李雯璐 徐大鵬 季道德①

(1. 煙臺大學(xué)海洋學(xué)院 山東煙臺 264005; 2. 廈門大學(xué)近海海洋環(huán)境與科學(xué)國家重點實驗室 海洋與地球?qū)W院 海洋微型生

物與地球圈層研究所 福建廈門 361104)

浮游纖毛蟲是一類廣泛分布于海洋中上層、營浮游生活的纖毛蟲, 粒級大小一般在5～200 μm 之間。它們是pico-級(0.2～2 μm)和nano-級(2～20 μm)浮游生物的主要消費者(Suzukiet al, 2007), 同時也是后生動物和魚類幼蟲的食物來源(Stoeckeret al, 1987;Gómez, 2007), 在連接微食物網(wǎng)和傳統(tǒng)食物鏈的物質(zhì)循環(huán)和能量流動中發(fā)揮著重要作用(Pierceet al, 1992;Weisseet al, 2022)。

海洋浮游纖毛蟲主要包括砂殼纖毛蟲和無殼寡毛類, 也包括一些前口類、盾纖類等類群。依照Lynn(2008)的分類系統(tǒng), 砂殼類纖毛蟲隸屬于旋毛綱(Spirotrichea)、環(huán)毛亞綱(Choreotrichia)、砂殼目(Tintinnida), 其重要特征是具有管狀或瓶狀的外殼,因其近岸豐度高、采樣易獲得的特點, 目前世界各海區(qū)已經(jīng)鑒定約1 000 種(Dolan, 2010)。殼的口徑和長度、殼的形狀、黏著顆粒的有無是砂殼類重要的分類學(xué)依據(jù)(Capriuloet al, 1982; Dolanet al, 2002)。無殼寡毛類纖毛蟲隸屬于旋毛綱(Spirotrichea)、寡毛亞綱(Oligotrichia)、寡毛目(Oligotrichida)。目前已報道無殼寡毛類約200 余種(Liuet al, 2017), 然而據(jù)Foissner等人(2008)和Agatha (2011)估計, 無殼寡毛類在世界范圍內(nèi)約有830～1 280 種, 其多樣性可能有83%～89%以上是未知的。

傳統(tǒng)的形態(tài)學(xué)由于分辨率低、費時費力等弊端,難以避免地對形態(tài)上不可區(qū)分的物種(即隱性多樣性)產(chǎn)生遺漏。高通量測序(high-throughput sequencing,HTS)因其通量高、耗時短、相對成本低等特點, 對微型生物生態(tài)學(xué)研究產(chǎn)生了革命性影響。對環(huán)境DNA 的高通量測序可以揭示纖毛蟲的多樣性、分布模式和長時間尺度上的動態(tài)變化, 從而獲得更為全面的群落信息(Slapetaet al, 2006; De Schepperet al,2019)。然而研究顯示基于HTS 得出的纖毛蟲多樣性大大超過已知形態(tài)物種數(shù)量(Bachyet al, 2013), 甚至高達(dá)6 倍之多(De Vargaset al, 2017), 因此基于形態(tài)和分子的分布模式是否一致尚未可知。近年來,越來越多的研究者嘗試將多種方法相結(jié)合對纖毛蟲進(jìn)行生態(tài)調(diào)查: Santoferrara 等人(2016)對Lugol’s 固定樣品鏡檢的同時結(jié)合HTS, 對大西洋砂殼類纖毛蟲的群落組成和分布模式進(jìn)行研究。Zhao 等(2017)利用HTS 比較了環(huán)境DNA 和RNA 兩種方法在纖毛蟲群落垂直分布上的差異, 顯示出RNA 獲得的多樣性高于DNA。在調(diào)查南海浮游纖毛蟲多樣性和垂直分布時, Sun 等(2019)將HTS 與定量蛋白銀染色(QPS)相結(jié)合, 結(jié)果顯示兩種方法在揭示較低分類等級的群落組成時存在差異。另外, 有研究者將QPS 的形態(tài)學(xué)方法與DNA 及其cDNA 的HTS 三者相結(jié)合, 調(diào)查沉積物中纖毛蟲的多樣性(黃平平等, 2017)。綜合來看, 利用分子測序與傳統(tǒng)形態(tài)學(xué)方法所揭示的群落組成及其變化趨勢較為一致, 尤其是常見/優(yōu)勢物種, 而高通量測序因其測序深度高可發(fā)現(xiàn)大量稀有物種序列。因此將兩種方法相結(jié)合能夠在一定程度上彌補兩者的弊端, 從而獲得更為全面的纖毛蟲群落信息。

近岸環(huán)境與人類社會的關(guān)系最為密切, 且同時受到人為因素和自然因素的雙重影響而具有一定的特殊性。一方面, 三山島近岸海域受到多重人類生產(chǎn)活動的影響, 海水富營養(yǎng)化嚴(yán)重、水質(zhì)下降; 另外, 受到風(fēng)暴潮等自然因素的影響, 水體擾動頻繁使得渾濁度較高。這些因素可能對該生境中微食物網(wǎng)成員(如纖毛蟲)的豐度、物種多樣性和群落結(jié)構(gòu)產(chǎn)生影響。本研究首次利用傳統(tǒng)形態(tài)學(xué)和分子測序技術(shù)相結(jié)合的手段,對萊州灣三山島近岸海域的浮游纖毛蟲進(jìn)行周年生態(tài)調(diào)查, 旨在了解該海域的浮游纖毛蟲的多樣性、群落組成和時空變化, 以及對環(huán)境因子的響應(yīng)。

