賀 凱，劉澤軍，胡茂川，劉丙軍，郝愛民，井芹寧

(1. 中山大學(xué) 土木工程學(xué)院，廣東 珠海 519082；2. 廣東省環(huán)境資源利用與保護(hù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣州 510640；3. 溫州大學(xué) 生命與環(huán)境科學(xué)學(xué)院，浙江 溫州 325035；4. 亞熱帶水環(huán)境生態(tài)保護(hù)浙江省國際科技合作基地，浙江 溫州 325035)

0 前 言

傳統(tǒng)水生生物監(jiān)測(cè)主要依靠觀測(cè)者對(duì)物種進(jìn)行形態(tài)學(xué)鑒定，因而對(duì)從事物種鑒定人員的專業(yè)知識(shí)要求較高，同時(shí)傳統(tǒng)的水生生物監(jiān)測(cè)方法可能會(huì)給水生生物或者其所在的水生生態(tài)系統(tǒng)帶來一定程度的危害導(dǎo)致其具有一定的局限性[1]。而環(huán)境DNA技術(shù)作為新興的水生生物監(jiān)測(cè)方法，基于當(dāng)前基因測(cè)序技術(shù)，可以通過檢測(cè)游離在水環(huán)境中的DNA分子檢測(cè)出對(duì)應(yīng)生物種類的存在。其相較于傳統(tǒng)水生生物形態(tài)學(xué)監(jiān)測(cè)方法而言具有經(jīng)濟(jì)、高效、準(zhǔn)確、靈敏等優(yōu)勢(shì)[2]。因此，近年來環(huán)境DNA檢測(cè)技術(shù)發(fā)展迅速，被廣泛應(yīng)用于流域入侵物種、瀕危物種監(jiān)測(cè)、生物量評(píng)估和生物多樣性調(diào)查等[3-5]。

環(huán)境DNA指在自然環(huán)境中廣泛分布的游離DNA分子，主要通過生物脫落的皮膚、唾液、糞便、配子、分泌物等方式獲得[6]。環(huán)境DNA分子大小不一，存在部分大于180 μm或小于0.2 μm的分子，DNA分子的大小可能與生物種類相關(guān)。運(yùn)用環(huán)境DNA的水生生物調(diào)查研究始于1987年，由美國田納西大學(xué)研究團(tuán)隊(duì)開發(fā)從環(huán)境(湖泊沉積物)中提取和純化細(xì)胞外DNA的方法[7]，隨后法國Ficetola等[8]通過針對(duì)棲息地池塘中提取牛蛙(Ranacatesbeiana)DNA信息，以此研究牛蛙棲息習(xí)慣。Minamoto等首次運(yùn)用環(huán)境DNA宏條形碼技術(shù)于魚類、兩棲動(dòng)物、鳥類和哺乳動(dòng)物等水環(huán)境生物監(jiān)測(cè)研究[9]。Doi等也通過對(duì)鯉魚環(huán)境DNA分析檢測(cè)來證明環(huán)境DNA宏條形碼技術(shù)在魚類乃至水生生物的定量評(píng)估中的潛力[10-11]。 Miya開發(fā)具有代表性的通用引物“MiFish”用于環(huán)境DNA宏條形碼技術(shù)，目前該引物可檢測(cè)到200多個(gè)魚種[12-14]。日本通過出版環(huán)境DNA研究和分析手冊(cè)等[15-16]指導(dǎo)環(huán)境DNA技術(shù)應(yīng)用研究，并建立基于大規(guī)模、高分辨率數(shù)據(jù)的生態(tài)系統(tǒng)解釋、預(yù)測(cè)和保護(hù)系統(tǒng)。

日本開展環(huán)境DNA研究較早，有著廣泛的應(yīng)用案例。近年環(huán)境DNA研究也被引導(dǎo)強(qiáng)化同其他研究領(lǐng)域的融合與合作，如生態(tài)系統(tǒng)的可持續(xù)利用和環(huán)境保護(hù)。本文在系統(tǒng)介紹環(huán)境DNA技術(shù)及其影響因素的基礎(chǔ)上，梳理日本運(yùn)用環(huán)境DNA技術(shù)在河流生態(tài)監(jiān)測(cè)與多樣性評(píng)價(jià)方面的研究成果，旨在為中國未來生態(tài)監(jiān)測(cè)和生物多樣性研究方面提供素材和借鑒。

