王 邱，何海彤，李錦清，周銘林，劉德群

（廣東產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)研究院，廣東 佛山 528322）

硫脲（thiourea）是一種含硫化合物，白色而有光澤的晶體，又稱為硫代尿素，因其還原性、抗氧化和漂白作用，廣泛用于紡織業(yè)，也可用作獸藥的生產(chǎn)原料。還曾一度作為防腐劑，應(yīng)用于各類需要保鮮、防腐以及漂白的食品中[1-2]。有研究表明，硫脲雖然一次作用時(shí)毒性小，反復(fù)作用可抑制甲狀腺和造血器官的機(jī)能，進(jìn)而引起變態(tài)反應(yīng)，長期接觸可能出現(xiàn)頭痛、無力、嗜睡、血壓下降、基礎(chǔ)代謝降低、白細(xì)胞減少等癥狀[3]，因此我國不允許其作為食品添加劑作用于食品中。有關(guān)部門在日常監(jiān)督抽檢或風(fēng)險(xiǎn)監(jiān)測(cè)工作中發(fā)現(xiàn)有部分生產(chǎn)廠家向小麥粉及其制品中添加硫脲，以達(dá)到漂白、增筋的目的。由于小麥粉及其制品是人民群眾主要的食品及原料，受眾面十分廣泛，因此為保障人民群眾食品安全，迫切需要建立高效、快速檢測(cè)小麥粉及其制品中硫脲的方法。

目前，測(cè)定硫脲的分析方法主要有分光光度法、離子色譜法、高效液相色譜法以及高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法[1-13]。離子色譜法主要用于水樣中硫脲含量的測(cè)定，譚炯等[10]運(yùn)用離子色譜對(duì)水樣中硫脲含量進(jìn)行了研究，先用高錳酸鉀將硫脲中的硫羰基氧化為，再用離子色譜對(duì)進(jìn)行測(cè)定得到其濃度，最后根據(jù)生成的與硫脲的關(guān)系來計(jì)算出硫脲的含量。小麥粉及其制品相較于水而言基質(zhì)復(fù)雜得多，高效液相色譜法以及高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法的前處理及上機(jī)檢測(cè)更加簡便、高效、快捷，因此已經(jīng)成為硫脲的主要檢測(cè)手段。何瑞云等[3]運(yùn)用高效液相色譜法建立了面粉及其制品中硫脲的測(cè)定方法，以水為樣品提取液，用Inertsil CX陽離子交換柱進(jìn)行分離，得到方法檢出限（S/N=3）為2.0 mg/kg。目前暫時(shí)還沒有關(guān)于硫脲檢測(cè)的國家標(biāo)準(zhǔn)，僅有國家食品藥品監(jiān)督管理局發(fā)布的補(bǔ)充檢驗(yàn)方法《總局關(guān)于發(fā)布食品中那非類物質(zhì)的測(cè)定和小麥粉中硫脲的測(cè)定2項(xiàng)檢驗(yàn)方法的公告（2016年第196號(hào)）》[14]—小麥粉中硫脲的測(cè)定BJS 201602，此方法僅適用于小麥粉中硫脲的測(cè)定，并不確定是否適用于小麥粉制品，且色譜柱的使用也比較局限（HILIC親水柱）。

本實(shí)驗(yàn)對(duì)小麥粉及其制品中硫脲的測(cè)定條件進(jìn)行了研究，對(duì)樣品前處理?xiàng)l件和上機(jī)條件均進(jìn)行了優(yōu)化，重點(diǎn)研究了前處理各方面的選擇，旨在建立一種更高效、便捷、靈敏的檢測(cè)方法。

1 材料與方法

1.1 儀器與材料

LC-30AD超高效液相色譜儀（配有二極管陣列檢測(cè)器）：日本島津公司；JJ500Y型百分位電子天平：富陽騰輝電子科技有限公司；ME204/02型萬分位電子天平：瑞士梅特勒托利多公司；JP-C400型超聲波清洗器：廣州市吉普超聲波電子設(shè)備有限公司；centrifuge 5804R型高速冷凍離心機(jī)：廣東省中科進(jìn)出口有限公司。