1 材料與方法

1.1 調(diào)查站位、樣品采集和預(yù)處理

本研究于2020 年9 月至2021 年8 月在萊州灣三山島近岸海域設(shè)置3 個采樣點, A、B、C 站點分別位于碼頭、離岸300 m 處和養(yǎng)殖廠排水口(圖1), 使用漁船進(jìn)行每月兩次的浮游樣品采集。由于海況原因,缺失3 個站點的1、2、7、8 月上旬和5 月下旬的樣品及數(shù)據(jù), 以及離岸的B 站位11、1 和4 月下旬樣品及數(shù)據(jù)。因此, 秋季(9～11月)共采集樣品17 份, 冬季(12～2月)樣品11 份, 春季(3～5月)樣品14 份, 夏季(6～8月)樣品12 份, 共計54 個樣品。

圖1 萊州灣三山島近岸采樣點示意圖Fig.1 Locations of the sampling sites in Sanshan Island, Laizhou Bay

使用便攜式水質(zhì)分析儀(YSI, USA)測量原位水溫、鹽度、溶解氧和pH 值。使用卡扣式采水器采集表層水樣(深度20 cm), 每一個站位采集兩個水樣各1 L, 混合為一個2 L 的樣品。用孔徑為200 μm 的篩絹進(jìn)行預(yù)過濾, 再使用聚碳酸酯濾膜 (Millipore,Ireland) (直徑45 mm、孔徑0.22 μm)對1 500 mL 水樣進(jìn)行抽濾收集, 設(shè)置三組重復(fù)(每張膜500 mL)。將抽濾得到的含有環(huán)境DNA 的濾膜保存于凍存管中, 立即置于－80 °C 冰箱中保存。取100 mL 表層原位海水,經(jīng)濾膜孔徑為0.45 μm 的針頭過濾器過濾后收集在聚乙烯瓶中, 并置于－20 °C 冰箱中保存, 用于營養(yǎng)鹽分析。氨態(tài)氮(NH4＋-N ), 硝態(tài)氮(NO3--N ), 亞硝態(tài)氮(NO2--N ), 磷酸鹽(PO34-)和硅酸鹽含量(SiO23-)使用營養(yǎng)鹽自動分析儀(Seal, Germany)進(jìn)行分析。水樣的總碳(TC)和總無機碳(TIC)含量使用Vario 微型立方元素分析儀(Elementar, Germany)進(jìn)行測定。使用400 目浮游生物網(wǎng)(孔徑37 μm)在A、B 兩個站點水平拖網(wǎng)采集鏡檢樣品并用廣口采樣瓶收集, 獲得35 個樣品用于纖毛蟲的形態(tài)學(xué)分類鑒定。

1.2 高通量測序方法

環(huán)境總DNA 使用Fast DNA SPIN Kit for Soil DNA快速提取試劑盒(Mpbio, USA) 進(jìn)行提取。使用NanoDrop One (Thermo-Fisher, USA)對DNA 的濃度和純度進(jìn)行測定后, 于－80 °C 保存。

利用真核生物通用引物528F (5′-GCGGTAATT CCAGCTCCAA-3′)和 706R (5′-AATCCRAGAATTT CACCTCT-3′)(Cheunget al, 2010) 對18S rRNA 基因的V4 區(qū)進(jìn)行PCR 擴增, 于北京諾禾致源生物信息科技有限公司利用Illumina NovaSeq 測序平臺對文庫進(jìn)行雙末端PE250 測序。

1.3 數(shù)據(jù)處理及分析

從下機數(shù)據(jù)中拆分出各樣本數(shù)據(jù), 截去barcode和引物序列后使用FLASH 軟件(V 1.2.11, http://ccb.jhu.edu/software/FLASH/)(Mago?et al, 2011)對樣本的測序結(jié)果進(jìn)行拼接, 得到低質(zhì)量原始測序數(shù)據(jù)。隨后使用fastp 軟件對得到的低質(zhì)量原始測序數(shù)據(jù)進(jìn)行質(zhì)控, 得到高質(zhì)量數(shù)據(jù)。利用QIIME 和Mothur 軟件包(Schlosset al, 2009; Caporasoet al, 2010)去除嵌合體, 利用UCLUST 以97%的相似性水平劃分可操作分類單元(operational taxonomic units, OTUs), 去除只有一條代表序列的OTU, 利用原生生物核糖體參考數(shù)據(jù)庫(Protist Ribosomal Reference, PR2)數(shù)據(jù)庫進(jìn)行物種分類注釋, 得到最終的OTU 表格。抽取纖毛門數(shù)據(jù)用于纖毛蟲群落的分析, 將各樣品的序列相對豐度數(shù)據(jù)按照季節(jié)劃分整合。

