賀 凱，劉澤軍，胡茂川，劉丙軍，郝愛民，井芹寧

(1. 中山大學(xué) 土木工程學(xué)院，廣東 珠海 519082；2. 廣東省環(huán)境資源利用與保護(hù)重點(diǎn)實驗室，廣州 510640；3. 溫州大學(xué) 生命與環(huán)境科學(xué)學(xué)院，浙江 溫州 325035；4. 亞熱帶水環(huán)境生態(tài)保護(hù)浙江省國際科技合作基地，浙江 溫州 325035)

0 前 言

傳統(tǒng)水生生物監(jiān)測主要依靠觀測者對物種進(jìn)行形態(tài)學(xué)鑒定，因而對從事物種鑒定人員的專業(yè)知識要求較高，同時傳統(tǒng)的水生生物監(jiān)測方法可能會給水生生物或者其所在的水生生態(tài)系統(tǒng)帶來一定程度的危害導(dǎo)致其具有一定的局限性[1]。而環(huán)境DNA技術(shù)作為新興的水生生物監(jiān)測方法，基于當(dāng)前基因測序技術(shù)，可以通過檢測游離在水環(huán)境中的DNA分子檢測出對應(yīng)生物種類的存在。其相較于傳統(tǒng)水生生物形態(tài)學(xué)監(jiān)測方法而言具有經(jīng)濟(jì)、高效、準(zhǔn)確、靈敏等優(yōu)勢[2]。因此，近年來環(huán)境DNA檢測技術(shù)發(fā)展迅速，被廣泛應(yīng)用于流域入侵物種、瀕危物種監(jiān)測、生物量評估和生物多樣性調(diào)查等[3-5]。

環(huán)境DNA指在自然環(huán)境中廣泛分布的游離DNA分子，主要通過生物脫落的皮膚、唾液、糞便、配子、分泌物等方式獲得[6]。環(huán)境DNA分子大小不一，存在部分大于180 μm或小于0.2 μm的分子，DNA分子的大小可能與生物種類相關(guān)。運(yùn)用環(huán)境DNA的水生生物調(diào)查研究始于1987年，由美國田納西大學(xué)研究團(tuán)隊開發(fā)從環(huán)境(湖泊沉積物)中提取和純化細(xì)胞外DNA的方法[7]，隨后法國Ficetola等[8]通過針對棲息地池塘中提取牛蛙(Ranacatesbeiana)DNA信息，以此研究牛蛙棲息習(xí)慣。Minamoto等首次運(yùn)用環(huán)境DNA宏條形碼技術(shù)于魚類、兩棲動物、鳥類和哺乳動物等水環(huán)境生物監(jiān)測研究[9]。Doi等也通過對鯉魚環(huán)境DNA分析檢測來證明環(huán)境DNA宏條形碼技術(shù)在魚類乃至水生生物的定量評估中的潛力[10-11]。 Miya開發(fā)具有代表性的通用引物“MiFish”用于環(huán)境DNA宏條形碼技術(shù)，目前該引物可檢測到200多個魚種[12-14]。日本通過出版環(huán)境DNA研究和分析手冊等[15-16]指導(dǎo)環(huán)境DNA技術(shù)應(yīng)用研究，并建立基于大規(guī)模、高分辨率數(shù)據(jù)的生態(tài)系統(tǒng)解釋、預(yù)測和保護(hù)系統(tǒng)。

日本開展環(huán)境DNA研究較早，有著廣泛的應(yīng)用案例。近年環(huán)境DNA研究也被引導(dǎo)強(qiáng)化同其他研究領(lǐng)域的融合與合作，如生態(tài)系統(tǒng)的可持續(xù)利用和環(huán)境保護(hù)。本文在系統(tǒng)介紹環(huán)境DNA技術(shù)及其影響因素的基礎(chǔ)上，梳理日本運(yùn)用環(huán)境DNA技術(shù)在河流生態(tài)監(jiān)測與多樣性評價方面的研究成果，旨在為中國未來生態(tài)監(jiān)測和生物多樣性研究方面提供素材和借鑒。