1 日本環(huán)境DNA技術(shù)的發(fā)展歷程

日本在環(huán)境DNA技術(shù)的研究起步較早，Minamoto等[9]在對(duì)水族箱水樣進(jìn)行DNA提取和分析后，確認(rèn)所有水族箱魚種都被檢出。根據(jù)水族箱分析結(jié)果對(duì)3個(gè)自然河道現(xiàn)場采集的水樣開展環(huán)境DNA分析，并檢出自然河道中4個(gè)魚種，檢測(cè)結(jié)果同以往常規(guī)方法(觀察和捕捉方法)確定的魚種一致。環(huán)境DNA方法可以提供簡化的魚類等水生生物調(diào)查和監(jiān)測(cè)，日本科學(xué)家在之后的研究中成功利用環(huán)境DNA技術(shù)檢出日本淡水湖中魚類的物種組成，證明該方法在日本水環(huán)境中魚類調(diào)查研究中的適用性。Takahara等[10]利用環(huán)境DNA技術(shù)在室內(nèi)水箱和室外實(shí)驗(yàn)池中發(fā)現(xiàn)鯉魚(CyprinuscarpioL.)豐度與水中環(huán)境DNA濃度之間存在正相關(guān)關(guān)系，并利用環(huán)境DNA對(duì)天然潟湖中的鯉魚生物量進(jìn)行評(píng)估。從2008年至今，環(huán)境DNA技術(shù)在水生生態(tài)系統(tǒng)的研究經(jīng)歷了定性到定量，由檢測(cè)單一物種到同時(shí)檢測(cè)多種物種，從調(diào)查淡水水域擴(kuò)展到海洋，調(diào)查物種從小型底棲動(dòng)物擴(kuò)展到兩棲動(dòng)物、哺乳動(dòng)物等的發(fā)展歷程[17-20]。

為研究日本環(huán)境DNA技術(shù)發(fā)展歷程運(yùn)用CiteSpace[21]軟件對(duì)日本相關(guān)文獻(xiàn)進(jìn)行關(guān)鍵詞聚類分析，數(shù)據(jù)庫為Web of Science (WOS)核心數(shù)據(jù)庫(2022年6月28日)，搜索策略為TS=((“environmental DNA”O(jiān)R “eDNA”) AND (Japan OR Japanese))，共搜索文獻(xiàn)141篇。歷年文獻(xiàn)發(fā)表數(shù)量及年被引次數(shù)見圖1，從圖中可以看出環(huán)境DNA發(fā)文數(shù)量及年被引用次數(shù)均呈逐年上漲的趨勢(shì)，而發(fā)展突變點(diǎn)出現(xiàn)于2013—2016年，表明在該時(shí)間段環(huán)境DNA開始步入大眾科研關(guān)注領(lǐng)域。

2 環(huán)境DNA技術(shù)流程介紹及其影響因素

環(huán)境DNA技術(shù)分析主要包括樣品采集、樣品處理、DNA提取、PCR擴(kuò)增、基因測(cè)序、生物信息學(xué)以及統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。具體技術(shù)處理流程如圖2所示。

圖1 日本環(huán)境DNA發(fā)文數(shù)量及年被引次數(shù)

圖2 環(huán)境DNA技術(shù)處理流程

Jo等以環(huán)境DNA的生物放大作用，以馬鮫魚(Trachurusjaponicus)為標(biāo)本，對(duì)不同水溫和魚類生物量條件下的DNA脫落和降解過程進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)降解過程隨環(huán)境DNA大小發(fā)生變化，同時(shí)環(huán)境DNA濃度及其降解率也隨著水溫的升高和生物量增加而增加[22]。溝口等利用環(huán)境DNA技術(shù)對(duì)海上風(fēng)電設(shè)施附近開展魚類監(jiān)測(cè)，用來識(shí)別其周圍水域的魚種，對(duì)漁業(yè)影響評(píng)估方法的改善有很大的促進(jìn)作用[23]。Kabamoto等按照灌溉季節(jié)和非灌溉季節(jié)在全國10個(gè)農(nóng)業(yè)改良項(xiàng)目區(qū)的122個(gè)地點(diǎn)開展采樣，通過環(huán)境DNA技術(shù)在農(nóng)業(yè)水道中檢出15～40種魚類，通過比較采樣調(diào)查和以往調(diào)查數(shù)據(jù)結(jié)果，評(píng)估環(huán)境DNA技術(shù)在快速流動(dòng)水環(huán)境(如農(nóng)業(yè)水道等)中水生態(tài)調(diào)查的適用性并討論檢測(cè)假陽性等技術(shù)問題[24]。需要注意的是，其研究強(qiáng)調(diào)人類活動(dòng)影響下環(huán)境DNA污染問題，如檢測(cè)魚DNA檢測(cè)分析中存在實(shí)驗(yàn)室污染等。

聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)是一種體外核酸擴(kuò)增技術(shù)，用于放大與擴(kuò)增特定的DNA片段。因此，確定要擴(kuò)增的DNA片段對(duì)后續(xù)的eDNA測(cè)序分析具有至關(guān)重要的作用。在理想情況為了成功地進(jìn)行eDNA測(cè)序分析，PCR引物對(duì)和擴(kuò)增出的中間eDNA片段應(yīng)滿足以下要求：① 穩(wěn)定性，設(shè)計(jì)的通用PCR引物需要無偏差擴(kuò)增各目標(biāo)類群的基因片段，且不出現(xiàn)基因片段缺失；② 一致性，擴(kuò)增的片段應(yīng)包含足夠的變異以允許明確的分類分配；③ 特異性，引物應(yīng)是目標(biāo)類群的特定引物(如MiFish)。否則，來自非目標(biāo)分類群的DNA(原核生物和非目標(biāo)真核生物的DNA)將在擴(kuò)增產(chǎn)物中占主導(dǎo)地位。根據(jù)文獻(xiàn)調(diào)研對(duì)通用PCR引物進(jìn)行統(tǒng)計(jì)發(fā)現(xiàn)(見圖3)，MiFish引物占比最多(51.2%)，其次是Cyt b引物(34.9%)，日本常見魚類環(huán)境DNA引物(部分)基因序列表如表1所示。這些通用引物，不僅在日本，在我國生物多樣性研究中也開展了相關(guān)應(yīng)用研究[25-26]。從日本環(huán)境DNA研究地理分布圖上看，MiFish引物在日本全國的應(yīng)用案例較多，最近的日本政府調(diào)查項(xiàng)目也主要采用MiFish引物開展eDNA分析進(jìn)行生物多樣性監(jiān)測(cè)[27]。例如：日本國土交通省開展全國河流環(huán)境普查試點(diǎn)研究[28]；日本環(huán)境省生物多樣性中心推動(dòng)環(huán)境DNA標(biāo)準(zhǔn)化項(xiàng)目(https://www.biodic.go.jp/edna/edna_top.html)。而Cyt b引物則是在以瀨戶內(nèi)海為主的西日本地區(qū)應(yīng)用較為廣泛(見圖4)。

圖3 日本環(huán)境DNA發(fā)表論文引物頻率組成

圖4 日本環(huán)境DNA研究地理分布

表1 日本常見魚類環(huán)境DNA引物(部分)基因序列表

3 環(huán)境DNA技術(shù)在日本河流生物多樣性研究中的應(yīng)用

隨著環(huán)境DNA技術(shù)的不斷發(fā)展和基因庫的不斷完善，越來越多研究人員運(yùn)用環(huán)境DNA技術(shù)開展水生生物的物種鑒定。同時(shí)由于外來入侵物種、瀕危物種和稀有物種的監(jiān)測(cè)調(diào)查一直是傳統(tǒng)生物監(jiān)測(cè)研究的難題，環(huán)境DNA技術(shù)為上述問題的解決提供了一種新的思路。本部分針對(duì)生物多樣性調(diào)查、外來入侵物種的監(jiān)測(cè)、瀕危物種和稀有物種的監(jiān)測(cè)以及生物量評(píng)估方面的環(huán)境DNA研究及其技術(shù)應(yīng)用進(jìn)行介紹梳理。

通過Web of Science搜索文獻(xiàn)導(dǎo)入CiteSpace軟件，去重后剩余140篇有效文獻(xiàn)，文獻(xiàn)研究時(shí)間段為2005—2022年，本次研究以3 a為時(shí)間間隔，選取每年引用頻率前25的關(guān)鍵詞進(jìn)行聚類分析，共得到15類聚類(單一聚類關(guān)鍵詞小于5類時(shí)不顯示)，有效聚類9類(0號(hào) 影響因素、1號(hào) 浮游植物、2號(hào) 日本鰻魚、3 號(hào)日本竹莢魚、5號(hào) 日本鰻鱺、7號(hào)棲息地相關(guān)、8號(hào) 海洋、9號(hào) 大腸桿菌 14號(hào)、鑒別)，由于當(dāng)前研究處于發(fā)展階段，文獻(xiàn)較少，無法進(jìn)行關(guān)鍵詞突現(xiàn)性研究，本次研究以不同年間關(guān)鍵詞共現(xiàn)作為趨勢(shì)研究，相關(guān)聚類見圖5(a)(2008—2010年)、圖5(b)(2020—2022年)，其中圓形大小表示關(guān)鍵詞出現(xiàn)次數(shù)，同一圓形不同顏色環(huán)形為不同年份出現(xiàn)次數(shù)，連線表示關(guān)鍵詞存在共同出現(xiàn)，粗連線表示a、b特定年間關(guān)鍵詞存在共同出現(xiàn)。從圖中可以看出，除環(huán)境DNA，qPCR等綱領(lǐng)性關(guān)鍵詞外，以生物質(zhì)、豐度、河流、魚類、數(shù)量、瀕危物種、洄游、溫度、降解、琵琶湖等詞出現(xiàn)頻率較高，表明當(dāng)前環(huán)境DNA研究更多關(guān)注于物種(多指魚類)豐度、瀕危物種以及季節(jié)性物種的監(jiān)測(cè)領(lǐng)域，對(duì)于實(shí)驗(yàn)條件的關(guān)注則集中在溫度以及引物、環(huán)境DNA的降解速度等領(lǐng)域。圖5(a)(2008—2010年)顯示日本早期環(huán)境DNA技術(shù)主要以基因宏條形碼技術(shù)、qPCR擴(kuò)增為主，并開始應(yīng)用于琵琶湖流域生物監(jiān)測(cè)。從圖5(b)(2020—2022年)可以看出當(dāng)前日本環(huán)境DNA技術(shù)應(yīng)用開始全面擴(kuò)寬。在研究區(qū)域上，由傳統(tǒng)河湖研究邁向海洋；在技術(shù)研究上開始深入引物設(shè)計(jì)，引物種類得到擴(kuò)充，對(duì)實(shí)驗(yàn)最優(yōu)條件也進(jìn)行了一定的探索；在技術(shù)應(yīng)用上從種群監(jiān)測(cè)步向多元研究，在物種多樣性保護(hù)、瀕危物種、入侵物種監(jiān)測(cè)、季節(jié)性洄游魚類監(jiān)測(cè)等領(lǐng)域均進(jìn)行了較多研究。關(guān)鍵詞聚類表明當(dāng)前日本對(duì)環(huán)境DNA技術(shù)的研究已進(jìn)入較深入階段。