為了保證樣品間α 多樣性比較的可靠性和準(zhǔn)確性, 以所有樣品中最小序列數(shù)為標(biāo)準(zhǔn), 對樣品數(shù)據(jù)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化, 然后計算α 多樣性指數(shù)(Chao 1、Richness、Shannon 和 Simpson 指數(shù))。通過單因素方差分析(ANOVA)對浮游原生生物α 多樣性的時空差異進(jìn)行統(tǒng)計檢驗。

基于Bray-Curtis 距離矩陣進(jìn)行浮游原生生物群落的β 多樣性的分析。使用PRIMER 6.0 軟件對浮游原生生物群落進(jìn)行非計量多維尺度分析(non-metric multidimensional scaling, NMDS); 利 用 R 中 的ggplot2 包進(jìn)行主坐標(biāo)分析(principal co-ordinates analysis, PCoA), 并利用ANOSIM 分析檢驗三個站點不同季節(jié)的浮游原生生物群落結(jié)構(gòu)的差異情況; 使用SPSS 軟件對浮游原生生物主要類群和環(huán)境因子進(jìn)行Spearman 相關(guān)分析; 使用R 中的vegan 包進(jìn)行冗余分析(redundancy analysis, RDA), 尋找影響浮游原生生物群落結(jié)構(gòu)的主要環(huán)境因子。

1.4 形態(tài)學(xué)方法

將拖網(wǎng)樣品充分混勻后利用解剖鏡進(jìn)行鏡檢觀察, 依據(jù)文獻(xiàn)對浮游纖毛蟲進(jìn)行鑒定和計數(shù)(Kofoidet al, 1929; 宋微波等, 2009; 張武昌等, 2012), 并拍照記錄生物學(xué)特征及出現(xiàn)頻次, 以獲得浮游纖毛蟲多樣性信息。將鏡檢鑒定后的纖毛蟲用滅菌水清洗數(shù)次后轉(zhuǎn)移至滅菌后的1.5 mL 離心管中, 用于提取DNA。引物為: EukA (5′-AACCTGGTTGATCCTGCCA GT-3′)、EukB (5′-TGATCCTTCTGCAGGTTCACCT AC-3′)、Euk82F (5′-GAAACTGCGAATGGCTC-3′)和U1492R (5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′)(Medlinet al, 1988; López-Garcíaet al, 2001; Dotyet al,2005)。PCR 擴增程序依照(Wanget al, 2019)進(jìn)行。使用TIANgel Midi Purification Kit (天根生化科技有限公司, 上海) 試劑盒純化PCR 產(chǎn)物。將純化后的擴增產(chǎn)物插入質(zhì)粒載體 pTZ57R/T (InsTAcloneTM PCR Cloning Kit, Fermentas, Canada), 并將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)移至感受態(tài)細(xì)胞Trans1-T1 (全式金生物技術(shù)股份有限公司, 中國北京)中。搖菌培養(yǎng)1 h 后接種至瓊脂糖培養(yǎng)基上過夜培養(yǎng)。隨機挑選6 個重組克隆, 利用引物M13-20 和M13-26 對菌樣進(jìn)行PCR 驗證。將滿足條件的菌液送至青島生工測序公司進(jìn)行測序。將測序后的DNA 序列與數(shù)據(jù)庫中的序列進(jìn)行比對, 相似度99%以上則認(rèn)為是同一物種。

2 結(jié)果

2.1 環(huán)境因子

12 個環(huán)境因子(包括溫度、鹽度、溶解氧、pH、總有機碳、總無機碳、總碳、磷酸鹽、氨態(tài)氮、亞硝態(tài)氮、硝態(tài)氮、硅酸鹽含量)時空變化如圖2 所示。三個站點間的所有環(huán)境因子均無顯著差異, 有6 個環(huán)境因子表現(xiàn)出明顯的季節(jié)模式: 水溫(ANOVA,P＜0.05)、總碳(ANOVA,P＜0.01) 、總無機碳(ANOVA,P＜0.01)和總有機碳含量(ANOVA,P＜0.01)一致呈現(xiàn)為夏秋季＞冬春季的趨勢; 鹽度(ANOVA,P＜0.01)和溶解氧(ANOVA,P＜0.05)呈現(xiàn)冬春季＞夏秋季的趨勢。三個站點間鹽度和有機碳含量的季節(jié)變化折線圖變化趨勢相似。

圖2 不同站點與季節(jié)的環(huán)境因子Fig.2 Environmental factors of different sites and seasons.

