高 鵬，霍俊明，郭寶瑞，于寶利，吳 際，王軍成，馬 輝，孫 濤，張 靜

750004 銀川，寧夏醫(yī)科大學總醫(yī)院：神經(jīng)外科1，外科學研究室8；750004 銀川，寧夏醫(yī)科大學：顱腦疾病重點實驗室2，生育力保持教育部重點實驗室6；014010 內蒙古 包頭，內蒙古科技大學包頭醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院心血管外科3；215400 江蘇 太倉，依科賽生物科技(太倉)有限公司4；200030 上海，上海交通大學Bio-X研究院遺傳發(fā)育與精神神經(jīng)疾病教育部重點實驗室5；750002 銀川，寧夏回族自治區(qū)人民醫(yī)院神經(jīng)外科7

ALG13(UDP-N-acetylglucosaminyl transferase subunit)是X連鎖的基因，編碼ALG13蛋白，其與ALG14形成尿苷二磷酸-N-乙酰葡萄糖胺轉移酶(UDP-N-acetylglucosamine transferase)催化N連接的糖基化[1]。ALG13蛋白天冬酰胺N連接糖基化是蛋白質修飾中最常見和普遍的形式，糖基化過程的紊亂會引發(fā)多種疾病[2-3]。2012 年，研究人員首次發(fā)現(xiàn)一名患有ALG13缺乏癥的男孩，該男孩具有的c.280A>G突變導致其出現(xiàn)耐藥性癲癇發(fā)作、小頭畸形、眼球震顫、雙側視神經(jīng)萎縮、錐體外系體征、肝腫大、水腫和出血傾向，并在1 歲時死亡[4]。之后，一系列對嬰兒痙攣癥、Lennox-Gastaut 綜合征、West 綜合征等伴發(fā)嚴重癲癇和智力障礙疾病患者的篩查發(fā)現(xiàn)ALG13中的新生突變(如：c.320A>G)與疾病的發(fā)生發(fā)展密切相關[5-7]。因此，X 連鎖ALG13基因變異可能是癲癇性腦病的潛在原因。

癲癇是一種以腦神經(jīng)元過度異常放電且反復發(fā)作為特征的異質性疾病。雖然許多病理生理的變化會影響癲癇易感性，但研究表明遺傳是癲癇疾病發(fā)生發(fā)展的重要因素[8]。與癲癇癥狀相關的基因突變可能會使配體或電壓門控離子通道異常，其中已廣泛研究確認的癲癇易感基因SCN1A——編碼 Nav 1.1 鈉通道的 α 亞基，該基因的異常表達導致嚴重的遺傳性癲癇綜合征[9-10]。糖基化是維持鈉通道生物合成和降解的正常穩(wěn)態(tài)的必要過程，ALG13突變造成的糖基化紊亂可能會使鈉通道結構和功能異常，進而導致癲癇的發(fā)生。

小鼠癲癇模型可分為誘發(fā)性癲癇模型和遺傳性癲癇模型。誘發(fā)性癲癇模型是通過化學、電或聲刺激導致急性或慢性癲癇發(fā)作；遺傳性癲癇模型則通過遺傳病變(或自發(fā)突變)導致自發(fā)性癲癇發(fā)作，更能有效反映某種特異性的癲癇。目前，Alg13基因缺陷型致癇小鼠模型尚未見報道。因此，本研究對Alg13基因敲除小鼠進行了繁育和鑒定，并對其方法學進行探討和優(yōu)化，確保該模型能夠成為Alg13缺陷所致癲癇研究的良好動物模型。圍繞 ALG13活性水平，開展其在癲癇中的作用及機制研究，可能為理解癲癇的發(fā)病和治療提供一個新的視角。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 C57BL/6J背景的Alg13KO小鼠由于寶利博士友情惠贈[11]。本實驗選用4周齡Alg13KO小鼠12只(雌雄各6只；體質量6～7 g)，野生型(wildtype, WT)小鼠12只(雌雄各6只；體質量7～8 g)，8周齡Alg13KO雄性小鼠18只(體質量21～23 g)，WT雄性小鼠18只(體質量22～24 g)，分為Alg13KO組和WT組。本實驗遵循寧夏醫(yī)科大學實驗動物管理和使用委員會的規(guī)定[SCXK(Ning)2015-0001]。