圖5 日本環(huán)境DNA關(guān)鍵詞聚類分析

3.1 生物多樣性調(diào)查

生物多樣性的有效保護(hù)對(duì)于人類的生存和生態(tài)系統(tǒng)的維持至關(guān)重要。生物多樣性評(píng)估基本上依賴于物種監(jiān)測(cè)，但傳統(tǒng)的物種形態(tài)學(xué)監(jiān)測(cè)難以滿足生物多樣性研究要求。因此，通過從環(huán)境樣本中提取DNA來獲取物種、種群和群落信息的方法能夠彌補(bǔ)傳統(tǒng)物種鑒定的不足。在魚類多樣性調(diào)查中，環(huán)境DNA宏條形碼方法作為一種全面檢測(cè)魚類等水生生物鑒定技術(shù)被提出。Miya等[12]開發(fā)的通用PCR 引物組(MiFsh-U/E)目前已在全球范圍內(nèi)廣泛使用。該引物是根據(jù)880個(gè)物種的線粒體完整基因組序列和160個(gè)板鰓亞類(鯊魚和鰩魚)物種的部分線粒體序列，針對(duì)12S rRNA基因的長可變區(qū)(163～185 bp)設(shè)計(jì)，檢出實(shí)驗(yàn)室180種海洋魚類中的168種(93.3%)，并在附近的珊瑚礁調(diào)查中也檢測(cè)到93種。