1 日本環(huán)境DNA技術(shù)的發(fā)展歷程

日本在環(huán)境DNA技術(shù)的研究起步較早，Minamoto等[9]在對水族箱水樣進(jìn)行DNA提取和分析后，確認(rèn)所有水族箱魚種都被檢出。根據(jù)水族箱分析結(jié)果對3個自然河道現(xiàn)場采集的水樣開展環(huán)境DNA分析，并檢出自然河道中4個魚種，檢測結(jié)果同以往常規(guī)方法(觀察和捕捉方法)確定的魚種一致。環(huán)境DNA方法可以提供簡化的魚類等水生生物調(diào)查和監(jiān)測，日本科學(xué)家在之后的研究中成功利用環(huán)境DNA技術(shù)檢出日本淡水湖中魚類的物種組成，證明該方法在日本水環(huán)境中魚類調(diào)查研究中的適用性。Takahara等[10]利用環(huán)境DNA技術(shù)在室內(nèi)水箱和室外實驗池中發(fā)現(xiàn)鯉魚(CyprinuscarpioL.)豐度與水中環(huán)境DNA濃度之間存在正相關(guān)關(guān)系，并利用環(huán)境DNA對天然潟湖中的鯉魚生物量進(jìn)行評估。從2008年至今，環(huán)境DNA技術(shù)在水生生態(tài)系統(tǒng)的研究經(jīng)歷了定性到定量，由檢測單一物種到同時檢測多種物種，從調(diào)查淡水水域擴(kuò)展到海洋，調(diào)查物種從小型底棲動物擴(kuò)展到兩棲動物、哺乳動物等的發(fā)展歷程[17-20]。

為研究日本環(huán)境DNA技術(shù)發(fā)展歷程運(yùn)用CiteSpace[21]軟件對日本相關(guān)文獻(xiàn)進(jìn)行關(guān)鍵詞聚類分析，數(shù)據(jù)庫為Web of Science (WOS)核心數(shù)據(jù)庫(2022年6月28日)，搜索策略為TS=((“environmental DNA”O(jiān)R “eDNA”) AND (Japan OR Japanese))，共搜索文獻(xiàn)141篇。歷年文獻(xiàn)發(fā)表數(shù)量及年被引次數(shù)見圖1，從圖中可以看出環(huán)境DNA發(fā)文數(shù)量及年被引用次數(shù)均呈逐年上漲的趨勢，而發(fā)展突變點(diǎn)出現(xiàn)于2013—2016年，表明在該時間段環(huán)境DNA開始步入大眾科研關(guān)注領(lǐng)域。

2 環(huán)境DNA技術(shù)流程介紹及其影響因素

環(huán)境DNA技術(shù)分析主要包括樣品采集、樣品處理、DNA提取、PCR擴(kuò)增、基因測序、生物信息學(xué)以及統(tǒng)計學(xué)分析。具體技術(shù)處理流程如圖2所示。

圖1 日本環(huán)境DNA發(fā)文數(shù)量及年被引次數(shù)

圖2 環(huán)境DNA技術(shù)處理流程

Jo等以環(huán)境DNA的生物放大作用，以馬鮫魚(Trachurusjaponicus)為標(biāo)本，對不同水溫和魚類生物量條件下的DNA脫落和降解過程進(jìn)行實驗，發(fā)現(xiàn)降解過程隨環(huán)境DNA大小發(fā)生變化，同時環(huán)境DNA濃度及其降解率也隨著水溫的升高和生物量增加而增加[22]。溝口等利用環(huán)境DNA技術(shù)對海上風(fēng)電設(shè)施附近開展魚類監(jiān)測，用來識別其周圍水域的魚種，對漁業(yè)影響評估方法的改善有很大的促進(jìn)作用[23]。Kabamoto等按照灌溉季節(jié)和非灌溉季節(jié)在全國10個農(nóng)業(yè)改良項目區(qū)的122個地點(diǎn)開展采樣，通過環(huán)境DNA技術(shù)在農(nóng)業(yè)水道中檢出15～40種魚類，通過比較采樣調(diào)查和以往調(diào)查數(shù)據(jù)結(jié)果，評估環(huán)境DNA技術(shù)在快速流動水環(huán)境(如農(nóng)業(yè)水道等)中水生態(tài)調(diào)查的適用性并討論檢測假陽性等技術(shù)問題[24]。需要注意的是，其研究強(qiáng)調(diào)人類活動影響下環(huán)境DNA污染問題，如檢測魚DNA檢測分析中存在實驗室污染等。

聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)是一種體外核酸擴(kuò)增技術(shù)，用于放大與擴(kuò)增特定的DNA片段。因此，確定要擴(kuò)增的DNA片段對后續(xù)的eDNA測序分析具有至關(guān)重要的作用。在理想情況為了成功地進(jìn)行eDNA測序分析，PCR引物對和擴(kuò)增出的中間eDNA片段應(yīng)滿足以下要求：① 穩(wěn)定性，設(shè)計的通用PCR引物需要無偏差擴(kuò)增各目標(biāo)類群的基因片段，且不出現(xiàn)基因片段缺失；② 一致性，擴(kuò)增的片段應(yīng)包含足夠的變異以允許明確的分類分配；③ 特異性，引物應(yīng)是目標(biāo)類群的特定引物(如MiFish)。否則，來自非目標(biāo)分類群的DNA(原核生物和非目標(biāo)真核生物的DNA)將在擴(kuò)增產(chǎn)物中占主導(dǎo)地位。根據(jù)文獻(xiàn)調(diào)研對通用PCR引物進(jìn)行統(tǒng)計發(fā)現(xiàn)(見圖3)，MiFish引物占比最多(51.2%)，其次是Cyt b引物(34.9%)，日本常見魚類環(huán)境DNA引物(部分)基因序列表如表1所示。這些通用引物，不僅在日本，在我國生物多樣性研究中也開展了相關(guān)應(yīng)用研究[25-26]。從日本環(huán)境DNA研究地理分布圖上看，MiFish引物在日本全國的應(yīng)用案例較多，最近的日本政府調(diào)查項目也主要采用MiFish引物開展eDNA分析進(jìn)行生物多樣性監(jiān)測[27]。例如：日本國土交通省開展全國河流環(huán)境普查試點(diǎn)研究[28]；日本環(huán)境省生物多樣性中心推動環(huán)境DNA標(biāo)準(zhǔn)化項目(https://www.biodic.go.jp/edna/edna_top.html)。而Cyt b引物則是在以瀨戶內(nèi)海為主的西日本地區(qū)應(yīng)用較為廣泛(見圖4)。

圖3 日本環(huán)境DNA發(fā)表論文引物頻率組成

圖4 日本環(huán)境DNA研究地理分布

表1 日本常見魚類環(huán)境DNA引物(部分)基因序列表

3 環(huán)境DNA技術(shù)在日本河流生物多樣性研究中的應(yīng)用

隨著環(huán)境DNA技術(shù)的不斷發(fā)展和基因庫的不斷完善，越來越多研究人員運(yùn)用環(huán)境DNA技術(shù)開展水生生物的物種鑒定。同時由于外來入侵物種、瀕危物種和稀有物種的監(jiān)測調(diào)查一直是傳統(tǒng)生物監(jiān)測研究的難題，環(huán)境DNA技術(shù)為上述問題的解決提供了一種新的思路。本部分針對生物多樣性調(diào)查、外來入侵物種的監(jiān)測、瀕危物種和稀有物種的監(jiān)測以及生物量評估方面的環(huán)境DNA研究及其技術(shù)應(yīng)用進(jìn)行介紹梳理。