1.1.2 試劑與儀器

1.1.2.1 主要實驗試劑 本實驗采用的主要實驗試劑有：瓊脂糖(美國Pharmacia 公司)，DNA提取試劑盒(北京天根生化科技有限公司)，DNA產(chǎn)物純化試劑盒(北京天根生化科技有限公司)，TaqDNA聚合酶(美國Promega公司)，T4 連接酶(美國賽默飛有限公司)，T4連接酶緩沖液(美國賽默飛有限公司)，pCRTM4-TOPO? TA載體(美國賽默飛有限公司)，異丙基-β-D-硫代半乳糖苷(isopropyl-β-D-thiogalactoside, IPTG)和5-溴-4-氯-3-吲哚基-β-D-半乳糖苷(5-bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-galactoside，X-gal)(北京索萊寶科技有限公司)，免疫組化染色試劑盒(北京中杉金橋生物技術有限公司)，ALG13抗體(武漢三鷹生物技術有限公司)，SCN1A抗體(美國Abcam公司)，SDS-PAGE凝膠快速配制試劑盒(碧云天生物技術有限公司)，全蛋白提取試劑盒(南京凱基生物科技發(fā)展有限公司)，BCA蛋白濃度測定試劑盒(南京凱基生物科技發(fā)展有限公司)，蛋白Marker(美國賽默飛有限公司)，ECL發(fā)光液(美國賽默飛有限公司)，山羊血清封閉液(北京中杉金橋生物技術有限公司)。

1.1.2.2 主要儀器設備 分光光度計(美國賽默飛有限公司)，ABI基因擴增儀(美國應用生物系統(tǒng)公司)，BIO-RAD Gel Doc XR+凝膠成像系統(tǒng)(美國伯樂公司)，DYY-7C電泳儀(北京市六一儀器廠)，Lecia RM2265石蠟切片機(德國Lecia公司)，Leica DM6正置雙目生物顯微鏡(德國Lecia公司)。

1.2 方法

1.2.1Alg13基因敲除小鼠的飼養(yǎng) 將動物飼養(yǎng)在寧夏醫(yī)科大學SPF級實驗動物中心獨立通氣籠盒(individually ventilated cages, IVC)設備系統(tǒng)中，維持在具有恒定室溫(24±0.5)℃，相對濕度50%～60%，自由飲用食物和水，12 h/12 h光/暗循環(huán)中，每籠飼養(yǎng)動物數(shù)量不超過14只。使用SPF級大小鼠繁殖飼料、高壓滅菌墊料及超純水，每日為鼠籠補充飼料及飲水，每周更換墊料2次，每2周更換水瓶1次。

1.2.2Alg13基因敲除小鼠的繁育 先將Alg13KO的雄性純合子(Alg13X-Y)與雌性雜合子(Alg13X+X-)按1∶2合籠，繁育出子代小鼠后進行基因型鑒定，挑選出WT雄鼠(X+Y)、雌鼠(X+X+)、KO雄鼠(X-Y)和雌鼠(X-X-)，分別對WT和KO小鼠進行繁育，每籠雌鼠生育3代后停止此籠繁育，選用其子代小鼠重新合籠繁育。

1.2.3Alg13基因敲除小鼠的鑒定

1.2.3.1 小鼠尾部DNA的提取及PCR擴增反應 待子鼠4周齡時，剪取小鼠尾部組織加入490 μL的裂解緩沖液和10 μL 蛋白酶K，60 ℃ 水浴過夜。使用DNA提取試劑盒，按照試劑說明書提取小鼠基因組DNA，應用分光光度計測定其濃度。引物序列按照Alg13的第4外顯子序列設計正、反向引物，正向：5′-CAAATGGGTAACAGGC-3′；反向：5′-GGGTAGAAAA-GGATGG-3′。對于每個樣品，反應體系為：5 μL正、反向引物，12 μL無核酸酶水，25 μL Q5聚合酶和8 μL(60 ng/μL)DNA。在ABI PCR基因擴增儀上設置反應條件：98 ℃下保持30 s后(預變性)，進行35個PCR循環(huán)[98 ℃10 s(變性)，56 ℃ 30 s(退火)，72 ℃ 2 min(延伸)]，然后在72 ℃ 2 min(延伸)后終止反應。

1.2.3.2 瓊脂糖電泳法 取PCR擴增產(chǎn)物5 μL加入1 μL的6×DNA 上樣緩沖液在2%瓊脂糖凝膠中以90 V由負極向正級電泳30 min，使用100 bp的DNA Ladder作為DNA標記。于化學發(fā)光凝膠成像系統(tǒng)中觀察結果，并將得到的PCR產(chǎn)物進行測序，從而獲得基因型結果。