在其他水生生物多樣性調(diào)查中，Kayano等通過檢測(cè)附著板中的環(huán)境DNA，表明淡水珍珠牡蠣在河流中的大量存在對(duì)水生環(huán)境中的附著微動(dòng)物種群產(chǎn)生影響，并影響河流中氮的遷移轉(zhuǎn)化[31]。Narumi等人使用線粒體12s rRNA基因靶點(diǎn)的定量PCR技術(shù)對(duì)沉積物中的水蚤(Daphniagaleata)的DNA濃度進(jìn)行檢測(cè)，并量化上述物種在水中的生物量[32]。Tateishi等通過研究日本絨螯蟹蛻皮對(duì)環(huán)境DNA釋放的影響，揭示了日本絨螯蟹(Eriocheirjaponica)的分布和季節(jié)性變化，發(fā)現(xiàn)其幼體在海水中生長，成熟體棲息在淡水區(qū)的棲息規(guī)律。Aratani等通過開發(fā)龍虱科(Dytiscidae)和蝎蝽科(Nepidae)的環(huán)境DNA引物集，用于保護(hù)列入世界自然遺產(chǎn)的奄美大島等地的水生昆蟲，并評(píng)估當(dāng)?shù)氐纳锒鄻有苑N群特征[33]。Hirai對(duì)太平洋中的海洋浮游生物進(jìn)行了全面的宏條形碼分析，而這些浮游生物未成熟的個(gè)體很難通過形態(tài)學(xué)來識(shí)別，研究重點(diǎn)是占主導(dǎo)地位和種群高度多樣化的尾鰭動(dòng)物等浮游生物，運(yùn)用環(huán)境DNA宏條形碼技術(shù)評(píng)估尾鰭動(dòng)物的多樣性和群落結(jié)構(gòu)[34]。此外，環(huán)境DNA技術(shù)也被應(yīng)用于重要漁業(yè)物種的飲食分析和浮游生物監(jiān)測(cè)評(píng)估食物網(wǎng)結(jié)構(gòu)和生態(tài)系統(tǒng)。菅原建立一種專門檢測(cè)貽貝的環(huán)境DNA方法，并將其應(yīng)用于湖泊環(huán)境的監(jiān)測(cè)調(diào)查[35]。池田專注于mtDNA、16s rRNA和12s rRNA區(qū)域，并開發(fā)相關(guān)引物集用于檢測(cè)水生昆蟲，并提出黃嘴蜉蝣(Epeorusaesculus)存在未知亞種的可能。Sakata開發(fā)并應(yīng)用了兩棲動(dòng)物的通用引物[36]。Akatsuka等調(diào)查高懸浮物條件下的水樣采集方法，以確定海草床的變化，并在入?？陂_展海帶鰻鱺(Zosterajaponicaeelgrass)群落及其生物量的數(shù)值計(jì)算。同時(shí)結(jié)果表明，受目標(biāo)習(xí)性和繁殖期影響，水樣采集的適應(yīng)時(shí)間因地而異，對(duì)生物多樣性實(shí)地調(diào)查具有重要作用[37]。Yonezawa等通過水中的環(huán)境DNA揭示了棲息在水邊并以水中的魚和水生昆蟲為食的亞洲水鼩(Chimarrogaleplatycephalus)的棲息地分布[38]。 此外，Ishige等分析馬來西亞婆羅洲鹽池水樣的環(huán)境DNA，發(fā)現(xiàn)猩猩(Pongopygmaeus)、爪哇野牛(Bosjavanicuslowi)、亞洲象(Elephasmaximus)等多種動(dòng)物，均顯示了環(huán)境DNA同傳統(tǒng)形態(tài)學(xué)觀察監(jiān)測(cè)相比的優(yōu)越性[39]。Ushio等使用新開發(fā)的MiBird引物在從動(dòng)物園鳥籠的飲水區(qū)采集的樣本檢測(cè)出鳥類的環(huán)境DNA[13]。

3.2 外來入侵物種的監(jiān)測(cè)