通過Web of Science搜索文獻(xiàn)導(dǎo)入CiteSpace軟件，去重后剩余140篇有效文獻(xiàn)，文獻(xiàn)研究時間段為2005—2022年，本次研究以3 a為時間間隔，選取每年引用頻率前25的關(guān)鍵詞進(jìn)行聚類分析，共得到15類聚類(單一聚類關(guān)鍵詞小于5類時不顯示)，有效聚類9類(0號 影響因素、1號 浮游植物、2號 日本鰻魚、3 號日本竹莢魚、5號 日本鰻鱺、7號棲息地相關(guān)、8號 海洋、9號 大腸桿菌 14號、鑒別)，由于當(dāng)前研究處于發(fā)展階段，文獻(xiàn)較少，無法進(jìn)行關(guān)鍵詞突現(xiàn)性研究，本次研究以不同年間關(guān)鍵詞共現(xiàn)作為趨勢研究，相關(guān)聚類見圖5(a)(2008—2010年)、圖5(b)(2020—2022年)，其中圓形大小表示關(guān)鍵詞出現(xiàn)次數(shù)，同一圓形不同顏色環(huán)形為不同年份出現(xiàn)次數(shù)，連線表示關(guān)鍵詞存在共同出現(xiàn)，粗連線表示a、b特定年間關(guān)鍵詞存在共同出現(xiàn)。從圖中可以看出，除環(huán)境DNA，qPCR等綱領(lǐng)性關(guān)鍵詞外，以生物質(zhì)、豐度、河流、魚類、數(shù)量、瀕危物種、洄游、溫度、降解、琵琶湖等詞出現(xiàn)頻率較高，表明當(dāng)前環(huán)境DNA研究更多關(guān)注于物種(多指魚類)豐度、瀕危物種以及季節(jié)性物種的監(jiān)測領(lǐng)域，對于實驗條件的關(guān)注則集中在溫度以及引物、環(huán)境DNA的降解速度等領(lǐng)域。圖5(a)(2008—2010年)顯示日本早期環(huán)境DNA技術(shù)主要以基因宏條形碼技術(shù)、qPCR擴(kuò)增為主，并開始應(yīng)用于琵琶湖流域生物監(jiān)測。從圖5(b)(2020—2022年)可以看出當(dāng)前日本環(huán)境DNA技術(shù)應(yīng)用開始全面擴(kuò)寬。在研究區(qū)域上，由傳統(tǒng)河湖研究邁向海洋；在技術(shù)研究上開始深入引物設(shè)計，引物種類得到擴(kuò)充，對實驗最優(yōu)條件也進(jìn)行了一定的探索；在技術(shù)應(yīng)用上從種群監(jiān)測步向多元研究，在物種多樣性保護(hù)、瀕危物種、入侵物種監(jiān)測、季節(jié)性洄游魚類監(jiān)測等領(lǐng)域均進(jìn)行了較多研究。關(guān)鍵詞聚類表明當(dāng)前日本對環(huán)境DNA技術(shù)的研究已進(jìn)入較深入階段。

圖5 日本環(huán)境DNA關(guān)鍵詞聚類分析

3.1 生物多樣性調(diào)查

生物多樣性的有效保護(hù)對于人類的生存和生態(tài)系統(tǒng)的維持至關(guān)重要。生物多樣性評估基本上依賴于物種監(jiān)測，但傳統(tǒng)的物種形態(tài)學(xué)監(jiān)測難以滿足生物多樣性研究要求。因此，通過從環(huán)境樣本中提取DNA來獲取物種、種群和群落信息的方法能夠彌補(bǔ)傳統(tǒng)物種鑒定的不足。在魚類多樣性調(diào)查中，環(huán)境DNA宏條形碼方法作為一種全面檢測魚類等水生生物鑒定技術(shù)被提出。Miya等[12]開發(fā)的通用PCR 引物組(MiFsh-U/E)目前已在全球范圍內(nèi)廣泛使用。該引物是根據(jù)880個物種的線粒體完整基因組序列和160個板鰓亞類(鯊魚和鰩魚)物種的部分線粒體序列，針對12S rRNA基因的長可變區(qū)(163～185 bp)設(shè)計，檢出實驗室180種海洋魚類中的168種(93.3%)，并在附近的珊瑚礁調(diào)查中也檢測到93種。

