(nèi)試驗、皮膚點刺試驗（skin prick testing，SPT）、斑貼試驗和過敏原激發(fā)試驗；體外檢測包括血清中過敏原特異性免疫球蛋白E（specific Immunoglobulin E，sIgE）檢測和嗜堿性粒細胞活化試驗（basophil activation test，BAT）。皮膚試驗操作簡便、快捷，但易受藥物和皮膚狀況的影響，出現(xiàn)假陰性和假陽性結(jié)果；過敏原sIgE檢測雖受藥物影響小，但可檢測范圍小，難以對藥物和食物過敏進行檢測; 過敏原激發(fā)試驗是診斷過敏性疾病的金標準，但存在發(fā)生嚴重過敏反應(yīng)的風(fēng)險[2]。BAT可在體外模擬速發(fā)型過敏反應(yīng)過程，對于診斷過敏性疾病以及評估過敏原特異性免疫治療（allergen specific immunotherapy，AIT）的療效具有較好的應(yīng)用價值。BAT 可部分替代SPT和過敏原激發(fā)試驗，從而減少不良反應(yīng)的發(fā)生[3]。隨著技術(shù)的進步及過敏性疾病發(fā)病率的升高，BAT的臨床應(yīng)用趨于普及。本文就BAT的基本原理、評價指標及臨床應(yīng)用作一綜述。

1 嗜堿性粒細胞在過敏反應(yīng)中的作用

嗜堿性粒細胞屬于造血系統(tǒng)細胞，在骨髓發(fā)育成熟后進入血液循環(huán)[4]，其在外周組織分布較少，只在發(fā)生炎癥反應(yīng)時才進入外周組織[5]。嗜堿性粒細胞表面表達高親和力IgE受體（the highaffinity IgE receptor，F(xiàn)cεRⅠ），受抗原等刺激后，釋放一系列炎癥介質(zhì)，如組胺、半胱氨酸白三烯、前列腺素D2、白細胞介素（interleukin，IL）-4、IL-13、IL-6、胸腺基質(zhì)淋巴細胞生成素（thymic stromal lymphopoietin，TSLP）和B細胞活化因子等，參與IgE介導(dǎo)的過敏反應(yīng)，如食物過敏、藥物過敏、昆蟲叮咬過敏和嚴重過敏反應(yīng)等[5-6]。

嗜堿性粒細胞參與了2型炎癥反應(yīng)過程[7]。對于過敏性鼻炎和過敏性哮喘，受塵螨等抗原刺激后，氣道上皮細胞分泌TSLP[8]，促進嗜堿性粒細胞分泌IL-4[9]，IL-4通過促進輔助性T細胞2（T helper 2 cell，Th2）或2型天然淋巴細胞（type 2 innate lymphoid cells，ILC2）分化，導(dǎo)致2型炎癥反應(yīng)[10]。嗜堿性粒細胞也參與了特應(yīng)性皮炎的發(fā)生[11]。此外，TSLP誘導(dǎo)嗜堿性粒細胞釋放IL-4，促進食物過敏原的經(jīng)表皮致敏[12]。嗜堿性粒細胞還可通過胞啃機制，從樹突狀細胞獲得主要組織相容性復(fù)合體Ⅱ分子，獲得抗原遞呈功能，并參與Th2型反應(yīng)[7]。

2 嗜堿性粒細胞活化試驗

2.1 概述

BAT是一種體外過敏反應(yīng)檢測方法，可在體外模擬體內(nèi)I型超敏反應(yīng)過程，用于過敏原的體外檢測和AIT的療效評估。其利用流式細胞術(shù)檢測嗜堿性粒細胞表面活化標志物的表達。當抗原或抗IgE抗體誘導(dǎo)IgE受體FcεRI交聯(lián)后，這些活化標志物的表達將上調(diào)[13]。通常采用外周靜脈全血或分離的外周血單個核細胞（peripheral blood mononuclear cells，PBMCs）進行 BAT。PBMCs分離需密度梯度離心等程序，可能造成細胞丟失和背景活化，影響結(jié)果判斷。全血更接近嗜堿性粒細胞的體內(nèi)環(huán)境，更符合生理狀態(tài)。全血BAT 應(yīng)在采血后4 h內(nèi)進行，以保持嗜堿性粒細胞最大活性和功能。隨著離體時間增加，嗜堿性粒細胞活性下降[14]。

