李建兵,包衛(wèi)東

(1.甘肅省小隴山林業(yè)調(diào)查規(guī)劃院,甘肅 天水 741020；2.甘肅省小隴山林業(yè)實(shí)驗(yàn)局 ,甘肅 天水 741020)

七葉樹(shù)(學(xué)名：AeculuschinensisEunge)，為甘肅省珍稀頻危省級(jí)保護(hù)樹(shù)種之一，在中國(guó)秦嶺西段的小隴山林業(yè)實(shí)驗(yàn)局林區(qū)多有分布。七葉樹(shù)是著名觀賞樹(shù)種，同時(shí)，還具有藥用及經(jīng)濟(jì)價(jià)值，可供小工藝品及家具等用材。通過(guò)運(yùn)用組織培養(yǎng)快繁技術(shù)，使其不僅具有遺傳性狀相對(duì)穩(wěn)定、增殖快、繁殖系數(shù)高、產(chǎn)量高、品質(zhì)好、生產(chǎn)周期短等特點(diǎn)，而且受氣候、季節(jié)影響小，便于操作，可節(jié)省大量人力物力。筆者參與了七葉樹(shù)組織培養(yǎng)工作，并對(duì)該技術(shù)進(jìn)行了初步研究，歸納總結(jié)了一些成熟的做法和結(jié)論，以便在生產(chǎn)實(shí)踐中予以推廣應(yīng)用。

1 實(shí)驗(yàn)原理

通過(guò)對(duì)莖尖材料的無(wú)菌培養(yǎng)，研究器官分化和在離土培養(yǎng)條件下培養(yǎng)材料(外植體)的生長(zhǎng)發(fā)育規(guī)律，以及影響這些過(guò)程的各種因素。

2 實(shí)驗(yàn)設(shè)施

2.1 無(wú)菌操作室

無(wú)菌操作裝置是接種箱(超凈工作臺(tái))，內(nèi)附空氣過(guò)濾系統(tǒng)、光照系統(tǒng)、紫外燈。

2.2 培養(yǎng)室

七葉樹(shù)組織和細(xì)胞培養(yǎng)室里，需要具有照明和控溫設(shè)備，為七葉樹(shù)外植體生長(zhǎng)及發(fā)育提供所需要的環(huán)境，比如溫度、濕度、光照、通風(fēng)等。一般要求溫度在25±1℃之間。光源一般采用白色熒光燈或自然光線，每天光照約16h，光強(qiáng)為200001x左右。還需要配備有常用的培養(yǎng)架，用于固體培養(yǎng)。

2.3 組織培養(yǎng)所需的各種用具

(1)三角瓶或燒杯(100ml，250ml，500ml，1L)；(2)玻璃攪拌棒；(3)冰箱；(4)空調(diào)；(5)牛角勺；(6)剪刀；(7)器械架；(8)純水水桶；(9)量簡(jiǎn)(25lm，50ml，100ml，1L)；(10)容量瓶(100ml，500ml，1L)；(11)刻度移液管(1kl，2ml，5ml，10ml)；(12)藥物天平；(13)磨砂口玻璃瓶； 用來(lái)對(duì)植物材料進(jìn)行表面滅菌。(14)酒精燈；(15)無(wú)菌濾紙 ；(16)高壓滅菌鍋或家用樂(lè)力鍋；(17)可調(diào)式電爐；(18)酸度計(jì)；(19)鑷子；(20)解剖刀；(21)培養(yǎng)皿；(22)錐形瓶；(23)室內(nèi)小推車(chē)。

2.4 器皿和器械消毒

為了能夠徹底滅菌，將七葉樹(shù)玻璃培養(yǎng)器皿和培養(yǎng)基分開(kāi)進(jìn)行，先對(duì)培養(yǎng)容器用高壓蒸汽滅菌法消毒，再對(duì)培養(yǎng)基用常規(guī)法滅菌，也可將它們置于烘箱中在160℃～80℃下干熱處理3h。無(wú)菌操作中使用的各種器械都必須進(jìn)行消毒，方法是：將它們依次放在95%酒精中浸一下，然后放置在火焰上灼燒，待冷卻后使用，操作期間還要消毒幾次。

3 實(shí)驗(yàn)過(guò)程

3.1 實(shí)驗(yàn)材料的準(zhǔn)備

3.1.1 培養(yǎng)基的配制

采用MS(Murashige和Skoog, 1962)培養(yǎng)基。

3.1.2 培養(yǎng)基成分

實(shí)驗(yàn)中，七葉樹(shù)組織培養(yǎng)采用的是MS培養(yǎng)基，培養(yǎng)基的pH值要求在5.8-6.0范圍內(nèi)。

3.1.3 培養(yǎng)基母液裝瓶及滅菌

培養(yǎng)基母液配制好后，分別按規(guī)定吸取量吸取，加入瓊脂、蔗糖混成1∶1溶液煮成培養(yǎng)基，然后進(jìn)行分裝入瓶.入瓶后要立刻用封口膜將容器口處理好，以確保不變干，不被污染。已經(jīng)封裝好的培養(yǎng)基放入高壓鍋中進(jìn)行高溫滅菌，溫度控制在130～135℃之間，保持10min即可。