在其他水生生物多樣性調(diào)查中，Kayano等通過檢測附著板中的環(huán)境DNA，表明淡水珍珠牡蠣在河流中的大量存在對水生環(huán)境中的附著微動物種群產(chǎn)生影響，并影響河流中氮的遷移轉(zhuǎn)化[31]。Narumi等人使用線粒體12s rRNA基因靶點(diǎn)的定量PCR技術(shù)對沉積物中的水蚤(Daphniagaleata)的DNA濃度進(jìn)行檢測，并量化上述物種在水中的生物量[32]。Tateishi等通過研究日本絨螯蟹蛻皮對環(huán)境DNA釋放的影響，揭示了日本絨螯蟹(Eriocheirjaponica)的分布和季節(jié)性變化，發(fā)現(xiàn)其幼體在海水中生長，成熟體棲息在淡水區(qū)的棲息規(guī)律。Aratani等通過開發(fā)龍虱科(Dytiscidae)和蝎蝽科(Nepidae)的環(huán)境DNA引物集，用于保護(hù)列入世界自然遺產(chǎn)的奄美大島等地的水生昆蟲，并評估當(dāng)?shù)氐纳锒鄻有苑N群特征[33]。Hirai對太平洋中的海洋浮游生物進(jìn)行了全面的宏條形碼分析，而這些浮游生物未成熟的個體很難通過形態(tài)學(xué)來識別，研究重點(diǎn)是占主導(dǎo)地位和種群高度多樣化的尾鰭動物等浮游生物，運(yùn)用環(huán)境DNA宏條形碼技術(shù)評估尾鰭動物的多樣性和群落結(jié)構(gòu)[34]。此外，環(huán)境DNA技術(shù)也被應(yīng)用于重要漁業(yè)物種的飲食分析和浮游生物監(jiān)測評估食物網(wǎng)結(jié)構(gòu)和生態(tài)系統(tǒng)。菅原建立一種專門檢測貽貝的環(huán)境DNA方法，并將其應(yīng)用于湖泊環(huán)境的監(jiān)測調(diào)查[35]。池田專注于mtDNA、16s rRNA和12s rRNA區(qū)域，并開發(fā)相關(guān)引物集用于檢測水生昆蟲，并提出黃嘴蜉蝣(Epeorusaesculus)存在未知亞種的可能。Sakata開發(fā)并應(yīng)用了兩棲動物的通用引物[36]。Akatsuka等調(diào)查高懸浮物條件下的水樣采集方法，以確定海草床的變化，并在入海口開展海帶鰻鱺(Zosterajaponicaeelgrass)群落及其生物量的數(shù)值計算。同時結(jié)果表明，受目標(biāo)習(xí)性和繁殖期影響，水樣采集的適應(yīng)時間因地而異，對生物多樣性實地調(diào)查具有重要作用[37]。Yonezawa等通過水中的環(huán)境DNA揭示了棲息在水邊并以水中的魚和水生昆蟲為食的亞洲水鼩(Chimarrogaleplatycephalus)的棲息地分布[38]。 此外，Ishige等分析馬來西亞婆羅洲鹽池水樣的環(huán)境DNA，發(fā)現(xiàn)猩猩(Pongopygmaeus)、爪哇野牛(Bosjavanicuslowi)、亞洲象(Elephasmaximus)等多種動物，均顯示了環(huán)境DNA同傳統(tǒng)形態(tài)學(xué)觀察監(jiān)測相比的優(yōu)越性[39]。Ushio等使用新開發(fā)的MiBird引物在從動物園鳥籠的飲水區(qū)采集的樣本檢測出鳥類的環(huán)境DNA[13]。