硫脲標(biāo)準(zhǔn)品（純度≥99%）：上海安譜實(shí)驗(yàn)科技股份有限公司；磷酸二氫銨（分析純）：阿法埃莎（中國）化學(xué)有限公司；磷酸（色譜純）：天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司；甲醇（色譜純）：賽默飛世爾科技（中國）有限公司；實(shí)驗(yàn)用水為超純水。

0.02 mol/L磷酸二氫銨溶液（pH=3.0）：準(zhǔn)確稱取磷酸二氫銨2.4 g于1 000 mL流動(dòng)相瓶中，加入900 mL超純水，超聲溶解，靜置后用磷酸調(diào)節(jié)pH至3.0（大約1 mL磷酸），再加超純水至1 000 mL刻度，混勻后過0.45 μm濾膜備用。

小麥粉及掛面樣品，購買于本市批發(fā)市場。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

精密稱取硫脲標(biāo)準(zhǔn)品10 mg于100 mL容量瓶中，加水溶解并稀釋至刻度，得到濃度為100 μg/mL的硫脲標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，分別移取 0.1、0.25、0.5、2.5、5.0、10.0 mL 標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液于 50 mL容量瓶中，用水稀釋至刻度，得到濃度分別為0.2、0.5、1.0、5.0、10.0、20.0 μg/mL 的系列標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，將純水（0 μg/mL，排除試劑干擾）和系列標(biāo)準(zhǔn)工作溶液按照濃度由稀至濃依次進(jìn)樣，可獲得空白溶液圖譜、標(biāo)準(zhǔn)溶液圖譜以及校正曲線。

1.2.2 樣品前處理

先將掛面樣品用粉碎機(jī)粉碎，全部通過 40目篩，備用。準(zhǔn)確稱取小麥粉樣品和掛面樣品約2 g于50 mL容量瓶中，加入超純水20 mL混勻，在25 ℃下超聲15 min，定容，混勻，轉(zhuǎn)移至50 mL離心管中，10 000 r/min離心2 min，上清液過濾膜上機(jī)待測(cè)。

1.2.3 儀器條件

色譜柱：Agilent ZORBAX SB-C18（5 μm，4.6×250 mm）；流動(dòng)相：A：甲醇，B：0.02 mol/L磷酸二氫銨溶液，A+B=2+98，等度洗脫，流速為0.5 mL/min，柱溫：25 ℃；進(jìn)樣量：10 μL；檢測(cè)波長為236 nm。

2 結(jié)果與分析

2.1 樣品前處理?xiàng)l件的優(yōu)化

2.1.1 提取試劑的選擇

根據(jù)參考文獻(xiàn)[1]可知硫脲的提取溶液一般為水、甲醇、乙腈和乙醇，本實(shí)驗(yàn)對(duì)這幾種試劑的提取效果進(jìn)行了比較。選取小麥粉和掛面樣品各一個(gè)，每個(gè)樣品稱取同質(zhì)量的4份，分別加入等量的硫脲標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，再分別以水、甲醇、乙腈和乙醇作為提取溶劑，再按照 2.2.2所述前處理方法進(jìn)行操作，最后上機(jī)測(cè)定。根據(jù)加標(biāo)樣品的硫脲峰面積大小來對(duì)比提取效果。實(shí)驗(yàn)結(jié)果（見圖1）顯示對(duì)小麥粉和掛面提取效果最佳的均為水，其次為乙腈、甲醇，乙醇效果相對(duì)最弱。因此選擇水為提取溶劑，同時(shí)可將水定為硫脲標(biāo)準(zhǔn)品溶解和稀釋的溶劑。硫脲的標(biāo)準(zhǔn)溶液經(jīng)二極管陣列檢測(cè)器在190～800 nm進(jìn)行全波段掃描后，發(fā)現(xiàn)硫脲在236 nm處有最大吸收（見圖2，硫脲在水中的最大吸收波長為 236 nm、乙腈為238 nm、甲醇為240 nm、乙醇為246 nm），因此選定236 nm為硫脲液相色譜法的檢測(cè)波長。

圖1 不同提取溶劑的加標(biāo)樣品的峰面積柱狀圖Fig.1 Histogram of peak area of labeled sampleswith different extraction solvents