外來物種入侵是指外來種由原生地經(jīng)自然或人為途徑進(jìn)入另一個(gè)生態(tài)環(huán)境，并在該生態(tài)環(huán)境系統(tǒng)中定居、自行繁殖建群和擴(kuò)散而逐漸占領(lǐng)新棲息地的一種生態(tài)現(xiàn)象[40-42]。環(huán)境DNA技術(shù)可以促進(jìn)對(duì)水生生物入侵物種的檢測(cè)和監(jiān)測(cè)，促進(jìn)入侵物種的監(jiān)測(cè)和預(yù)防工作開展。Takahara等利用環(huán)境DNA技術(shù)對(duì)入侵的藍(lán)鰓太陽魚(Lepomismacrochirus)環(huán)境DNA進(jìn)行了檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)藍(lán)鰓太陽魚入侵情況在人類活動(dòng)的影響較少的島嶼池塘中較輕，具有比傳統(tǒng)觀察方法更好的生物入侵檢測(cè)率[43]。Maruyama等發(fā)現(xiàn)入侵物種藍(lán)鰓太陽魚中較小的個(gè)體每單位體重釋放更多的DNA到水中，從而影響環(huán)境DNA濃度估算生物量和種群密度的結(jié)果[44]。此外，Uchii等研究結(jié)果表明，根據(jù)線粒體DNA的單核苷酸差異可以區(qū)分同一物種內(nèi)非本地基因轉(zhuǎn)移，并量化鯉魚中本地和非本地DNA的相對(duì)比例，進(jìn)而開發(fā)量化基于單核苷酸差異的本地和非本地DNA的相對(duì)比例的檢測(cè)方法[44]。Mizumoto等人通過環(huán)境DNA手段發(fā)現(xiàn)日本蟾蜍(Bufojaponicusformosusk)的繁殖區(qū)廣泛分布在北海道的12條河流的32個(gè)地點(diǎn)，由于其毒性而影響本地物種的生存，但其夜間的性質(zhì)和隱藏習(xí)慣導(dǎo)致其很難被發(fā)現(xiàn)和消除[45]。同時(shí)Jo等人對(duì)多個(gè)池塘樣本采用多重實(shí)時(shí)PCR方法，發(fā)現(xiàn)不同季節(jié)的3種非本地魚種(Lepomismacrochirus；藍(lán)鰓魚，Micropterussalmoides；大嘴鱸和Micropterusdolomieu：大口黑鱸)和3種瀕臨滅絕的本地魚類(Hemigrammocyprisrasborella：間紋鯉；Oryziaslatipes：日本青鳉；Misgurnusanguillicaudatus：泥鰍)在不同季節(jié)檢出率不同。對(duì)其分布情況進(jìn)行評(píng)估，總體結(jié)果顯示夏季的環(huán)境DNA檢測(cè)率較高，并發(fā)現(xiàn)非本地物種在人類活動(dòng)影響大、池塘表面積大、pH值高的池塘中更容易被檢出，而本地物種在非本地物種檢測(cè)率高的池塘中檢出率較低[47]。Fkumoto等使用環(huán)境DNA來確定大鯢(Andriasjaponicus)和中國大鯢(Andriasdavidianus)的分布，這是一個(gè)通過入侵并與本地物種雜交影響本地物種棲息地的入侵物種，根據(jù)其活動(dòng)周期等確定相應(yīng)的調(diào)查時(shí)期[48]。Yamakawa和Miya修改MiFish 引物的部分序列，用于檢測(cè)沼澤中的非本地木龜(Chelydraserpentina)，并正在開發(fā)MiTurtle引物集，其序列對(duì)淡水龜類具有高度特異性。在研究區(qū)域除了非本地木龜(C.serpentina)，還發(fā)現(xiàn)了日本石龜(Pelodiscussinensisver.japonica)、棱皮龜(Mauremysreevesii)、日本石龜(Mauremysjaponica)、非本地物種包括紅耳龜(Trachemysscripta)、箱龜(CuoragalbinifronsMoegi，居住在中國南部)、鱷龜(Macrochelystemminckii)、馬蹄龜(Sternotheruscarinatus)等[49]。針對(duì)入侵物種柳杉(Limnopernafortunei)在許多地方造成供水設(shè)施的阻塞問題，Ito等建立其環(huán)境DNA調(diào)查方法，并且正在Kasumigaura(霞浦)水系統(tǒng)中進(jìn)行入侵監(jiān)測(cè)。同時(shí)在5個(gè)水庫對(duì)入侵物種柳杉進(jìn)行常規(guī)調(diào)查方法(目測(cè)、采樣和幼蟲觀察)和環(huán)境DNA調(diào)查。在所有用常規(guī)方法檢測(cè)到柳杉的水庫以及用常規(guī)方法未檢測(cè)到的水庫中，都檢測(cè)到柳杉DNA?；诜N群密度和環(huán)境DNA濃度之間的關(guān)系，在實(shí)驗(yàn)水庫中也揭示了定量趨勢(shì)[50]。池田對(duì)日本特有物種日本小龍蝦(Cambaroidesjaponicus)和可能影響其生境的入侵物種內(nèi)田小龍蝦(Pacifastacusleniusculus)在北海道的分布進(jìn)行了調(diào)查[36]，環(huán)境DNA調(diào)查在檢測(cè)這兩個(gè)物種方面有優(yōu)勢(shì)，因?yàn)樗鼈冸[藏在礫石下，所以很難觀察和捕獲。這項(xiàng)研究的結(jié)果顯示，內(nèi)田小龍蝦可能入侵上游地區(qū)，影響本地物種。

3.3 瀕危物種和稀有物種的監(jiān)測(cè)

由于瀕危物種和稀有物種生物量較少，傳統(tǒng)的調(diào)查方法存在精確度偏低與破壞棲息生存環(huán)境等問題，僅靠傳統(tǒng)的捕捉和觀察調(diào)查很難進(jìn)行評(píng)估，而環(huán)境DNA分析技術(shù)能有效規(guī)避這些問題。Sakata等[51]在Omonogawa(大野川)河的99個(gè)水樣中的2個(gè)檢測(cè)到細(xì)鱗鱊(Acheilognathustypus)，并在檢出水區(qū)開展捕捉調(diào)查，確認(rèn)其中一個(gè)地點(diǎn)存在成熟的細(xì)鱗鱊雄性和雌性以及作為產(chǎn)卵宿主的雙殼類。這一發(fā)現(xiàn)是該河流11 a來的首次發(fā)現(xiàn)，有效證明環(huán)境DNA調(diào)查是確定大河中稀有物種分布和繁殖區(qū)域的有用工具。在這些地方Akamatsu等利用線粒體的DNA區(qū)開發(fā)一套引物探針，并在野外應(yīng)用，發(fā)現(xiàn)檢測(cè)到的DNA片段與潛水目測(cè)觀察到的個(gè)體數(shù)量呈正相關(guān)，表明環(huán)境DNA可用于以符合國家規(guī)定的方式進(jìn)行調(diào)查[52]。