1.2.3.3 TA克隆法 PCR產(chǎn)物在瓊脂糖凝膠電泳后，紫外燈下切除目的條帶周邊多余凝膠，對DNA進行純化。將20 μL純化產(chǎn)物加入含有1 μLTaq聚合酶，1 μL dATP和8 μL ddH2O的反應體系中，在72 ℃的水浴中孵育30 min。將1 μL T4連接酶，1 μL T4連接酶緩沖液，5 μL已加過‘dA’的純化DNA，2 μL ddH2O，1 μL pCRTM4-TOPO?TA 載體共同加入體積為200 μL無酶管中，于16 ℃的水浴中過夜連接。上述克隆溶液取5 μL加入到含有50 μL感受態(tài)細胞懸浮液的1.5 mL無菌EP管中，混勻后置于冰浴中30 min。隨后將500 μL LB培養(yǎng)基加入EP管中并在37 ℃恒溫搖床下振蕩1 h，將振蕩好的菌液進行短暫的離心，棄去300 μL上清液，涂抹在含有IPTG和X-gal以及氨芐青霉素的固體培養(yǎng)基上，在37 ℃的恒溫培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)14 h。觀察培養(yǎng)基中藍色與白色菌落形成數(shù)量與密度，從菌落中選取20個白色菌落，分別放入20個含有氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基中，將搖菌管放于37 ℃恒溫搖床中培養(yǎng)16 h；提取質粒并進行DNA測序。

1.2.4Alg13基因敲除小鼠的ALG13蛋白表達檢測

1.2.4.1 免疫組化分析 小鼠腹腔注射1%戊巴比妥鈉麻醉，經(jīng)心臟灌注并用4%多聚甲醛進行快速固定。斷頭后迅速取出腦，4%多聚甲醛固定，經(jīng)梯度濃度酒精中逐級脫水，二甲苯透明處理后將腦組織浸蠟包埋，使用石蠟切片機切片。將石蠟切片放入二甲苯脫蠟、梯度酒精中水化后，用5%正常山羊血清封閉1 h，然后在4 ℃下與兔抗ALG13抗體(1∶300)孵育過夜。洗滌后將切片與生物素化的山羊抗兔IgG在室溫下孵育1 h。DAB顯色，顯微鏡下觀察組織的顯色情況，發(fā)現(xiàn)有棕黃色陽性表達可用自來水終止反應。蘇木精染色、1%的鹽酸酒精分化、梯度酒精脫水、二甲苯透明處理，中性樹膠封片后置于顯微鏡下進行拍照，組織切片以出現(xiàn)棕黃色或褐色顆?？烧J為是陽性表達。應用Image-Pro Plus 6.0軟件，計算其平均光密度(IOD/area)。

1.2.4.2 Western blot分析 處死小鼠取腦后，分離出約50 mg海馬、大腦皮質和小腦，提取蛋白并測定樣本蛋白質濃度。電泳時的參數(shù)設置為：濃縮膠(80 V，30 min)，分離膠(100 V，90 min)。將含有目的蛋白的分離膠塊在低溫環(huán)境下300 mA轉膜1 h。經(jīng)過5%的封閉液封閉1 h后，加入一抗并于4 ℃冰箱過夜孵育。洗膜3次后，與二抗孵育1 h。采用ECL發(fā)光法得到X線片用Bio-Rad凝膠成像系統(tǒng)進行拍照，應用Image J軟件測定目的蛋白的表達情況。

1.2.5 小鼠顱骨外植入視頻腦電圖(video-electroencephalography, VEEG)設備和腦電記錄 小鼠腹腔注射1%戊巴比妥鈉麻醉后置于立體定位框架上，備皮處用酒精消毒并沿中線用手術刀切開暴露頭骨。以前囟為原點，前囟向后 1.5 mm，正中線左右旁開 2 mm，將自制電極固定顱骨，置于左額葉皮層的電極為參考電極，右頂葉的電極為記錄電極，用牙科水泥進行固定，待麻醉恢復后將小鼠單籠飼養(yǎng)。1周后將記錄系統(tǒng)與小鼠頭部的電極連接，將視頻監(jiān)測和腦電記錄同步，以便同時監(jiān)測小鼠的行為學改變。設置好參數(shù)，待系統(tǒng)穩(wěn)定后開始記錄，每次記錄24 h，連續(xù)記錄14 d。SleepSign 信號采集系統(tǒng)記錄小鼠皮層腦電活動，并用 SleepSign和Matlab對腦電信號傅里葉轉換及頻譜分析。