A 站點水溫年變化為1.7～27.9℃, 平均15.4 °C,其中最高溫出現(xiàn)在2020 年9 月上旬; 水溫最低出現(xiàn)在2021 年1 月下旬; B 站點水溫年變化為4～27 °C, 平均14 °C, 其中最高溫出現(xiàn)在2021 年8 月下旬; 水溫最低出現(xiàn)在2020 年12 月和2021 年2 月下旬; C 站點水溫年變化為10.9～30.4 °C, 平均22.2 °C, 其中最高溫出現(xiàn)在2021 年7 月下旬, 水溫最低出現(xiàn)在2021 年2 月下旬。三個站點的溶解氧在夏秋兩季含量較為一致且最低值出現(xiàn)在夏季, 而冬季A 站點溶解氧含量最高(27.14 mg/L), 其次是B 站點(21.52 mg/L)。A、B兩個站點的pH 值在秋冬兩季的變化幅度較大。A、B站點的磷酸鹽含量在春夏兩季較高, 氨態(tài)氮和亞硝態(tài)氮含量在春夏季交替時升高, 硝態(tài)氮則相反, 在春夏季交替時含量降低, 硅酸鹽含量在夏秋兩季最高,而在春季達(dá)到最低值。C 站點的營養(yǎng)鹽含量季節(jié)變化較大, 氨態(tài)氮、硝態(tài)氮和亞硝態(tài)氮含量均呈現(xiàn)出夏季最低, 秋冬季高的特點, 最低值出現(xiàn)在7 月上旬和8月下旬, 最高值出現(xiàn)在9 月上旬和12 月下旬。磷酸鹽含量呈現(xiàn)夏季最低, 春秋季最高, 最低值出現(xiàn)在6月下旬, 最高值出現(xiàn)在4 月上旬。

在三個站點間, A、B 站點環(huán)境因子的全年變化擬合程度較高, 但pH 在秋冬季變化趨勢相反, 磷酸鹽濃度在春夏季呈現(xiàn)明顯不同的變化?？偟膩砜? C 站點海水理化因子變化較為平緩而營養(yǎng)鹽濃度變化浮動較大, 與A、B 站點變化擬合程度較差。

2.2 群落組成與相對豐度

高通量測序結(jié)果表明, 旋毛綱(Spirotrichea)是最優(yōu)勢類群, 占纖毛蟲序列的64.10%, 其次是寡膜綱(Oligohymenophorea, 2.17%) (圖 3a)。將旋毛綱(Spirotrichea)在目(order)水平上進(jìn)一步細(xì)分如圖3b 所示, 無殼寡毛類(急游蟲目和環(huán)毛目共占序列總豐度的40.14%)和砂殼類(砂殼目, 10.67%)是浮游纖毛蟲的主要優(yōu)勢類群, 并且顯示出明顯的季節(jié)模式。其中急游蟲目(Strombidiida)序列的相對豐度為 27.27%,環(huán)毛目(Choreotrichida)為12.88%。急游蟲目在全年的變化較為穩(wěn)定并且具有明顯的季節(jié)變化模式和站點差異。季節(jié)變化表現(xiàn)為秋冬＞春夏, 且在春夏季樣品中呈現(xiàn)A＞B＞C, 在秋冬季樣品B＞A＞C。環(huán)毛目在站點間無明顯差異, 而顯示出秋＞夏＞冬＞春的季節(jié)模式,春季相對豐度明顯降低。砂殼目在站點間差異顯示出A(4.34%)＞B(4.10%)＞C(2.23%), 且A 和B 站點砂殼目在夏秋兩季的相對豐度相近, 而在冬春兩季的相對豐度顯示出相反的變化模式。

寡毛類和砂殼類在科(family)級水平上的群落組成如圖 3c 所示, 寡毛類中相對豐度較高的有Strombidiidae_M (16.62%)、Strombidiidae (14.63%)、Strombidiidae_R (9.77%) 和Strobilidiidae_G (8.00%);砂殼類中相對豐度較高的是Tintinnida_X (7.59%)、Favellidae (2.53%) 和TIN_07 (2.32%)。

在屬階元上對寡毛類和砂殼類進(jìn)行進(jìn)一步劃分如圖 3 d, 寡毛類的相對豐度主要由急游蟲屬(St ro m b i d i u m, 1 9.0 1%)和急游蟲科未定類群(Strombidiidae_X, 12.24%)組成, 相對豐度顯示出先下降后上升的趨勢, 并在冬季達(dá)到最大值。砂殼類主要由砂殼目未定類群(Tintinnida_XX, 3.84%)、擬鈴蟲屬(Tintinnopsis, 3.27%)和網(wǎng)紋蟲屬(Favella, 1.32%)組成, 其相對豐度在春夏季達(dá)到最大值后下降, 冬季的相對豐度最低。

圖3 浮游纖毛蟲在綱(a)、目(b)階元上的相對豐度, 以及主要優(yōu)勢類群在科(c)、屬(d)階元上的相對豐度Fig.3 Relative sequence abundance of planktonic ciliates at class (a), order (b), family (c), and genus (d) level

站點間的物種組成存在明顯差異, 值得注意的是無論處于哪個分類階元, C 站點的夏季樣品在物種組成和相對豐度上均與其他分組樣品有明顯的不同,主要表現(xiàn)在總的物種多樣性低, 以及除寡毛類和砂殼類外的纖毛蟲相對豐度與其他樣品有明顯差別。在綱水平上, 旋毛綱相對豐度明顯降低, 而葉咽綱(Phyllopharyngea)、葉口綱(Litostomatea)、寡膜綱(Oligohymenophore)具有明顯高的相對豐度。在旋毛綱中, 管口目(Cyrtophoria)、前口目(Haptoria)、緣毛目(Peritrichia)的相對豐度明顯高于其他站點, 而CONThreeP_X、Tintinnida 和Strombidiida 明顯低于其他站點。A、B 站點物種組成的季節(jié)變化較為相似(圖3b), 不同之處主要在于A 站點的寡毛類纖毛蟲相對豐度在春季明顯大于B站點, 隨著季節(jié)推移二者差距減小, 直至秋季相對豐度相當(dāng)。冬季則呈現(xiàn)出B 站點的急游蟲目纖毛蟲相對豐度大于A 站點。而砂殼類纖毛蟲的相對豐度變化趨勢相反, 在春季B 站點大于A 站點, 隨后差距縮小, 直至冬季A 站點砂殼類纖毛蟲的相對豐度大于B 站點。