3.1.4 培養(yǎng)基的保存

經(jīng)過(guò)3天預(yù)培養(yǎng)的七葉樹(shù)培養(yǎng)基，滅菌完畢后，放置于防塵、避光、恒溫處。

3.1.5 外植體處理

培養(yǎng)材料的采集,選用當(dāng)年生嫩枝作為外植體(植物器官)。將采收下來(lái)的外植體先置于燒杯中，用流動(dòng)的自來(lái)水沖洗20～60min，再用無(wú)菌水漂洗1～3次。把沖洗好的外植體放在磨砂口的玻璃瓶中,傾入70%(濃度)的乙醇沒(méi)過(guò)外植體，并輕晃以除去附著物，經(jīng)過(guò)10～20s將乙醇倒去,用無(wú)菌水沖洗。接下來(lái)再用配制好一定濃度的氯化汞溶液泡外植體5～10min。將消毒水倒出再注入無(wú)菌水，搖動(dòng)數(shù)次后倒出，重復(fù)3次。滅菌后，將外植體從瓶中取出放于滅菌過(guò)的過(guò)濾紙上，把材料上的水吸掉等待接種。

3.2 操作步驟

3.2.1 接種操作

1)接種前器械必須進(jìn)行消毒，方法是先用水洗凈，再用牛皮紙包裹好放入高壓鍋內(nèi)進(jìn)行40～60分鐘的滅菌。在進(jìn)行接種時(shí)，先用70%酒精進(jìn)行表面消毒，再用火灼燒、冷卻。超凈工作臺(tái)應(yīng)先用70%的酒精擦拭一遍，再用紫外燈照射20min。接種工作人員必須穿消過(guò)毒的工作服，戴消過(guò)毒的口罩，進(jìn)入工作臺(tái)前手要用70%酒精進(jìn)行消毒。

2)接種時(shí)左手拿起三角瓶，右手輕輕取下封口膜，動(dòng)作要慢，以免氣流沖入瓶中造成污染。將三角瓶的口靠近酒精燈火焰上燎數(shù)下，將灰塵物等固定在原處，然后用鑷子將外植體送入瓶中插在培養(yǎng)基上，將鑷子放入消毒酒精中，再把封口膜在火焰上旋轉(zhuǎn)灼燒一下，封上口，做好標(biāo)記，材料接種完畢。

3)接種后3-7天內(nèi)要每天檢查，主要是看有無(wú)污染情況發(fā)生，細(xì)胞觀察每隔3-5天看一次并記錄結(jié)果。

3.2.2 初代培養(yǎng)

經(jīng)過(guò)3-10天的培養(yǎng)，管苗會(huì)生出少量不定芽，發(fā)現(xiàn)后要做詳細(xì)記錄。同時(shí)適量添加一些營(yíng)養(yǎng)元素，以提高出芽率。

3.2.3 繼代培養(yǎng)

經(jīng)過(guò)2-6周左右，可分化出大量的不定芽。當(dāng)觀察到七葉樹(shù)外植體上的嫩莖長(zhǎng)到一定高度時(shí)，就可以切割并轉(zhuǎn)接到生根培養(yǎng)基上，進(jìn)行生根誘導(dǎo)了。

3.2.4 試管苗出瓶

在生根培養(yǎng)基的誘導(dǎo)下嫩莖長(zhǎng)出可進(jìn)行移栽的根系，即可進(jìn)行出瓶了。在七葉樹(shù)試管苗出瓶之前，最好進(jìn)行一些適應(yīng)性處理，具體包括透氣鍛煉和脫去基質(zhì)兩個(gè)方面：

1)透氣鍛煉。把試管苗移放到要進(jìn)行移栽的地方，以便適應(yīng)外界的變化，隨后把瓶口上的封口膜逐次打開(kāi)，進(jìn)行通風(fēng)處理，使其適應(yīng)生長(zhǎng)地空氣環(huán)境，使植株的成活率生長(zhǎng)狀況保持穩(wěn)定。

2)脫去基質(zhì)。管苗在移前還要把根系上粘著的培養(yǎng)基和水沖凈，以免因感染細(xì)菌而導(dǎo)致根系發(fā)育受到影響，最后就可以將管苗移栽到經(jīng)過(guò)滅菌處理的珍珠巖上或蛭石等基質(zhì)中。

3.2.5 試管苗移栽

實(shí)驗(yàn)證明，用七葉樹(shù)組培法繁育的幼苗不同于大田苗，必須經(jīng)歷一個(gè)煉苗的過(guò)渡期，才能適應(yīng)外界環(huán)境，也才能更好地生長(zhǎng)。

1)煉苗處理措施:通過(guò)控水、減肥、爭(zhēng)光、降溫等措施。

2)試管苗的煉苗技術(shù)：為了提高七葉樹(shù)組培苗的成活率和保存率，必須采取煉苗措施。具體包括以下三個(gè)方面：對(duì)于準(zhǔn)備移栽的試管苗在培養(yǎng)基中加入矮狀素；并在移植前把試管苗放在室內(nèi)高臺(tái)處散射光強(qiáng)的地方；使幼苗經(jīng)過(guò)5天的鍛煉后再移栽。

4 結(jié)論與注意事項(xiàng)

對(duì)七葉樹(shù)苗木進(jìn)行組織和細(xì)胞培養(yǎng)是可行的，小隴山林區(qū)可以進(jìn)行該技術(shù)的推廣應(yīng)用。在實(shí)驗(yàn)與應(yīng)用過(guò)程中應(yīng)注意以下事項(xiàng)：

1)對(duì)一個(gè)樹(shù)種進(jìn)行組培快速繁殖，是一個(gè)非常精密的系統(tǒng)工程，必須環(huán)環(huán)相扣。

2)在研究過(guò)程中必須嚴(yán)格執(zhí)行相關(guān)技術(shù)規(guī)定和技術(shù)標(biāo)準(zhǔn)要求。

3)應(yīng)按部就班進(jìn)行。