1.2.6 癲癇發(fā)作嚴重程度評價 小鼠的癲癇發(fā)作情況依據(jù)Racine評分來進行評估和分類，0級：正常行為，無癲癇發(fā)作；1級：口腔和面部運動，表現(xiàn)為面部抽動，包括眨眼和胡須抖動；2級：頸部肌肉痙攣或出現(xiàn)有節(jié)律性的點頭或者甩頭；3級：出現(xiàn)單側前肢陣攣或雙側前肢陣攣；4級：雙側前肢陣攣伴雙后肢站立；5級：全面性的強直陣攣發(fā)作伴失去平衡摔倒。

1.3 統(tǒng)計學分析

2 結果

2.1 Alg13 KO小鼠的外形及基因型的鑒定

C57BL/6遺傳背景的Alg13KO小鼠成年為黑色，與野生型無差異。繁殖小鼠交配后的子代新生仔鼠與野生型仔鼠外觀形態(tài)無顯著性差異。Alg13KO小鼠通常表現(xiàn)出發(fā)育遲緩，但存活下來的Alg13KO小鼠在成年時與WT小鼠體型接近(表1)。

表1 WT組和Alg13 KO組小鼠出生后體質量比較

通過PCR擴增含有“TTCAT”的DNA片段，由于“TTCAT”序列的刪除，X+Y和X+X+小鼠預期的PCR產(chǎn)物為545 bp，而X-Y和X-X-小鼠預期的PCR產(chǎn)物為異常的540 bp，對于雜合X+X-小鼠，存在540 bp和545 bp兩種產(chǎn)物(圖1A)。因瓊脂糖凝膠電泳產(chǎn)生兩個條帶難以區(qū)分，故對小鼠PCR產(chǎn)物進行了DNA測序。結果顯示Alg13KO小鼠中存在“TTCAT”缺失，但WT小鼠中保留了“TTCAT”，雜合小鼠在“TTCAT”缺失位置顯示出雙色重疊峰(圖1B)。為了得到量大而且序列單一準確的目的片段，對PCR產(chǎn)物進行TA克隆和藍白斑篩選，含有重組DNA的靶向載體(圖1C)轉化的細胞產(chǎn)生白色菌落，非重組質粒轉化的細胞會長成藍色菌落(圖1D)。取白色菌落測序分析顯示W(wǎng)T小鼠序列的341至345位含有“ATGAA”5個堿基，即對應目的基因上序列的225～229位“TTCAT”，Alg13KO小鼠缺少這5個堿基，而雜合型則含有兩種類型的序列(圖1E、F)。以上結果表明本研究保證了Alg13基因敲除小鼠的種群延續(xù)和遺傳穩(wěn)定性。

A: WT、Alg13 KO和雜合子小鼠PCR產(chǎn)物的2%瓊脂糖凝膠電泳分離結果 WT小鼠顯示545 bp的片段，Alg13 KO小鼠顯示540 bp的片段，雜合子小鼠顯示540 bp和545 bp兩種片段 M：示DNA標記物；B：正向引物和反向引物擴增WT、Alg13 KO和雜合子小鼠PCR產(chǎn)物的DNA測序結果 紅色實線矩形：示“TTCAT”，藍色虛線矩形：示敲除的“TTCAT”；C：目的基因靶向載體結構示意圖；D：WT、Alg13 KO和雜合子小鼠目的基因藍白斑篩選 紅色矩形：示放大圖像范圍，藍色箭頭：示藍色菌落，白色箭頭：示白色菌落；E：WT、Alg13 KO和雜合子小鼠目的基因白色菌落質粒提取物的DNA測序 紅色實線矩形：示“ATGAA”，藍色虛線矩形：示敲除的“ATGAA”；F：WT、Alg13 KO和雜合子小鼠NCBI核苷酸BLAST結果分析 橙色：示原始Alg13基因，黃色：示保留的“TTCAT”