2.3 α 多樣性

計算54 個樣品的α 多樣性指數(shù), 并進(jìn)行站點和季節(jié)間的ANOVA 方差分析檢驗, 結(jié)果如表 1 所示,浮游纖毛蟲群落的豐富度和多樣性指數(shù)均未顯示出站點間和季節(jié)間差異(P＞0.05)。Chao 1 指數(shù)顯示出秋季＞春季＞冬季＞夏季的季節(jié)分布, 而除Chao 1 指數(shù)外的α 多樣性指數(shù)均顯示出夏季＞秋季＞春季＞冬季, 其中春秋兩季的α 多樣性指數(shù)均最為接近。

為了進(jìn)一步明確α 多樣性指數(shù)和環(huán)境因子之間的相關(guān)性, 我們進(jìn)行了Spearman 相關(guān)性分析, 結(jié)果如表2 所示。Chao 1 指數(shù)與總碳和總無機碳含量顯著正相關(guān)(R＞0,P＜0.05)。Richness 指數(shù)與所有環(huán)境因子均不呈現(xiàn)相關(guān)性。Shannon 指數(shù)和Simpson 指數(shù)均與鹽度呈現(xiàn)顯著相關(guān)關(guān)系(R＜0,P＜0.05)。

表 1 各季節(jié)和各站點的浮游纖毛蟲α-多樣性指數(shù)Tab.1 α-diversity of planktonic ciliates in different samples

表2 浮游纖毛蟲α 多樣性指數(shù)與環(huán)境因子的Spearman相關(guān)性分析Tab.2 Spearman’s correlation coefficients between α diversity indices and environmental factors

2.4 β 多樣性

基于Bray-Curtis 距離矩陣對分組后的浮游纖毛蟲群落進(jìn)行非度量多維尺度分析(non-metric multidimensional scaling, NMDS)。如圖4 所示, 每個季節(jié)的浮游纖毛蟲樣品聚合性良好且和其他季節(jié)樣品有明顯分離, 說明纖毛蟲群落具有季節(jié)性。秋冬兩季樣品有部分交叉并且和春夏季樣品顯著分開。而不同站點的樣品混合散亂排布且重疊明顯, 纖毛蟲群落未顯示出明顯的水平分布差異。

圖4 不同季節(jié)(a)和不同站點(b)的浮游纖毛蟲群落結(jié)構(gòu)的非度量多維尺度圖Fig.4 Nonmetric multidimensional scaling plots showing the community structure of planktonic ciliates in season (a) and in region (b)

對不同組間浮游纖毛蟲群落結(jié)構(gòu)差異性進(jìn)行ANOSIM 檢驗可知(表3), 不同站點的纖毛蟲群落結(jié)構(gòu)沒有顯著性差異(ANOSIM,P＞0.05)。而不同季節(jié)的纖毛蟲群落結(jié)構(gòu)差異顯著(ANOSIM,P＜0.01)。

表3 站點和季節(jié)變化對浮游纖毛蟲群落β-多樣性的ANOSIM 分析Tab.3 ANOSIM results on changes of plankton ciliates β-diversity in season and in region

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2.5 與環(huán)境因子間的相關(guān)關(guān)系

為了解影響浮游纖毛蟲群落多樣性差異的環(huán)境因子, 對12 個環(huán)境因子以及54 個樣品進(jìn)行了冗余分析(RDA), 結(jié)果如圖5 所示?？傆袡C碳和溶解氧是影響三山島近岸海域浮游纖毛蟲群落結(jié)構(gòu)的主要環(huán)境因子?？傆袡C碳含量與B 站點的部分樣品呈現(xiàn)正相關(guān)性; 與C 站點的夏秋季樣品的群落結(jié)構(gòu)呈現(xiàn)正相關(guān)性。溶解氧含量與A 站點樣品和B 站點絕大多數(shù)樣品的群落結(jié)構(gòu)呈現(xiàn)正相關(guān), 且總有機碳與溶解氧含量之間顯示出負(fù)相關(guān)關(guān)系。

圖5 浮游纖毛蟲群落與環(huán)境因子的冗余分析Fig.5 The redundancy analyses (RDA) plot showing correlations between ciliate communities and environmental factors