2.2 BAT過敏原和刺激液的選擇

應(yīng)根據(jù)患者的病史選用最可能的過敏原進行BAT。SPT和（或）血清過敏原sIgE的檢測結(jié)果可為過敏原的選擇提供參考[4]。過敏原可采用粗提物、純化或重組的單一組分，相較粗提物，重組過敏原具有更好的穩(wěn)定性和一致性[4]。為便于不同實驗室之間數(shù)據(jù)比較，建議采用標準化過敏原。試驗需記載過敏原的來源、濃度及濃度單位、生產(chǎn)批號及生產(chǎn)廠家[4]。對于過敏原粗提物，應(yīng)采用標準化的提取方法，并在不同濃度下測試嗜堿性粒細胞的反應(yīng)性，如嗜堿性粒細胞被激活，則應(yīng)使用該過敏原在1～3名健康個體中測試其特異性，排除假陽性[4]。

5%～10%的過敏患者在抗原或抗IgE刺激后，嗜堿性粒細胞不會出現(xiàn)組胺釋放反應(yīng)，但對非特異性刺激如趨化肽N-甲酰-甲硫氨酰-亮氨酰-苯丙氨酸（N-formylmethionyl-leucyl-phenylalanine，fMLP）仍存在反應(yīng)，這類患者被稱為無反應(yīng)者[15]，其發(fā)生機制可能與細胞內(nèi)信號傳導(dǎo)途徑缺陷有關(guān)[16]，但這些BAT或組胺釋放試驗無反應(yīng)者仍可能出現(xiàn)過敏癥狀和SPT陽性（由肥大細胞介導(dǎo)）[4]。因此，BAT的陽性對照應(yīng)包括IgE依賴（如抗FcεRI或抗IgE抗體）和非IgE依賴的刺激（如fMLP）[4]，陰性對照只包含刺激緩沖液，以評價背景活化水平，如使用IL-3進行預(yù)刺激，則需另增加一組含有IL-3的陰性對照[4,17]。

2.3 嗜堿性粒細胞活化標志物

進行BAT時，需特異性表面標志物來鑒定嗜堿性粒細胞，常用鑒定標志物包括CCR3+、CD123+/HLADR-、CRTH2+和 CD193+等[4]。隨著研究的深入，越來越多的表面活化標志物被發(fā)現(xiàn)，包括 CD11b、CD13、CD63、CD69、CD107a、CD164、CD203c和 CD300c[4,18-21]，其中 CD63、CD203c和CD69應(yīng)用最為廣泛，相關(guān)試劑盒已用于臨床檢測。根據(jù)表面標志物活化的生物學(xué)機制可分為三類：①顆粒膜成分，脫顆粒時與細胞膜融合，從而表達在細胞表面，如CD63和CD107；②快速釋放型囊泡，對IL-3等刺激產(chǎn)生反應(yīng)，但不一定有介質(zhì)釋放，如CD13、CD11b、CD164和CD203c；③新合成蛋白，需數(shù)小時完成轉(zhuǎn)錄、翻譯和轉(zhuǎn)運過程，包括ST2和CD69[22]?？筛鶕?jù)研究目的選擇不同活化標志物或綜合判斷BAT結(jié)果?？傮w上，目前發(fā)現(xiàn)的活化標志物表達對BAT特異性較高，但敏感性相對較低，因此需進一步尋找較為敏感的其他表面標志物或表面標志物的組合，以提高BAT的敏感性和特異性。

2.4 BAT結(jié)果表達和解讀

BAT檢測嗜堿性粒細胞表面活化標志物的表達水平，即CD63+和（或）CD203c+嗜堿性粒細胞的百分比，可采用反應(yīng)性和敏感性兩種指標表示。反應(yīng)性可用某一抗原濃度刺激下CD63+嗜堿性粒細胞的百分比表示，也可用出現(xiàn)最大比例嗜堿性粒細胞活化時的抗原濃度（CD-max）表示；敏感性可用能引起50%最大比例嗜堿性粒細胞活化時的抗原濃度（EC50）表示，也可用嗜堿性粒細胞過敏原閾值敏感性（basophil allergen threshold sensitivity，CD-sens）表示，計算公式為CD-sens=1/EC50×100[4,22]。反應(yīng)性與嗜堿性粒細胞的預(yù)激狀態(tài)以及IgE信號的細胞內(nèi)傳導(dǎo)有關(guān)，而敏感性是反應(yīng)性的函數(shù)，與細胞表面過敏原sIgE、過敏原的親和力、血液中游離的競爭性免疫球蛋白親和力有關(guān)。檢測反應(yīng)性時需設(shè)置陽性對照，過敏原的陽性反應(yīng)也需在臨床背景下進行解讀[4]。