2.2 Alg13KO小鼠ALG13蛋白的表達

采用免疫組織化學法和Western blot評估基因的缺失對小鼠腦中ALG13蛋白表達的影響。對大腦皮質、小腦和海馬進行免疫組織化學分析，結果顯示：WT和Alg13KO同窩小鼠在腦組織中ALG13蛋白表達具有明顯差異。在出生后8周，WT小鼠6個皮質層中觀察到抗ALG13抗體孵育后神經(jīng)元的強烈細胞質免疫反應性；在Alg13KO小鼠的相同位置未觀察到明顯的陽性神經(jīng)元(P<0.001，圖2A、B)。對于WT小鼠，細胞質的小腦顆粒層中顯示有ALG13標記的神經(jīng)元，并且大多數(shù)浦肯野細胞出現(xiàn)細胞質免疫反應性，而Alg13KO小鼠為ALG13陰性(P<0.05，圖2A、B)。類似地，WT小鼠的海馬CA1區(qū)中的多個神經(jīng)元顯示出對ALG13的強細胞質免疫反應性，而Alg13KO小鼠中觀察到相同位置ALG13陽性神經(jīng)元的顯著缺失(P<0.001，圖2A、B)。Western blot檢測結果顯示：Alg13KO小鼠缺乏對應于ALG13的條帶，定量分析也表明Alg13KO小鼠的ALG13蛋白表達量顯著低于WT小鼠(P<0.001，圖2C、D)。

A：免疫組化檢測小鼠皮質、小腦、海馬中ALG13的表達；B：免疫組化定量分析；C：Western blot 檢測小鼠皮質、小腦和海馬區(qū)域ALG13蛋白表達；D：半定量分析 a: P<0.001, b: P<0.05，與WT組比較

2.3 ALG13缺乏導致自發(fā)性癲癇發(fā)作

出生后2個月，Alg13KO小鼠在換籠時偶爾表現(xiàn)出癲癇發(fā)作。通常，癲癇發(fā)作的行為表現(xiàn)始于頸部和尾部的張力過高，其次是重復的前肢陣攣，伴有雙下肢站立并失去的姿勢，在發(fā)作后期觀察到會有短暫的靜止狀態(tài)(圖3A)。利用同步的視頻腦電系統(tǒng)長期監(jiān)測小鼠腦電表現(xiàn)(表2)，發(fā)現(xiàn)Alg13KO小鼠腦電顯示出明顯異常，典型特點如下：①發(fā)作前期主要是低幅高頻的電活動；②發(fā)作后期主要為高幅低頻尖波爆發(fā)(圖3C)。然而，對于行為學上未表現(xiàn)出癲癇發(fā)作的Alg13KO小鼠，仍可記錄到頻繁地被定義為“EEG 癲癇”的腦電活動，具體表現(xiàn)為持續(xù)時間大于5 s，波幅大于2倍基線，頻率大于 5 Hz的電活動(圖3B)。而這種異常腦電活動從未在野生型小鼠中被監(jiān)測到(圖3C)。長期記錄Alg13KO小鼠和 WT小鼠的基礎腦電活動，為更準確地分析，腦電頻段被規(guī)定為：δ(0.25～4 Hz)，θ(4～12 Hz)，α(12～18 Hz)，β(18～30 Hz)和低γ(30～50 Hz)。快速傅里葉轉換分析結果顯示，較之野生型小鼠，Alg13KO小鼠腦電δ和θ波段能量值顯著升高(P<0.001)，頻譜分析結果同樣顯示Alg13KO小鼠腦電δ和θ波段能量值顯著升高(P<0.001，圖3D～F)。

表2 模型小鼠自發(fā)性“EEG癲癇”事件的頻次 (次，n=6)

A: Alg13 KO小鼠自發(fā)性癲癇發(fā)作癥狀觀察;B:“EEG 癲癇”的示例 被定義為出現(xiàn)高振幅(>2倍線)、高頻率(>5 Hz)、持續(xù) 5 s以上的放電；C：Alg13 KO小鼠和WT小鼠腦電活動軌跡圖；D：Alg13 KO小鼠和WT小鼠代表性腦電圖分析的光譜圖；E：兩組小鼠腦電圖數(shù)據(jù)的傅里葉轉換分析；F：腦電δ和θ波的平均能量值比較 a: P<0.001