3.4 生物量及生態(tài)影響評(píng)估

環(huán)境DNA技術(shù)有助于魚類生物量或豐度的非侵入性量化，但目前DNA采集方法和環(huán)境條件對(duì)水樣中環(huán)境DNA濃度的影響并沒有系統(tǒng)的標(biāo)準(zhǔn)和了解，這樣對(duì)運(yùn)用環(huán)境DNA技術(shù)量化評(píng)估魚類生物量造成限制。Doi等人在2016年利用潛水觀察和攝食痕跡等方法調(diào)查河流中的常駐香魚，對(duì)香魚(Plecoglossusaltivelis)進(jìn)行定量分布調(diào)查和環(huán)境DNA研究，兩者之間存在明顯的關(guān)系，證明環(huán)境DNA是一個(gè)來估計(jì)河水中香魚的豐度與生物量、分布的有效方法[10]。日本山口大學(xué)的研究小組利用環(huán)境DNA來評(píng)估大壩建設(shè)對(duì)流域生境的影響，并驗(yàn)證改進(jìn)項(xiàng)目的效果。研究表明，隨著支流流量的增加，香魚棲息地的密度在夏季也會(huì)增加，并建議在支流中建設(shè)適合香魚棲息的主要區(qū)域[53-54]。Hanaoka等使用環(huán)境DNA來驗(yàn)證為恢復(fù)江之川濱原大壩下游的河流環(huán)境而實(shí)施的沉積物供應(yīng)項(xiàng)目的效果，發(fā)現(xiàn)由于土壤徑流的改善作用，沙質(zhì)底部魚類生物量有所增加[55]。此外，利用環(huán)境DNA技術(shù)揭示繁殖季節(jié)環(huán)境DNA濃度的晝夜變化以及繁殖行為中環(huán)境DNA顆粒大小特征并通過核DNA與線粒體DNA的比率評(píng)估產(chǎn)卵行為，根據(jù)河水溫度和環(huán)境DNA濃度關(guān)系的實(shí)地研究數(shù)據(jù)，利用氣候變化導(dǎo)致的河水溫度上升模型，預(yù)測(cè)未來香魚棲息地的減少。根據(jù)香魚幼崽釋放的DNA數(shù)量及河水環(huán)境DNA濃度調(diào)查幼崽的實(shí)際數(shù)量，并評(píng)估河口堰塞湖流速降低對(duì)其的影響。洪水事件中，香魚生境密度和生境使用的變化研究中發(fā)現(xiàn)，香魚在洪水來臨之前與護(hù)岸比率呈負(fù)相關(guān)，與流速呈正相關(guān)；而在洪水來臨之后，只有護(hù)岸比率呈負(fù)相關(guān)，表明香魚生境受到洪水干擾導(dǎo)致的支流規(guī)模的影響[56]。Imashiro等同時(shí)檢查Shimanto(四萬十市)河中的香魚和Flavobacteriumpsychrophilum(一種引起香魚冷水病的革蘭氏陰性長桿菌)的環(huán)境DNA，發(fā)現(xiàn)冷水病不是發(fā)生在5月(即原來的高峰期)，而是在11月和12月發(fā)生在河口附近的產(chǎn)卵地[57]，同時(shí)研究顯示，產(chǎn)卵和攜帶真菌的香魚的存在是感染擴(kuò)散的驅(qū)動(dòng)力。Ushio等通過使用illumina MiSeq并添加內(nèi)部DNA標(biāo)準(zhǔn)，成功獲得了沿海地區(qū)70多種魚類的定量環(huán)境DNA時(shí)間序列數(shù)據(jù)?；谶@些數(shù)據(jù)，Kondo對(duì)魚類之間以及魚類與水母之間的生態(tài)關(guān)系進(jìn)行了時(shí)間序列分析，并與物理觀測(cè)數(shù)據(jù)相結(jié)合，建立了預(yù)測(cè)海灣中竹莢魚(Trachurusjaponicus)表層、中層和底部豐度的模型[58]。

3.5 環(huán)境DNA評(píng)估河道設(shè)施對(duì)魚類影響

當(dāng)前使用環(huán)境DNA技術(shù)評(píng)估河道設(shè)施對(duì)魚類影響的研究較少。Aranishi等對(duì)關(guān)東河干流Shidzumi水庫附近60 km長度的香魚洄游河段進(jìn)行了其縱向分布的環(huán)境DNA調(diào)查，發(fā)現(xiàn)在水庫上游13 km及水庫內(nèi)廣泛檢測(cè)到香魚DNA，而在下游未檢測(cè)到其DNA，驗(yàn)證了大壩對(duì)季節(jié)性洄游魚類的阻礙作用[59]。Yamanaka等通過對(duì)3個(gè)目標(biāo)洄游魚種(溫帶鱸魚、平頭鯔魚、鯔魚)的DNA片段的物種特異性檢測(cè)，證明了目標(biāo)物種的eDNA的存在與否與已知的物種季節(jié)性遷移模式一致，且在配置魚梯的大壩上游最靠近河口的地方檢測(cè)到溫帶鱸魚和平頭鯔魚的DNA，而在另外兩個(gè)未配置魚梯的大壩上游未檢測(cè)到上述兩者的DNA，表明魚梯能幫助這些物種通過繞過大壩的魚梯成功向上游遷移[60]。Morita等利用電捕魚與環(huán)境DNA結(jié)合的方法研究了日本北海道島西南部大島渚半島30條有水壩的溪流中白斑紅點(diǎn)鮭魚(Salvelinusleucomaenis)種群滅絕的脆弱性，比較了1999年至2014年間溪流中白點(diǎn)鮭種群的滅絕概率，發(fā)現(xiàn)其局部滅絕的概率與流域面積成反比，而安裝魚梯重新連接隔斷的生境后，能有效緩解白斑紅點(diǎn)鮭魚的局部滅絕危機(jī)[61]。