敏感性檢測前通常先確定嗜堿性粒細胞的反應(yīng)性。根據(jù)6～8個濃度梯度過敏原的反應(yīng)性進行劑量-效應(yīng)曲線擬合，分別計算EC50和CD-sens[4,17]。也可用劑量-效應(yīng)曲線的曲線下面積（area under curve，AUC）反映細胞活化狀態(tài)[4]。當嗜堿性粒細胞活化狀態(tài)下降時，劑量-效應(yīng)曲線右移，其反應(yīng)性可以不變，但敏感性下降，同時AUC下降[22]。綜合利用這些指標有助于BAT結(jié)果的分析和評價。

3 嗜堿性粒細胞活化試驗的臨床應(yīng)用

3.1 食物過敏

食物過敏發(fā)生率不斷增加，兒童尤為明顯[23]，根據(jù)其發(fā)生機制，大致可分為IgE介導(dǎo)和非IgE介導(dǎo)兩類[23-24]。食物過敏常用的診斷方法包括SPT、食物sIgE檢測以及口服食物激發(fā)試驗（oral food challenge，OFC)。前兩種方法敏感性高，但特異性較低，雙盲安慰劑對照OFC是診斷食物過敏的金標準，但操作復(fù)雜，有發(fā)生嚴重過敏反應(yīng)的風(fēng)險[24-25]。BAT對食物過敏診斷的準確性較高，且能夠區(qū)分單純食物致敏（食物sIgE升高但無癥狀）還是食物過敏[26]。有研究顯示BAT診斷花生過敏的特異性達100%[26]，另有研究顯示BAT對花生過敏原組分如Ara h 2和Ara h 6具有較高的診斷準確性[27]。此外，嗜堿性粒細胞的活化率也可反映食物過敏的嚴重程度[28]。BAT還可用于檢測食物過敏的進程。對接受口服免疫治療（oral immunotherapy，OIT）的花生過敏患者進行定期BAT檢測，發(fā)現(xiàn)停止治療后對花生過敏原呈現(xiàn)持續(xù)無反應(yīng)者，Ara h 2抗原誘導(dǎo)的BAT活性在脫敏治療早期明顯下降；相反，對花生過敏原短暫耐受者的BAT敏感性在OIT治療的早期和晚期均無變化，且嗜堿性粒細胞的AUC出現(xiàn)反彈，提示BAT可用于花生過敏者OIT療效的預(yù)測和評估[29]。

3.2 藥物過敏

藥物引起的過敏反應(yīng)較為復(fù)雜，包括I型超敏反應(yīng)和其他類型的超敏反應(yīng)[30]。由于藥物的半抗原特性，常與其他蛋白結(jié)合引起過敏反應(yīng)，因此表位難以確定，臨床上同時應(yīng)用幾種藥物時體內(nèi)的免疫反應(yīng)特點和臨床表現(xiàn)變化較大[31]。藥物激發(fā)試驗是診斷藥物過敏反應(yīng)的金標準，但耗時長，且存在發(fā)生嚴重過敏反應(yīng)的風(fēng)險，限制了其應(yīng)用[32]，因此BAT等體外診斷方法在藥物過敏反應(yīng)診斷和評價中的應(yīng)用逐漸增多[15]。目前BAT已用于神經(jīng)肌肉阻斷劑、β-內(nèi)酰胺類抗生素、非甾體類抗炎藥、放射造影劑、洗必泰、明膠和羥甲基纖維素等過敏的診斷[33]。研究顯示BAT對抗生素過敏的診斷特異性達92%，對非甾體類抗炎藥過敏的診斷特異性達100%[34]。另有研究顯示，BAT可減少對阿莫西林克拉維酸鉀過敏患者進行不必要的藥物激發(fā)試驗[35]。此外，BAT也可輔助判斷鉑類化療藥物過敏患者快速脫敏時發(fā)生嚴重過敏反應(yīng)的情況，若CD63+和CD203c+嗜堿性粒細胞比例高，則提示較高的嚴重過敏反應(yīng)發(fā)生風(fēng)險[36]。藥物過敏BAT的臨床應(yīng)用尚有以下關(guān)鍵問題待探索：①最佳藥物濃度；②BAT陽性閾值；③試驗所需最少嗜堿性粒細胞數(shù)量；④藥物可溶性；⑤血液樣本的制備（全血或分離的PBMCs）；⑥最佳處理條件（如IL-3預(yù)刺激、預(yù)溫、孵育時間等）[33]。對藥物過敏患者進行詳細的病史采集同時結(jié)合BAT檢測結(jié)果，可減少開展藥物激發(fā)試驗及其發(fā)生風(fēng)險[33]。除常規(guī)BAT外，也可進行被動致敏BAT來輔助診斷藥物過敏[33]。