2.4 Alg13 KO小鼠模型中SCN1A的表達變化

為了評估由ALG13缺乏引起的癲癇發(fā)作是否與鈉通道表達的變化相關，提取來自小鼠皮質和海馬的細胞膜蛋白，并通過Western blot檢測SCN1A的表達。結果顯示：Alg13KO小鼠的海馬和皮質中SCN1A的表達水平顯著高于WT小鼠(圖4)。

a: P<0.05，b: P<0.01, 與WT組比較

3 討論

3.1 Alg13基因敲除小鼠是癲癇研究的良好動物模型

動物模型已廣泛應用于包括癲癇在內的人類神經(jīng)系統(tǒng)疾病研究中。盡管人類與小鼠在神經(jīng)系統(tǒng)的結構、組成和功能各方面都存在差異[12]，但由于人類與小鼠的基因具有超過99%的同源性，且基因具有較強的時空表達保守性[13]，小鼠仍是研究人類神經(jīng)疾病的理想動物模型之一。就癲癇而言，在人類和小鼠模型中，皮質和海馬結構都是癲癇發(fā)作的主要位置[14]。小鼠癲癇模型可分為誘導模型和遺傳模型。在誘導模型中，化學、電或聲刺激會導致急性或慢性癲癇發(fā)作，具體取決于誘導方法和方案。在遺傳模型中，遺傳損傷(或自發(fā)突變)導致自發(fā)性癲癇發(fā)作的出現(xiàn)[15]。本研究對CRISPR-Cas9基因編輯技術構建的Alg13基因敲除小鼠進行了基因型鑒定、ALG13蛋白表達檢測、癲癇發(fā)作情況的分析以及癲癇相關基因表達的研究，該模型表現(xiàn)出顯著的癲癇易感性，為深入研究ALG13在癲癇中的作用提供一種理想的敲基因動物模型。

基因鑒定是基因敲除小鼠保種繁殖的重要環(huán)節(jié)，其中常見小鼠基因敲除鑒定所使用的檢測方法之一為 PCR法。本研究采用小鼠合籠法獲得子代，并提取鼠尾組織基因組 DNA，利用PCR擴增和凝膠電泳等鑒定Alg13敲除鼠的基因型，但由于敲除的Alg13基因的堿基數(shù)量較小，所以在電泳圖中觀察不到顯著差異。因此對該基因片段進行測序驗證，確保相應的堿基被成功敲除。本研究還應用藍白斑篩選聯(lián)合測序技術，對Alg13基因的缺失突變進行檢測。藍白斑篩選技術同時具有高效性和靈敏性，利用藍白斑技術的高效性可以克服一代測序技術對稀有突變檢測低的靈敏度。通過藍白斑篩選、酶切與一代測序相結合對突變進行分析，結果顯示，此方法可以成功檢測Alg13基因的缺失。通過免疫組化和 Western blot檢測小鼠大腦皮質、小腦和海馬區(qū)中的 ALG13蛋白，結果也證實該基因被成功敲除。電壓門控離子通道對于神經(jīng)元興奮性是必要的，并在癲癇發(fā)生中起關鍵作用[16]。電壓敏感性鈉通道是由大的中心成孔糖基化α亞基和兩個較小β亞基組成的異聚復合物，其中大多數(shù)功能依賴于糖基化的α亞基。α亞基的N-糖基化對于鈉通道生物合成是必需的，并且已知ALG13參與UDP-GlcNAc糖基轉移酶的形成以催化蛋白質的N-糖基化[17]。因此，本研究對ALG13與一個重要的癲癇發(fā)生相關基因SCN1A的關系進行了分析。結果顯示，缺乏ALG13可能影響Nav 1.1在可興奮細胞膜中發(fā)揮功能的正常N-糖基化，進一步導致SCN1A的異常表達，間接引起自發(fā)性癲癇發(fā)作和癲癇易感性增加。以上結果表明，本研究構建的小鼠能夠成為后續(xù)研究的良好動物模型。