為了解纖毛蟲主要類群與環(huán)境因子的相關(guān)性,對屬(genus)階元下的無殼寡毛類和砂殼纖毛蟲與環(huán)境因子進(jìn)行了Spearman 相關(guān)性分析(表4), 與環(huán)境因子無相關(guān)關(guān)系的類群未呈現(xiàn)在表格中。結(jié)果顯示無殼寡毛類和砂殼類纖毛蟲與氨態(tài)氮和磷酸鹽均無相關(guān)性?？梢钥吹皆跓o殼寡毛類中相對序列豐度最高的Choreotrichida_XX 與鹽度(R＜0,P＜0.05)和碳含量(R＜0,P＜0.01)呈現(xiàn)顯著負(fù)相關(guān)關(guān)系;Leegaardiella與硅酸鹽呈顯著負(fù)相關(guān)(R＜0,P＜0.01)。砂殼類中相對序列豐度最高的Tintinnopsis與溫度(R＜0,P＜0.01)呈顯著負(fù)相關(guān), 而與溶解氧(R＞0,P＜0.01)、pH (R＞0,P＜0.05) 和硅酸鹽(R＞0,P＜0.01)呈顯著正相關(guān)關(guān)系。

2.6 形態(tài)學(xué)分類鑒定

對A、B 兩個站點的35 個拖網(wǎng)樣品進(jìn)行活體觀察和單細(xì)胞18S rRNA 基因測序, 累計分離鑒定17 種纖毛蟲(圖6; 表5), 分別隸屬于7 個屬: 擬鈴蟲屬(Tintinnopsis)、類鈴蟲屬(Codonellopsis)、網(wǎng)紋蟲屬(Favella) 、 真 鈴 蟲 屬(Eutintinnus) 、 前 口 蟲 屬(Frontonia) 、 櫛 毛 蟲 屬(Didinium) 、 旋 游 蟲 屬(Spirostrombidium), 有9 種已測序定種。其中砂殼類有13 種, 11 種屬于黏著殼, 僅有兩種透明殼物種。如表5 所示, 砂殼類不僅物種多樣性較高, 在檢獲頻率上也遠(yuǎn)大于其他類群。由于少數(shù)物種檢獲個數(shù)和頻次少, 未能獲得清晰的顯微照片或單細(xì)胞測序結(jié)果, 因此僅能夠鑒定到屬級階元或未能呈現(xiàn)。

表5 三山島近岸海域浮游纖毛蟲種名錄Tab.5 List of planktonic ciliates species in Sanshan Island

圖6 浮游纖毛蟲的活體顯微照片F(xiàn)ig. 6 Microscopic photograph of planktonic ciliates

與高通量測序結(jié)果相比, 形態(tài)學(xué)結(jié)果無論是α 多樣性還是β 多樣性均較低, 而砂殼類的季節(jié)變化趨勢在兩種方法的結(jié)果中較為一致。形態(tài)學(xué)結(jié)果顯示擬鈴蟲屬在春夏秋三季均大量出現(xiàn), 出現(xiàn)頻率約為纖毛蟲總檢獲頻次的69%, 其中主要在秋季大量檢獲。這與分子測序結(jié)果相似: 擬鈴蟲屬春夏秋三季的序列相對豐度占全年總豐度的80%, 春季的相對豐度最高。形態(tài)和分子結(jié)果均顯示透明殼種類僅在夏秋季高水溫時出現(xiàn)。另外, 站點間差異在兩種方法的結(jié)果中也顯示出一致性, 二者均顯示A 站點寡毛類和砂殼類多樣性大于B 站點。

3 討論

3.1 浮游纖毛蟲群落組成的時空變動

迄今為止在萊州灣進(jìn)行的浮游纖毛蟲生態(tài)研究很少, 僅有陳雪等人(2014, 2015)針對砂殼類纖毛蟲豐度的時空分布調(diào)查。本研究發(fā)現(xiàn)無殼寡毛類和砂殼類纖毛蟲是浮游纖毛蟲的優(yōu)勢類群, 均呈現(xiàn)明顯的季節(jié)變化。其中無殼寡毛類在秋冬季的序列相對豐度最高, 主導(dǎo)了冬季纖毛蟲的多樣性和相對豐度, 因此對季節(jié)模式具有較高的貢獻(xiàn)度。無殼寡毛類纖毛蟲在冬季的生存優(yōu)勢可能與它們的營養(yǎng)模式有關(guān)。研究發(fā)現(xiàn)有些纖毛蟲不僅可以進(jìn)行吞噬營養(yǎng), 還可以利用內(nèi)共生藻類或滯留葉綠體進(jìn)行光合營養(yǎng)(Bernardet al,1994; Pettigrossoet al, 2016), 據(jù)Stoecker 等人(2017)估計, 約30%～40%的寡毛類能夠進(jìn)行混合營養(yǎng)。光合作用可以為混合營養(yǎng)纖毛蟲提供大量的有機碳,因此相比于專性異養(yǎng)的纖毛蟲, 混合營養(yǎng)纖毛蟲能夠通過營養(yǎng)模式的轉(zhuǎn)變, 提高攝食效率、增加碳源,并降低對氧氣、營養(yǎng)鹽和食物濃度的依賴程度, 從而更好的適應(yīng)多變的環(huán)境(Estebanet al, 2010)。本研究發(fā)現(xiàn)冬季氨態(tài)氮含量顯著提高, 這種結(jié)果在一定程度上與Schoener (2013)的推測相符: 混合營養(yǎng)纖毛蟲能夠為藻類提供氨態(tài)氮, 而非與藻類競爭無機氮。因此推測大多數(shù)寡毛類纖毛蟲能夠降低冬季營養(yǎng)鹽變動和食物來源減少帶來的不利影響, 從而在冬季樣品中占據(jù)優(yōu)勢地位, 并能夠通過固碳和固氮效應(yīng)參與浮游生態(tài)系統(tǒng)的物質(zhì)循環(huán)。