3.3 氣道過敏性疾病

3.3.1 過敏性鼻炎

BAT在過敏性鼻炎中的應(yīng)用尚存爭議。一項研究比較了塵螨和艾蒿過敏性鼻炎患者AIT治療前與治療24個月后嗜堿性粒細胞反應(yīng)性的變化情況，發(fā)現(xiàn)塵螨抗原的嗜堿性粒細胞反應(yīng)性前后無變化，艾蒿抗原的嗜堿性粒細胞反應(yīng)性則顯著下降，但兩種過敏原的嗜堿性粒細胞反應(yīng)性變化與過敏性鼻炎的臨床癥狀改善之間無相關(guān)性[37]。血清sIgE和SPT難以準確診斷局部過敏性鼻炎[38]，對于這類患者，盡管外周血中總IgE水平并無升高，但采用BAT仍可鑒定IgE介導(dǎo)的過敏反應(yīng)，且敏感性較高。嗜堿性粒細胞的敏感性與鼻激發(fā)試驗的抗原滴度和支氣管激發(fā)試驗的陽性閾值呈正相關(guān)，但BAT能否代替鼻激發(fā)試驗診斷局部過敏性鼻炎仍存爭議[39]。目前研究多用嗜堿性粒細胞反應(yīng)性作為評價指標，但其敏感性和特異性較低，需采用CD-sens或多種活化指標進行綜合判斷。

3.3.2 過敏性哮喘

常用CD-sens對過敏性哮喘患者的BAT檢測結(jié)果進行評價。CD-sens越高，表示對過敏原的敏感性越高[40]。CD-sens與過敏原支氣管激發(fā)試驗時第1秒用力呼氣容積下降20%激發(fā)劑量呈相關(guān)性，提示可用CD-sens代替支氣管激發(fā)試驗評價患者對過敏原的敏感性[41]。兒童重度哮喘患者中有明顯癥狀者的CD-sens顯著高于控制良好者，而CD-sens與哮喘控制測試（asthma control test，ACT）評分和呼出氣一氧化氮（fractional exhaled nitric oxide，F(xiàn)eNO）水平呈顯著負相關(guān)，提示CD-sens可輔助評價哮喘患者的病情嚴重程度[42]。對于接受抗IgE單克隆抗體治療的過敏性鼻炎和（或）哮喘患者，CD-sens對于療效評價的敏感性高于反應(yīng)性[43]。

3.4 膜翅目昆蟲毒液過敏

膜翅目昆蟲叮咬可引起局部或全身過敏反應(yīng)，嚴重時可導(dǎo)致過敏性休克[44]。一項研究對蜜蜂、黃蜂和大黃蜂蜂毒過敏者分別進行SPT、血清sIgE和BAT檢測，結(jié)果顯示BAT的診斷敏感性接近sIgE檢測，但特異性明顯高于sIgE檢測，提示BAT對該類過敏患者診斷的陽性預(yù)測值較高[45]。對于昆蟲毒液脫敏治療（venom immunotherapy，VIT）患者，常規(guī)毒液SPT和sIgE檢測的臨床價值不大，有研究顯示在接受VIT 5年后，50%患者的sIgE檢測結(jié)果仍呈陽性，而SPT結(jié)果亦無顯著變化[46]。相對而言，BAT 對VIT患者的療效評價具有更大價值。VIT治療后耐受者BAT 敏感性顯著低于VIT治療后未耐受和未接受VIT治療的蜂毒液過敏者[47]。對VIT 患者進行長期觀察發(fā)現(xiàn)，以CD63為標志物的BAT結(jié)果呈動態(tài)變化，即在治療早期（1～3個月），嗜堿性粒細胞對毒液抗原刺激的反應(yīng)性下降，但3個月后出現(xiàn)上升，直到18個月后再次下降至較低水平或呈陰性并持續(xù)至治療結(jié)束，提示臨床應(yīng)用BAT評價VIT療效時要充分考慮患者的治療時長及個體差異[48]。

3.5 嚴重過敏反應(yīng)