圖2 硫脲標(biāo)準(zhǔn)溶液的紫外吸收光譜圖Fig.2 Thiourea ultraviolet absorption spectra of the standard solution

2.1.2 超聲提取溫度的選擇

選取一個(gè)小麥粉樣品和一個(gè)掛面樣品，均稱取等量的5份，分別加入等量的硫脲標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，以水作為提取溶劑，分別在 20、25、30、35、40 ℃溫度下超聲15 min，按照1.2.2所述進(jìn)行操作，最后上機(jī)待測(cè)，根據(jù)各樣品的硫脲峰面積大小來比較提取效果。實(shí)驗(yàn)結(jié)果（見圖3）表明小麥粉樣品與掛面樣品的提取溫度在 25 ℃時(shí)峰面積大于在 20 ℃時(shí)的峰面積，但 25 ℃之后，隨著提取溫度的升高峰面積變化并不大，在 40 ℃時(shí)出現(xiàn)峰面積變小的情況，可能是因?yàn)闇囟冗^高造成了硫脲的降解。因此本實(shí)驗(yàn)選擇 25 ℃為超聲提取溫度。

圖3 不同提取溫度的加標(biāo)樣品的峰面積柱狀圖Fig.3 Histogram of peak area of labeled samples at different extraction temperatures

2.1.3 超聲提取時(shí)間的選擇

選取一個(gè)小麥粉樣品和一個(gè)掛面樣品，均稱取等量的5份，分別加入等量的硫脲標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，以水作為提取溶劑，在25 ℃下分別超聲提取10、15、20、25、30 min，按照1.2.2所述進(jìn)行操作，最后上機(jī)待測(cè)，根據(jù)各樣品的硫脲峰面積大小來比較提取效果。實(shí)驗(yàn)結(jié)果（見圖4）表明小麥粉樣品和掛面樣品超聲時(shí)間在 15 min時(shí)峰面積明顯大于在 10 min時(shí)的峰面積，但在提取時(shí)間為15 min之后峰面積變化不大，因此本實(shí)驗(yàn)選擇15 min為樣品的超聲提取時(shí)間。

圖4 不同提取時(shí)間的加標(biāo)樣品的峰面積柱狀圖Fig.4 Histogram of peak area of labeled samples at different extraction times

綜上所述，本實(shí)驗(yàn)的前處理方法為：以水為提取溶劑，在25 ℃條件下超聲提取15 min，再以10 000 r/min的速度離心2 min后，上清液過濾膜上機(jī)測(cè)定。

2.2 高效液相色譜儀器條件的優(yōu)化

2.2.1 流動(dòng)相的選擇

根據(jù)參考文獻(xiàn)[3]可知硫脲的流動(dòng)相一般為甲醇-水、乙腈-水體系，對(duì)這兩種流動(dòng)相體系進(jìn)行了考察（見圖5-a、圖5-b），由于硫脲的極性偏大，即使甲醇或乙腈的比例較低，在反相色譜柱上的保留均不理想，出峰較快，且峰形較差，因此考慮使用流動(dòng)相添加劑。本次實(shí)驗(yàn)比較了在水相中加乙酸-乙酸銨緩沖鹽/甲醇和磷酸-磷酸二氫銨緩沖鹽/甲醇對(duì)硫脲色譜峰的影響（見圖5-c、圖5-d），發(fā)現(xiàn)在水相中添加0.02 mol/L磷酸-磷酸二氫銨緩沖鹽（用磷酸調(diào)節(jié)pH至3.0）時(shí)峰形最佳，最終確定流動(dòng)相體系為0.02 mol/L磷酸-磷酸二氫銨+甲醇=98+2，在流速為0.5 mL/min時(shí)仍有較好的峰形，實(shí)驗(yàn)采用等度洗脫，有助于穩(wěn)定出峰時(shí)間，大批量樣品進(jìn)樣時(shí)，每相隔十針左右需設(shè)置甲醇水的梯度沖柱程序，以便及時(shí)沖洗色譜柱，避免柱頭污染，造成對(duì)目標(biāo)峰的干擾，同時(shí)還能延長色譜柱的使用壽命。