在其他溫帶海灣, 如渤海灣(于瑩等, 2018, 2022)、Hiroshima 灣(Kamiyamaet al, 1996)、膠州灣(Chenet al, 2009; Jianget al, 2011; 于瑩等, 2011)、桑溝灣(于瑩等, 2013)等的周年調(diào)查與本研究中利用HTS 得到的結(jié)果呈現(xiàn)較高的一致性: 砂殼類纖毛蟲的豐度和物種組成呈現(xiàn)明顯的季節(jié)變化, 且在春夏季達(dá)到峰值。另外, 本研究通過鏡檢觀察發(fā)現(xiàn)大多為黏著殼類物種, 少數(shù)為透明殼物種, 這可能與近岸海水渾濁度高有關(guān)(Dolanet al, 2013)。

在C 站點的夏季樣品中, 不僅物種多樣性低而且相對豐度與其他兩站點顯著不同。其中旋毛綱(Spirotrichea) 相對豐度全年最低, 而寡膜綱(Oligohymenophorea)、葉口綱(Litostomatea)和葉咽綱(Phyllopharyngea)的相對豐度顯著高于其他兩站點。對環(huán)境因子的全年監(jiān)測顯示C 站點的氮磷元素濃度在夏季出現(xiàn)驟降, 推測氮磷等營養(yǎng)鹽含量能夠影響浮游纖毛蟲的物種組成和優(yōu)勢種的相對豐度。

無論是對浮游纖毛蟲種群的α 多樣性分析還是群落的β 多樣性分析均未顯示出站點間差異, 原因可能是站點設(shè)置距離太近。然而在群落組成上, 砂殼目在A 站點的相對豐度最高。浮游纖毛蟲的空間分布同樣會受到環(huán)境因子的驅(qū)動(Yanget al,2020), 本研究中溶解氧含量可能是A 站點浮游纖毛蟲群落的重要控制因素, 前人研究也顯示出溶解氧對浮游纖毛蟲總生物量的影響(Zhanget al,2015)。Capriulo 等(1982)的研究表明在近岸和上升流區(qū)域, 水體擾動能夠使一部分沉降的砂殼類克服重力影響而分散在表層水體中。另外, 不同水團也會對近岸浮游纖毛蟲群落生態(tài)特性的顯著影響(Guet al, 2021)。因此我們推測由于A 站點位于碼頭, 船只靠岸和海浪沖擊導(dǎo)致的水體擾動會明顯影響近岸環(huán)境中砂殼類纖毛蟲的水平分布模式。

除環(huán)境因子對浮游纖毛蟲群落結(jié)構(gòu)產(chǎn)生直接影響外, 生物間相互作用(捕食、寄生、共生等) (Dhibet al, 2013; Elloumiet al, 2014; Fuet al, 2020)或與環(huán)境因子的疊加效應(yīng)能夠共同作用于纖毛蟲群落(Huanget al, 2021), 從而產(chǎn)生一定的時空分布模式。

3.2 傳統(tǒng)形態(tài)學(xué)與分子生態(tài)學(xué)方法相結(jié)合

在以往對于萊州灣纖毛蟲的研究中, 大多利用傳統(tǒng)形態(tài)學(xué)的方法對特定類群進(jìn)行的豐度和生物量調(diào)查。傳統(tǒng)的鏡檢方法較為費時費力, 且鏡檢樣品的體積受到時間和精力的限制(約50 mL), 往往體型較大物種(＞40 μm)容易被檢獲并鑒定到種水平, 并且鑒定過程需要觀察者具備一定的分類學(xué)基礎(chǔ)和經(jīng)驗。與傳統(tǒng)形態(tài)學(xué)研究方法相比, 基于基因測序的生態(tài)調(diào)查能夠揭示更高的生物多樣性(隱性種), 目前對18S V4 區(qū)進(jìn)行高通量測序已經(jīng)廣泛應(yīng)用于真核微生物的生態(tài)調(diào)查中(Majanevaet al, 2018; Gran-Stadnicze?koet al, 2019; Sunet al, 2019)。

本研究使用高通量測序和顯微鏡檢方法所揭示的季節(jié)變動和群落組成基本一致, 且砂殼類纖毛蟲群落的β 多樣性并未受到兩種方法樣本量不同的影響, 這與之前利用兩種方法的調(diào)查研究相似(Santoferraraet al, 2016)。另外, 高通量測序結(jié)果顯示全年寡毛類(40.14%)與砂殼類(10.67%)相對豐度的比例大致為4∶1, 這與膠州灣的調(diào)查結(jié)果十分接近(寡毛類占總纖毛蟲豐度的59.91%, 砂殼類占21.81%)(Jianget al, 2011), 可能暗示了溫帶海灣浮游纖毛蟲群落具有相似的群落組成模式。