研究發(fā)現(xiàn)在發(fā)生嚴重過敏反應(yīng)時，嗜堿性粒細胞水平下降，同時伴有趨化因子CCL2水平升高，提示在嚴重過敏反應(yīng)期間，嗜堿性粒細胞遷移至外周并參與了嚴重過敏反應(yīng)過程[49]。有嚴重過敏反應(yīng)史的患者，體內(nèi)試驗如過敏原皮試引起不良反應(yīng)的風(fēng)險增加。因此，sIgE和BAT等體外試驗是相對安全的診斷方法。食物過敏、膜翅目昆蟲毒液過敏和藥物過敏所致嚴重過敏反應(yīng)都可以采用相應(yīng)抗原進行BAT來輔助診斷，以降低皮試相關(guān)不良反應(yīng)風(fēng)險，并評估患者脫敏治療后的療效。一項研究測試了嚴重過敏反應(yīng)患者發(fā)作時的嗜堿性粒細胞活化水平，發(fā)現(xiàn)大部分患者的嗜堿性粒細胞CD203c表達水平無上升，經(jīng)抗IgE抗體刺激后其水平也未明顯上升，提示這些細胞可能已經(jīng)充分活化或多為不成熟嗜堿性粒細胞[50]。

3.6 過敏性輸血反應(yīng)

BAT也可用于過敏性輸血反應(yīng)（allergic transfusion reactions，ATR）的診斷。ATR是輸注血漿和濃縮血小板時最常見的輸血反應(yīng)[51]，目前認為主要由肥大細胞和嗜堿性粒細胞介導(dǎo)[52]。血漿類胰蛋白酶水平雖然可以用于ATR的診斷，但無法鑒別因果關(guān)系，因此應(yīng)用價值有限[53]。對輸注甲基藍處理的血漿后出現(xiàn)過敏反應(yīng)的患者血液和殘留血漿進行BAT時，所有患者均出現(xiàn)了由甲基藍誘導(dǎo)、IgE 介導(dǎo)的嚴重過敏反應(yīng)[51]。同樣，引起ATR 的殘留血漿上清液也可激活健康人嗜堿性粒細胞和ATR 患者自身的嗜堿性粒細胞，提示ATR 與輸血有關(guān)[51]。有研究發(fā)現(xiàn)，某些供血者存在抗IgE的IgG抗體，其血清會導(dǎo)致受血者出現(xiàn)嚴重過敏反應(yīng), 而BAT可能有助于鑒別此類供血者，從而減少ATR的發(fā)生[54]。血液腫瘤、再生障礙性貧血或?qū)嶓w腫瘤治療后骨髓抑制患者，由于體內(nèi)的嗜堿性粒細胞數(shù)量極低或缺乏，無法進行BAT，對該類患者可進行被動致敏BAT來輔助診斷ATR[55]。其方法與前述藥物過敏者的被動致敏BAT類似，以殘留的輸血制品作為過敏原以刺激嗜堿性粒細胞的活化。結(jié)果顯示，導(dǎo)致過敏的濃縮血小板上清液能夠活化患者IgE致敏的嗜堿性粒細胞，而無法活化正常個體IgE致敏的嗜堿性粒細胞，提示被動致敏BAT用于ATR的診斷具有較高的特異性[55-56]。

3.7 過敏原特異性免疫治療的療效評價和預(yù)測

如前所述，利用BAT檢測嗜堿性粒細胞對過敏原的敏感性是評價AIT療效的有效手段。CD-sens在AIT早期即可出現(xiàn)下降，且與血清IgG4 水平相關(guān)，但嗜堿性粒細胞反應(yīng)性無變化，提示CD-sens是AIT療效評價的敏感指標，優(yōu)于嗜堿性粒細胞反應(yīng)性[4]。CD-sens 在多種氣傳過敏原（如樺樹花粉、梯牧草花粉等）AIT治療后都可出現(xiàn)下降，也可用于食物過敏OIT和昆蟲毒液VIT治療的療效評價和預(yù)測[46]。VIT治療后早期出現(xiàn)的嗜堿性粒細胞活性抑制可能與誘導(dǎo)嗜堿性粒細胞表達抑制性組胺H2受體相關(guān)[57]。有研究報道嗜堿性粒細胞表達的二胺氧化酶也可以作為AIT反應(yīng)的生物標志物[58-59]。

4 結(jié)語

BAT作為IgE介導(dǎo)的過敏原體外診斷方法之一，在過敏性疾病的診斷和AIT療效評價中具有重要應(yīng)用價值，但尚需對試驗所需的過敏原（抗原）、操作過程和結(jié)果解讀進行標準化，以便于該方法的推廣和完善。