3.2 外來入侵物種的監(jiān)測

外來物種入侵是指外來種由原生地經(jīng)自然或人為途徑進(jìn)入另一個生態(tài)環(huán)境，并在該生態(tài)環(huán)境系統(tǒng)中定居、自行繁殖建群和擴(kuò)散而逐漸占領(lǐng)新棲息地的一種生態(tài)現(xiàn)象[40-42]。環(huán)境DNA技術(shù)可以促進(jìn)對水生生物入侵物種的檢測和監(jiān)測，促進(jìn)入侵物種的監(jiān)測和預(yù)防工作開展。Takahara等利用環(huán)境DNA技術(shù)對入侵的藍(lán)鰓太陽魚(Lepomismacrochirus)環(huán)境DNA進(jìn)行了檢測，發(fā)現(xiàn)藍(lán)鰓太陽魚入侵情況在人類活動的影響較少的島嶼池塘中較輕，具有比傳統(tǒng)觀察方法更好的生物入侵檢測率[43]。Maruyama等發(fā)現(xiàn)入侵物種藍(lán)鰓太陽魚中較小的個體每單位體重釋放更多的DNA到水中，從而影響環(huán)境DNA濃度估算生物量和種群密度的結(jié)果[44]。此外，Uchii等研究結(jié)果表明，根據(jù)線粒體DNA的單核苷酸差異可以區(qū)分同一物種內(nèi)非本地基因轉(zhuǎn)移，并量化鯉魚中本地和非本地DNA的相對比例，進(jìn)而開發(fā)量化基于單核苷酸差異的本地和非本地DNA的相對比例的檢測方法[44]。Mizumoto等人通過環(huán)境DNA手段發(fā)現(xiàn)日本蟾蜍(Bufojaponicusformosusk)的繁殖區(qū)廣泛分布在北海道的12條河流的32個地點(diǎn)，由于其毒性而影響本地物種的生存，但其夜間的性質(zhì)和隱藏習(xí)慣導(dǎo)致其很難被發(fā)現(xiàn)和消除[45]。同時Jo等人對多個池塘樣本采用多重實時PCR方法，發(fā)現(xiàn)不同季節(jié)的3種非本地魚種(Lepomismacrochirus；藍(lán)鰓魚，Micropterussalmoides；大嘴鱸和Micropterusdolomieu：大口黑鱸)和3種瀕臨滅絕的本地魚類(Hemigrammocyprisrasborella：間紋鯉；Oryziaslatipes：日本青鳉；Misgurnusanguillicaudatus：泥鰍)在不同季節(jié)檢出率不同。對其分布情況進(jìn)行評估，總體結(jié)果顯示夏季的環(huán)境DNA檢測率較高，并發(fā)現(xiàn)非本地物種在人類活動影響大、池塘表面積大、pH值高的池塘中更容易被檢出，而本地物種在非本地物種檢測率高的池塘中檢出率較低[47]。Fkumoto等使用環(huán)境DNA來確定大鯢(Andriasjaponicus)和中國大鯢(Andriasdavidianus)的分布，這是一個通過入侵并與本地物種雜交影響本地物種棲息地的入侵物種，根據(jù)其活動周期等確定相應(yīng)的調(diào)查時期[48]。Yamakawa和Miya修改MiFish 引物的部分序列，用于檢測沼澤中的非本地木龜(Chelydraserpentina)，并正在開發(fā)MiTurtle引物集，其序列對淡水龜類具有高度特異性。在研究區(qū)域除了非本地木龜(C.serpentina)，還發(fā)現(xiàn)了日本石龜(Pelodiscussinensisver.japonica)、棱皮龜(Mauremysreevesii)、日本石龜(Mauremysjaponica)、非本地物種包括紅耳龜(Trachemysscripta)、箱龜(CuoragalbinifronsMoegi，居住在中國南部)、鱷龜(Macrochelystemminckii)、馬蹄龜(Sternotheruscarinatus)等[49]。針對入侵物種柳杉(Limnopernafortunei)在許多地方造成供水設(shè)施的阻塞問題，Ito等建立其環(huán)境DNA調(diào)查方法，并且正在Kasumigaura(霞浦)水系統(tǒng)中進(jìn)行入侵監(jiān)測。同時在5個水庫對入侵物種柳杉進(jìn)行常規(guī)調(diào)查方法(目測、采樣和幼蟲觀察)和環(huán)境DNA調(diào)查。在所有用常規(guī)方法檢測到柳杉的水庫以及用常規(guī)方法未檢測到的水庫中，都檢測到柳杉DNA。基于種群密度和環(huán)境DNA濃度之間的關(guān)系，在實驗水庫中也揭示了定量趨勢[50]。池田對日本特有物種日本小龍蝦(Cambaroidesjaponicus)和可能影響其生境的入侵物種內(nèi)田小龍蝦(Pacifastacusleniusculus)在北海道的分布進(jìn)行了調(diào)查[36]，環(huán)境DNA調(diào)查在檢測這兩個物種方面有優(yōu)勢，因為它們隱藏在礫石下，所以很難觀察和捕獲。這項研究的結(jié)果顯示，內(nèi)田小龍蝦可能入侵上游地區(qū)，影響本地物種。

3.3 瀕危物種和稀有物種的監(jiān)測

由于瀕危物種和稀有物種生物量較少，傳統(tǒng)的調(diào)查方法存在精確度偏低與破壞棲息生存環(huán)境等問題，僅靠傳統(tǒng)的捕捉和觀察調(diào)查很難進(jìn)行評估，而環(huán)境DNA分析技術(shù)能有效規(guī)避這些問題。Sakata等[51]在Omonogawa(大野川)河的99個水樣中的2個檢測到細(xì)鱗鱊(Acheilognathustypus)，并在檢出水區(qū)開展捕捉調(diào)查，確認(rèn)其中一個地點(diǎn)存在成熟的細(xì)鱗鱊雄性和雌性以及作為產(chǎn)卵宿主的雙殼類。這一發(fā)現(xiàn)是該河流11 a來的首次發(fā)現(xiàn)，有效證明環(huán)境DNA調(diào)查是確定大河中稀有物種分布和繁殖區(qū)域的有用工具。在這些地方Akamatsu等利用線粒體的DNA區(qū)開發(fā)一套引物探針，并在野外應(yīng)用，發(fā)現(xiàn)檢測到的DNA片段與潛水目測觀察到的個體數(shù)量呈正相關(guān)，表明環(huán)境DNA可用于以符合國家規(guī)定的方式進(jìn)行調(diào)查[52]。