對兩種方法得到的結(jié)果進(jìn)行比較, 我們發(fā)現(xiàn)砂殼類序列的相對豐度較低(10.67%), 而鏡檢中的出現(xiàn)頻率遠(yuǎn)高于寡毛類, 導(dǎo)致這種差異可能的原因主要有: (1) 拖網(wǎng)采樣對較小個體的遺漏以及皮膜脆弱個體的損壞; (2) 分類學(xué)經(jīng)驗不足, 對體型小于40 μm個體的忽略; (3) 高通量測序僅能得到相對豐度數(shù)據(jù),由于類群間rRNA 基因拷貝數(shù)的差異(寡毛類的rRNA基因拷貝數(shù)可能較高), 從而放大了某些物種的相對豐度(Medingeret al., 2010)。

另外, 我們對物種的分類注釋結(jié)果中顯示出大量未知種序列, 如寡毛類中相對豐度最高的Choreotrichida_XX 和砂殼類中的Tintinnida_XX, 由于參考序列數(shù)據(jù)庫中基于形態(tài)鑒定的寡毛類和砂殼類的序列較少, 數(shù)據(jù)庫不完善, 因此可能會導(dǎo)致OTU 分配出現(xiàn)錯誤, 降低了分類的廣度和質(zhì)量。另外,高通量測序不能區(qū)分活體和胞囊信息, 因此會大大高估環(huán)境中纖毛蟲多樣性。同時結(jié)合高通量測序和顯微鏡檢的研究顯示, 砂殼類纖毛蟲群落的β 多樣性并未受到兩種方法樣本量不同的影響(Santoferraraet al,2016), 但由于OTU 信息很可能無法完全對應(yīng)形態(tài)學(xué)鑒定的物種(Santoferraraet al, 2020), 該結(jié)果僅適用于對纖毛蟲群落整體的研究, 而不針對某一類群。

目前我們?nèi)云惹行枰h(huán)境中的OTU 數(shù)據(jù)來補充纖毛蟲生物多樣性信息(Warrenet al, 2017), 但由于分子測序方法具有一定的局限性, 例如僅能獲得物種相對豐度數(shù)據(jù)、難以確定獲得的多樣性是真實存在的還是被人為放大, 同時測序結(jié)果也會受到測序過程和數(shù)據(jù)處理方法的影響, 因此應(yīng)該與形態(tài)學(xué)方法結(jié)合使用、相互補充。未來應(yīng)利用形態(tài)學(xué)方法補充完善數(shù)據(jù)庫中參考序列信息, 連接基因種和形態(tài)種, 以實現(xiàn)更精確的分類識別。另外由于該海域相關(guān)研究的欠缺, 未來也需要進(jìn)行長時間尺度和更大范圍的重復(fù)采樣, 以獲得較為全面的纖毛蟲多樣性和分布信息, 并通過一定程度的標(biāo)準(zhǔn)化來連接形態(tài)學(xué)和高通量測序結(jié)果。

4 結(jié)論

本研究首次利用傳統(tǒng)形態(tài)學(xué)和分子生態(tài)學(xué)方法相結(jié)合的手段, 對萊州灣三山島近岸海域浮游纖毛蟲進(jìn)行周年生態(tài)調(diào)查。高通量測序結(jié)果顯示無殼的寡毛類和有殼的砂殼類是浮游纖毛蟲的主要優(yōu)勢類群,且具有顯著的季節(jié)變化模式。寡毛類占總纖毛蟲序列的40.14%, 在冬季多樣性最高, 其中主要優(yōu)勢類群是急游蟲(Strombidium)。砂殼類相對豐度為10.67%,并在春夏季出現(xiàn)峰值。A 站點(碼頭)黏著殼砂殼類的相對豐度明顯多于其他站點, 推測水體擾動會影響近岸環(huán)境中砂殼類纖毛蟲的物種組成和水平分布模式。然而站點間水平分布差異不顯著, 原因可能是站點設(shè)置距離過近導(dǎo)致的。C 站點(養(yǎng)殖廠排水口)夏季樣品中寡毛類和砂殼類纖毛蟲多樣性和相對豐度均低于其他站點, 可能的原因是養(yǎng)殖廠排放的低溶氧尾水會對浮游纖毛蟲的群落結(jié)構(gòu)產(chǎn)生影響。在全年12 個環(huán)境因子中, 總有機碳和溶解氧含量是驅(qū)動浮游纖毛蟲群落結(jié)構(gòu)變化的主要環(huán)境因子。通過傳統(tǒng)形態(tài)方法共檢獲17 種纖毛蟲, 分別隸屬于7 個屬, 多數(shù)為砂殼類, 其中擬鈴蟲屬(Tintinnopsis)檢獲次數(shù)最高。本研究主要基于相對豐度數(shù)據(jù), 因此某些類群的相對豐度可能會受到其他分類單元絕對豐度變化的影響。目前高通量測序和顯微鏡檢兩種方法均有不足,需要結(jié)合使用以獲得更為全面的環(huán)境生態(tài)信息。