圖5 不同流動(dòng)相的硫脲的色譜圖Fig.5 Chromatograms of thiourea in different mobile phases

2.2.2 色譜柱的選擇

當(dāng)實(shí)驗(yàn)選擇甲醇-水或乙腈-水作為流動(dòng)相體系時(shí)，即使是柱長為250 mm的C18柱，硫脲的保留均不理想，出峰較快，峰形較差，或與溶劑峰疊加。按照BJS 201602方法中所述，將色譜柱更換為HILIC柱，但必須將樣品的提取溶劑和標(biāo)準(zhǔn)品的稀釋溶劑更換為乙醇，才能在流動(dòng)相為乙腈+水=90+10時(shí)，獲得較為滿意的保留時(shí)間和峰形，但如 2.1.1中所述，乙醇的提取效果是四種提取溶劑中相對(duì)最弱的，可能會(huì)造成痕量硫脲不易檢出的情況。當(dāng)選擇磷酸-磷酸二氫銨緩沖鹽+甲醇流動(dòng)相體系時(shí)，即使是普通的 C18柱，也能獲得較好的峰形，本次實(shí)驗(yàn)選擇了 Agilent ZORBAX SB-C18（5 μm 150×4.6 mm）柱、Agilent Poroshell 120 EC-C18（4 μm 150×4.6 mm）柱和Agilent ZORBAX SB-C18（5 μm 250×4.6 mm）柱三種色譜柱來測(cè)試硫脲的峰形（結(jié)果見圖6），Agilent ZORBAX SB-C18（5 μm 250×4.6 mm）柱具有更長的保留時(shí)間，有利于將硫脲與雜質(zhì)峰分開，因此本次實(shí)驗(yàn)最終選擇的色譜柱為 Agilent ZORBAX SB-C18（5 μm 250×4.6 mm）色譜柱。

圖6 不同色譜柱的硫脲色譜峰Fig.6 The chromatographic peaks of thiourea on different chromatographic columns

2.2.3 色譜柱柱溫的選擇

在同一流動(dòng)相體系和色譜柱條件下，對(duì)比了硫脲標(biāo)準(zhǔn)溶液（20.0 μg/mL）在 25、30和 40 ℃下對(duì)目標(biāo)峰的保留時(shí)間和峰形的影響。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明色譜峰的保留時(shí)間和峰形在不同柱溫下基本沒有變化，因此本次選擇25 ℃為色譜柱柱溫（見表1）。

表1 硫脲標(biāo)準(zhǔn)溶液在不同柱溫時(shí)的峰面積Table 1 Peak areas of thiourea standard solution at different column temperatures

2.3 方法學(xué)考察

2.3.1 校準(zhǔn)曲線的繪制

本實(shí)驗(yàn)選取的線性范圍為0～20 μg/mL。分別移取0.1、0.25、0.5、2.5、5.0、10.0 mL標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液于50 mL容量瓶中，用水稀釋至刻度，得到濃度分別為 0.2、0.5、1.0、5.0、10.0、20.0 μg/mL的系列標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，將純水（0 μg/mL）和系列標(biāo)準(zhǔn)工作溶液按照濃度由稀至濃依次進(jìn)樣，以硫脲的濃度（X，μg/mL）為橫坐標(biāo)，峰面積（Y）為縱坐標(biāo)，繪制校準(zhǔn)曲線，得到回歸方程和相關(guān)系數(shù)（r）?；貧w方程為Y=177 636X–616.712(r=0.999 99)，表明硫脲在0～20.0 μg/mL的濃度范圍內(nèi)線性良好。

2.3.2 檢出限和定量限

將硫脲標(biāo)準(zhǔn)溶液用水逐級(jí)稀釋，高效液相色譜測(cè)定，3倍信噪比時(shí)（S/N=3）硫脲標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度為0.02 μg/mL，對(duì)應(yīng)的樣品含量為0.5 mg/kg，10倍信噪比時(shí)（S/N=10）硫脲標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度為0.06 μg/mL，對(duì)應(yīng)的樣品含量為1.5 mg/kg。因此，當(dāng)稱樣量為2.0 g，定容體積為50 mL時(shí)，本方法檢出限為0.5 mg/kg，定量限為1.5 mg/kg。