3.2 Alg13基因異常對腦發(fā)育和腦功能的影響可能是癲癇產(chǎn)生的潛在機制之一

ALG13相關的先天性糖基化障礙(ALG13-CDG)，也被稱為早期嬰兒癲癇性腦病-36(early infantile epileptic encephalopathy 36, EIEE36)，是由位于Xq23染色體上的Alg13基因的雜合突變引起的。ALG13-CDG的臨床表現(xiàn)包括癲癇、發(fā)育延遲、智力障礙、肌張力低下、凝血異常和內分泌功能障礙等[18]。ALG13編碼一種與ALG14異源二聚化的蛋白，在內質網(wǎng)中形成功能性UDP-GlcNAc糖基轉移酶[6, 19]。蛋白天冬酰胺的N-糖基化對于糖蛋白的結構和功能是必不可少的，因為它能催化蛋白N-糖基化的第二步，這也是患者表現(xiàn)出可變的多系統(tǒng)表型的原因。ALG13基因突變被認為是I型糖基化異常所致先天性疾病的原因，并且在癲癇性腦病的病因學中起作用。本研究發(fā)現(xiàn)，ALG13缺失與小鼠癲癇之間可能存在關聯(lián)[20]。人類和小鼠之間存在遺傳上的高度相似性和在神經(jīng)生理學上較小程度的相似性[21]。研究中所建立的Alg13敲基因小鼠癲癇模型，已經(jīng)在轉錄組學、神經(jīng)成像、神經(jīng)生理學和行為學的研究中應用，結果顯示出某種形式的癲癇易感性和神經(jīng)發(fā)育異常，但沒有明顯的N-糖基化缺陷表現(xiàn)[20]。因此，這一模型尚缺乏作為兒童發(fā)育性和癲癇性腦病(developmental and epileptic encephalopathy, DEE)直接模型的證據(jù)支撐，但仍可作為新生兒因發(fā)育異常所致癲癇癥狀的研究模型。此外，ALG13缺失在涉及癲癇相關小鼠腦發(fā)育、功能活動和信號通路的蛋白質翻譯后糖基化修飾中的作用知之甚少[22]。需進一步研究以分析小鼠N-糖基化的潛在變化以及它引起癲癇的可能機制。

ALG13調控的N-連接糖基化對腦神經(jīng)元發(fā)育至關重要。在大腦中，神經(jīng)元、少突膠質細胞和星形膠質細胞是從神經(jīng)干細胞發(fā)育而來的，源自神經(jīng)干細胞的細胞依賴于通過糖基化與其他細胞和分子相互作用[23]。糖基化蛋白參與神經(jīng)元和膠質細胞中 γ-氨基丁酸受體A[γ-aminobutyric acid receptor A，GABA(A)Rs]和水通道蛋白 4(aquaporin 4, AQP4)蛋白復合物的組裝，在發(fā)育過程中，糖基化缺陷會損害其與細胞外基質(extracellular matrix, ECM)相互作用的能力，常導致腦發(fā)育的異常[24]。此外，在幾乎所有參與調節(jié)或構成神經(jīng)元信號傳導的分子過程的蛋白質上都能觀察到 N-連接聚糖，雖然并非所有的 N 連接聚糖修飾對于正確的神經(jīng)元信號傳導都是至關重要的，但其中很大一部分能夠顯著影響神經(jīng)元活動[3]。例如，電壓門控離子通道(voltage-gated ion channel, VGIC)上的唾液酸化 N-連接聚糖是VGIC 活性最有效的調節(jié)劑之一，添加N-連接聚糖會顯著增加軸突放電的速率[25]。位于突觸小泡中的幾種質子泵和神經(jīng)遞質反轉運蛋白也是糖蛋白[26]。因此，N-連接聚糖將新陳代謝與神經(jīng)元內的信號傳導相結合，正確控制 N-連接糖基化對神經(jīng)元功能至關重要。癲癇正是一種由腦神經(jīng)元異常放電引起的慢性腦病，ALG13基因的突變可能通過影響參與腦發(fā)育以及神經(jīng)傳導過程的各類蛋白的糖基化從而導致癲癇的發(fā)生。

3.3 研究的局限性和總結

本研究建立的癲癇小鼠模型中Alg13的基因突變是缺失突變，而一些癲癇性腦病患者一般為點突變(如c.320 A>G)[27-28]。基因突變類型的這種差異可能對ALG13蛋白的功能產(chǎn)生不同程度的影響。雖然本研究結果表明Alg13缺失突變導致小鼠癲癇發(fā)作，但要完全解釋ALG13在人類癲癇發(fā)病機制中的作用還需進一步的研究。

綜上所述，本研究成功建立了Alg13基因敲除小鼠模型，該模型表現(xiàn)出明顯的自發(fā)性癲癇發(fā)作和癲癇易感性，可用于遺傳異常導致癲癇的機制研究。

利益沖突聲明文章內容不涉及相關利益沖突，該研究未涉及任何廠家、相關雇主或其他經(jīng)濟組織直接或間接的經(jīng)濟或利益的贊助