4 總結(jié)與展望

利用環(huán)境DNA了解生物多樣性需要對(duì)多物種進(jìn)行宏條形碼的全面檢測(cè)并結(jié)合特定物種的檢測(cè)來確定物種的存在與否和它們的生物量。日本環(huán)境DNA協(xié)會(huì)已經(jīng)出版了一本全面總結(jié)環(huán)境DNA作為一種調(diào)查和分析技術(shù)的手冊(cè)《環(huán)境DNA調(diào)查和實(shí)驗(yàn)手冊(cè)》，同時(shí)日本環(huán)境省自然保護(hù)局生物多樣性中心也出版了《使用環(huán)境DNA分析技術(shù)的淡水魚類調(diào)查方法手冊(cè)》等技術(shù)資料。

環(huán)境DNA技術(shù)最嚴(yán)重的缺陷是存在污染的風(fēng)險(xiǎn)，即可能出現(xiàn)假陽性的結(jié)果。環(huán)境DNA在樣品的采集、運(yùn)輸、保存等過程中都容易發(fā)生交叉污染，在實(shí)驗(yàn)室分析過程中亦會(huì)受到試劑的污染。污染問題是造成環(huán)境DNA實(shí)驗(yàn)結(jié)果誤差的一個(gè)重要影響因素?？赡軐?dǎo)致分析錯(cuò)誤的因素包括假陰性的問題，環(huán)境DNA技術(shù)需要依靠數(shù)據(jù)庫，但是現(xiàn)如今的數(shù)據(jù)庫生物信息并不完善，特別是針對(duì)感興趣的生物體的生態(tài)環(huán)境(如低活性或者有限的時(shí)間內(nèi)活動(dòng)),缺乏參考物種名稱的序列信息,以及良好的檢測(cè)系統(tǒng)的發(fā)展不足影響環(huán)境 DNA 的最終檢測(cè)結(jié)果。此外，環(huán)境DNA分析方法需要進(jìn)一步規(guī)范完善，很多研究人員在環(huán)境DNA樣品采集、保存、提取等過程采取的方法各不相同，并沒有形成系統(tǒng)的分析方法，今后的研究中可以對(duì)環(huán)境DNA技術(shù)操作流程進(jìn)行進(jìn)一步的優(yōu)化和完善。環(huán)境中的DNA會(huì)被微生物和紫外線輻射所降解，所以目前很難用具體的數(shù)值來預(yù)測(cè)和評(píng)估其降解率、平流和擴(kuò)散。環(huán)境DNA技術(shù)的檢測(cè)結(jié)果在時(shí)間和空間這兩個(gè)維度的精度較低，檢測(cè)精度有待提升。環(huán)境DNA技術(shù)可以通過特定物種DNA的有無直觀的表征河道建筑對(duì)魚類活動(dòng)的影響，可以通過檢測(cè)洄游性魚類的DNA來評(píng)估河道設(shè)施對(duì)河流生態(tài)健康的影響，但由于當(dāng)前環(huán)境DNA技術(shù)仍處于發(fā)展階段，在定量評(píng)價(jià)上需要未來的進(jìn)一步研究。

每一種調(diào)研方法都有其優(yōu)點(diǎn)和缺點(diǎn)，因此了解和使用環(huán)境DNA作為生物多樣性研究的工具的優(yōu)缺點(diǎn)是非常重要的。環(huán)境DNA可以大大增加在時(shí)間和空間上獲得生物多樣性數(shù)據(jù)的可能性，它可以用來了解生物體與環(huán)境中各種因素之間的相互作用。通過進(jìn)一步優(yōu)化環(huán)境DNA樣品采集、保存方法、DNA提取等分析方法，預(yù)計(jì)環(huán)境 DNA技術(shù)未來將進(jìn)一步發(fā)展跨學(xué)科的綜合研究，以解讀生物體與其環(huán)境中各種因素之間的相互作用，例如其將食物鏈的能量流動(dòng)、動(dòng)物攝食等研究領(lǐng)域的作用展示出來。