2.3.3 加標(biāo)回收率

對(duì)于食品中的禁用物質(zhì)，加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)應(yīng)在方法檢出限、2倍方法檢出限、10方法檢出限進(jìn)行3水平測(cè)試。將小麥粉樣品和掛面樣品先按照1.2.2處理后上機(jī)選出硫脲含量為未檢出的陰性樣品作為空白基質(zhì)樣品，稱取小麥粉陰性樣品和掛面陰性樣品各9份，分別加入50、100、500 μL濃度為 20.0 μg/mL（即0.5、1.0、5.0 mg/kg三個(gè)水平）的標(biāo)準(zhǔn)溶液，每個(gè)濃度水平加標(biāo)3次，前處理后上機(jī)測(cè)定，加標(biāo)回收率實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表2。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明小麥粉和掛面樣品的硫脲加標(biāo)回收率均符合 GB/T 24704—2008實(shí)驗(yàn)《實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量控制規(guī)范 食品理化檢測(cè)》附錄 F中回收率的要求，證明該方法準(zhǔn)確、可靠。2.3.4 方法精密度

表2 硫脲加標(biāo)回收率實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 2 Thiourea standard addition recovery rate test results

對(duì)于食品中的禁用物質(zhì)，精密度實(shí)驗(yàn)應(yīng)在方法檢出限、2倍方法檢出限、10方法檢出限進(jìn)行3水平測(cè)試，每個(gè)水平做6次平行實(shí)驗(yàn)，計(jì)算其相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）。硫脲精密度實(shí)驗(yàn)測(cè)定結(jié)果見表3。

表3 硫脲精密度實(shí)驗(yàn)測(cè)定結(jié)果Table 3 Results of precision test of thiourea

精密度實(shí)驗(yàn)結(jié)果符合 GB/T 27404—2008實(shí)驗(yàn)《實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量控制規(guī)范 食品理化檢測(cè)》附錄F中精密度的要求，證明該方法穩(wěn)定、可靠。

2.4 實(shí)際樣品的測(cè)定

按照建立的方法對(duì)購買于本地批發(fā)市場的20份小麥粉樣品和10份掛面樣品進(jìn)行處理和測(cè)定，發(fā)現(xiàn)所有樣品中硫脲的含量均低于檢出限，即未檢出。對(duì)其中一份小麥粉樣品和一份掛面樣品進(jìn)行加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)，添加水平均為1.0 mg/kg，加標(biāo)回收率結(jié)果分別為 93.1%和 94.8%。硫脲標(biāo)準(zhǔn)品色譜圖、小麥粉樣品色譜圖以及小麥粉加標(biāo)樣品色譜圖見圖7（掛面樣品以及掛面加標(biāo)樣品的色譜圖與小麥粉基本一致）。

圖7 硫脲標(biāo)準(zhǔn)品、小麥粉樣品、小麥粉加標(biāo)樣品色譜圖Fig.7 Chromatograms of thiourea standard, wheat flour sample and wheat flour standard sample

3 結(jié)論

本方法通過比較四種溶劑（水、乙腈、甲醇和乙醇）對(duì)硫脲的提取效果，選擇水為小麥粉及其制品的提取溶劑，最大吸收波長為236 nm。通過比較各流動(dòng)相體系對(duì)硫脲的保留時(shí)間以及峰形的影響，選擇0.02 mol/L磷酸-磷酸二氫銨緩沖液+甲醇=98+2為流動(dòng)相，色譜柱為Agilent ZORBAX SB-C18柱。該方法具有更低的檢出限和定量限，分別為0.5 mg/kg和1.5 mg/kg。對(duì)本實(shí)驗(yàn)進(jìn)行的方法學(xué)考察表明硫脲在0～20.0 μg/mL的范圍內(nèi)線性良好，相關(guān)系數(shù)r=0.999 99，該方法的加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)和精密度實(shí)驗(yàn)結(jié)果均符合 GB/T 27404—2008附錄F的要求，證明該方法能夠準(zhǔn)確、穩(wěn)定可靠地檢測(cè)小麥粉及其制品中的硫脲成分。

備注：本文的彩色圖表可從本刊官網(wǎng)（http//lyspkj.ijournal.cn）、中國知網(wǎng)、萬方、維普、超星等數(shù)據(jù)庫下載獲取。