3.4 生物量及生態(tài)影響評估

環(huán)境DNA技術(shù)有助于魚類生物量或豐度的非侵入性量化，但目前DNA采集方法和環(huán)境條件對水樣中環(huán)境DNA濃度的影響并沒有系統(tǒng)的標(biāo)準(zhǔn)和了解，這樣對運(yùn)用環(huán)境DNA技術(shù)量化評估魚類生物量造成限制。Doi等人在2016年利用潛水觀察和攝食痕跡等方法調(diào)查河流中的常駐香魚，對香魚(Plecoglossusaltivelis)進(jìn)行定量分布調(diào)查和環(huán)境DNA研究，兩者之間存在明顯的關(guān)系，證明環(huán)境DNA是一個來估計河水中香魚的豐度與生物量、分布的有效方法[10]。日本山口大學(xué)的研究小組利用環(huán)境DNA來評估大壩建設(shè)對流域生境的影響，并驗證改進(jìn)項目的效果。研究表明，隨著支流流量的增加，香魚棲息地的密度在夏季也會增加，并建議在支流中建設(shè)適合香魚棲息的主要區(qū)域[53-54]。Hanaoka等使用環(huán)境DNA來驗證為恢復(fù)江之川濱原大壩下游的河流環(huán)境而實施的沉積物供應(yīng)項目的效果，發(fā)現(xiàn)由于土壤徑流的改善作用，沙質(zhì)底部魚類生物量有所增加[55]。此外，利用環(huán)境DNA技術(shù)揭示繁殖季節(jié)環(huán)境DNA濃度的晝夜變化以及繁殖行為中環(huán)境DNA顆粒大小特征并通過核DNA與線粒體DNA的比率評估產(chǎn)卵行為，根據(jù)河水溫度和環(huán)境DNA濃度關(guān)系的實地研究數(shù)據(jù)，利用氣候變化導(dǎo)致的河水溫度上升模型，預(yù)測未來香魚棲息地的減少。根據(jù)香魚幼崽釋放的DNA數(shù)量及河水環(huán)境DNA濃度調(diào)查幼崽的實際數(shù)量，并評估河口堰塞湖流速降低對其的影響。洪水事件中，香魚生境密度和生境使用的變化研究中發(fā)現(xiàn)，香魚在洪水來臨之前與護(hù)岸比率呈負(fù)相關(guān)，與流速呈正相關(guān)；而在洪水來臨之后，只有護(hù)岸比率呈負(fù)相關(guān)，表明香魚生境受到洪水干擾導(dǎo)致的支流規(guī)模的影響[56]。Imashiro等同時檢查Shimanto(四萬十市)河中的香魚和Flavobacteriumpsychrophilum(一種引起香魚冷水病的革蘭氏陰性長桿菌)的環(huán)境DNA，發(fā)現(xiàn)冷水病不是發(fā)生在5月(即原來的高峰期)，而是在11月和12月發(fā)生在河口附近的產(chǎn)卵地[57]，同時研究顯示，產(chǎn)卵和攜帶真菌的香魚的存在是感染擴(kuò)散的驅(qū)動力。Ushio等通過使用illumina MiSeq并添加內(nèi)部DNA標(biāo)準(zhǔn)，成功獲得了沿海地區(qū)70多種魚類的定量環(huán)境DNA時間序列數(shù)據(jù)?；谶@些數(shù)據(jù)，Kondo對魚類之間以及魚類與水母之間的生態(tài)關(guān)系進(jìn)行了時間序列分析，并與物理觀測數(shù)據(jù)相結(jié)合，建立了預(yù)測海灣中竹莢魚(Trachurusjaponicus)表層、中層和底部豐度的模型[58]。

3.5 環(huán)境DNA評估河道設(shè)施對魚類影響

當(dāng)前使用環(huán)境DNA技術(shù)評估河道設(shè)施對魚類影響的研究較少。Aranishi等對關(guān)東河干流Shidzumi水庫附近60 km長度的香魚洄游河段進(jìn)行了其縱向分布的環(huán)境DNA調(diào)查，發(fā)現(xiàn)在水庫上游13 km及水庫內(nèi)廣泛檢測到香魚DNA，而在下游未檢測到其DNA，驗證了大壩對季節(jié)性洄游魚類的阻礙作用[59]。Yamanaka等通過對3個目標(biāo)洄游魚種(溫帶鱸魚、平頭鯔魚、鯔魚)的DNA片段的物種特異性檢測，證明了目標(biāo)物種的eDNA的存在與否與已知的物種季節(jié)性遷移模式一致，且在配置魚梯的大壩上游最靠近河口的地方檢測到溫帶鱸魚和平頭鯔魚的DNA，而在另外兩個未配置魚梯的大壩上游未檢測到上述兩者的DNA，表明魚梯能幫助這些物種通過繞過大壩的魚梯成功向上游遷移[60]。Morita等利用電捕魚與環(huán)境DNA結(jié)合的方法研究了日本北海道島西南部大島渚半島30條有水壩的溪流中白斑紅點(diǎn)鮭魚(Salvelinusleucomaenis)種群滅絕的脆弱性，比較了1999年至2014年間溪流中白點(diǎn)鮭種群的滅絕概率，發(fā)現(xiàn)其局部滅絕的概率與流域面積成反比，而安裝魚梯重新連接隔斷的生境后，能有效緩解白斑紅點(diǎn)鮭魚的局部滅絕危機(jī)[61]。

4 總結(jié)與展望

利用環(huán)境DNA了解生物多樣性需要對多物種進(jìn)行宏條形碼的全面檢測并結(jié)合特定物種的檢測來確定物種的存在與否和它們的生物量。日本環(huán)境DNA協(xié)會已經(jīng)出版了一本全面總結(jié)環(huán)境DNA作為一種調(diào)查和分析技術(shù)的手冊《環(huán)境DNA調(diào)查和實驗手冊》，同時日本環(huán)境省自然保護(hù)局生物多樣性中心也出版了《使用環(huán)境DNA分析技術(shù)的淡水魚類調(diào)查方法手冊》等技術(shù)資料。

環(huán)境DNA技術(shù)最嚴(yán)重的缺陷是存在污染的風(fēng)險，即可能出現(xiàn)假陽性的結(jié)果。環(huán)境DNA在樣品的采集、運(yùn)輸、保存等過程中都容易發(fā)生交叉污染，在實驗室分析過程中亦會受到試劑的污染。污染問題是造成環(huán)境DNA實驗結(jié)果誤差的一個重要影響因素?？赡軐?dǎo)致分析錯誤的因素包括假陰性的問題，環(huán)境DNA技術(shù)需要依靠數(shù)據(jù)庫，但是現(xiàn)如今的數(shù)據(jù)庫生物信息并不完善，特別是針對感興趣的生物體的生態(tài)環(huán)境(如低活性或者有限的時間內(nèi)活動),缺乏參考物種名稱的序列信息,以及良好的檢測系統(tǒng)的發(fā)展不足影響環(huán)境 DNA 的最終檢測結(jié)果。此外，環(huán)境DNA分析方法需要進(jìn)一步規(guī)范完善，很多研究人員在環(huán)境DNA樣品采集、保存、提取等過程采取的方法各不相同，并沒有形成系統(tǒng)的分析方法，今后的研究中可以對環(huán)境DNA技術(shù)操作流程進(jìn)行進(jìn)一步的優(yōu)化和完善。環(huán)境中的DNA會被微生物和紫外線輻射所降解，所以目前很難用具體的數(shù)值來預(yù)測和評估其降解率、平流和擴(kuò)散。環(huán)境DNA技術(shù)的檢測結(jié)果在時間和空間這兩個維度的精度較低，檢測精度有待提升。環(huán)境DNA技術(shù)可以通過特定物種DNA的有無直觀的表征河道建筑對魚類活動的影響，可以通過檢測洄游性魚類的DNA來評估河道設(shè)施對河流生態(tài)健康的影響，但由于當(dāng)前環(huán)境DNA技術(shù)仍處于發(fā)展階段，在定量評價上需要未來的進(jìn)一步研究。

每一種調(diào)研方法都有其優(yōu)點(diǎn)和缺點(diǎn)，因此了解和使用環(huán)境DNA作為生物多樣性研究的工具的優(yōu)缺點(diǎn)是非常重要的。環(huán)境DNA可以大大增加在時間和空間上獲得生物多樣性數(shù)據(jù)的可能性，它可以用來了解生物體與環(huán)境中各種因素之間的相互作用。通過進(jìn)一步優(yōu)化環(huán)境DNA樣品采集、保存方法、DNA提取等分析方法，預(yù)計環(huán)境 DNA技術(shù)未來將進(jìn)一步發(fā)展跨學(xué)科的綜合研究，以解讀生物體與其環(huán)境中各種因素之間的相互作用，例如其將食物鏈的能量流動、動物攝食等研究領(lǐng)域的作用展示出來。