張 燦 安志靜 白 玥 王琛琛 鐘曉松

（首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京世紀(jì)壇醫(yī)院臨床基因與細(xì)胞工程中心，北京 100038）

近年來，嵌合抗原受體T細(xì)胞（chimeric antigen receptor，CAR-T）免疫療法在治療惡性血液腫瘤中具有顯著療效，特別是在治療急性淋巴細(xì)胞白血病中，完全緩解率可達(dá)到70%～90%，但大部分靶向CD19的CAR-T細(xì)胞（CART19）臨床試驗(yàn)均有較高的復(fù)發(fā)率，這與CAR-T細(xì)胞在體內(nèi)持續(xù)性短密切相關(guān)，而造成持續(xù)性短的主要原因是CAR分子結(jié)構(gòu)的問題，CAR的結(jié)構(gòu)主要包括4部分，分別是抗原結(jié)合域（scFv）、鉸鏈區(qū)（間隔區(qū)）、跨膜區(qū)以及胞內(nèi)信號(hào)區(qū)［1-3］。有文獻(xiàn)報(bào)道轉(zhuǎn)染含有4-1BB共刺激域的CAR-T細(xì)胞在體內(nèi)存在時(shí)間長，并且采用突變型IgG4長鉸鏈區(qū)可以延長T細(xì)胞的體內(nèi)抗腫瘤作用［4-5］。因此，本課題組構(gòu)建了一種基于突變型IgG4長鉸鏈區(qū)和4-1BB共刺激域的CAR，并在體內(nèi)外驗(yàn)證其功能。

1 材料與方法

1.1 材料 K562、NALM-6和PG-13細(xì)胞系購自ATCC公司。NGFR-K562、CD19-K562和NALM6-GL細(xì)胞均由實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建，方法參考文獻(xiàn)［6］。所有細(xì)胞系支原體檢測(cè)均為陰性；RPMI1640培養(yǎng)基和DMEM培養(yǎng)基購自Lonza公司；淋巴細(xì)胞分離液購自美國MP公司；PHA購自Sigma公司；胎牛血清購自Thermo公司；重組人IL-2購自雙鷺?biāo)帢I(yè)；所有流式抗體均購自美國BD公司；IFN-γELISA檢測(cè)試劑盒購自美國R&D公司；D-蟲熒光素鉀鹽購自橋生物公司；SPF級(jí)NOD/SCID小鼠購自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)公司，飼養(yǎng)于首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京世紀(jì)壇醫(yī)院的SPF級(jí)動(dòng)物房，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物所有操作程序均由實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。逆轉(zhuǎn)錄病毒質(zhì)粒及包裝體系均為本實(shí)驗(yàn)室保存。

1.2 方法

1.2.1 突變型IgG4長鉸鏈區(qū)和4-1BB共刺激因子CAR的逆轉(zhuǎn)錄病毒的構(gòu)建和包裝 本實(shí)驗(yàn)室前期構(gòu)建了MSGV-FMC63-28Z質(zhì)粒，設(shè)計(jì)突變的IgG4長片段來源的鉸鏈區(qū)及4-1BB共刺激域?qū)AR結(jié)構(gòu)進(jìn)行改造，采用PG-13病毒包裝體系制備逆轉(zhuǎn)錄病毒，高速離心后-80℃保存［6-8］。以空質(zhì)粒包裝的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體作為對(duì)照病毒Mock組。

1.2.2 CART19細(xì)胞的制備 采集多位健康志愿者外周血，經(jīng)淋巴細(xì)胞分離液分離出外周血單核細(xì)胞（PBMC），采用PHA刺激活化T細(xì)胞［9］。經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)，次日換含有IL-2的完全培養(yǎng)基進(jìn)行CART細(xì)胞擴(kuò)增，在轉(zhuǎn)導(dǎo)后4 d采用流式細(xì)胞儀檢測(cè)病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)效率，并用Western blot驗(yàn)證是否表達(dá)外源性

CD3ζ［6］。

1.2.3 腫瘤細(xì)胞對(duì)CART19細(xì)胞的特異性激活

1.2.3.1 IFN-γ胞內(nèi)染色 按照效靶比10∶1將效應(yīng)細(xì)胞（CART19細(xì)胞）與腫瘤細(xì)胞（NALM6-GL和K562-CD19）共培養(yǎng)，期間加入1μl的Golgi Stop，6 h后收集細(xì)胞，按照IFN-γ胞內(nèi)染色標(biāo)準(zhǔn)流程進(jìn)行流式檢測(cè)。

1.2.3.2 CD107a脫顆粒實(shí)驗(yàn) 按照效靶比10∶1將效應(yīng)細(xì)胞（CART19細(xì)胞）與腫瘤細(xì)胞（NALM6-GL和K562-CD19）共培養(yǎng)，期間加入1μl CD107a抗體和1μl的Golgi Stop，6 h后收集細(xì)胞，染色CD3、CD4和CD8后進(jìn)行流式細(xì)胞儀檢測(cè)。

1.2.3.3 CFSE增殖實(shí)驗(yàn) 在第0天將CART19用PBS清洗后進(jìn)行1μmol/L CFSE熒光染色20 min，再用含有2%FBS的PBS終止染色，PBS清洗2遍后流式檢測(cè)初始熒光值，按照效靶比2∶1將CART19和NALM6-GL和K562分別避光共培養(yǎng)4 d，收集細(xì)胞流式檢測(cè)。

1.2.4 評(píng)估CART19細(xì)胞對(duì)腫瘤細(xì)胞的殺傷能力和細(xì)胞因子釋放能力

1.2.4.1 4 h共培養(yǎng)熒光殺傷實(shí)驗(yàn) 按照效靶比10∶1將效應(yīng)細(xì)胞（NT、Mock和CART19細(xì)胞）與腫瘤細(xì)胞（NALM6-GL）共培養(yǎng)4 h，加入D-蟲熒光素鉀稀釋至150μg/ml，采用Xenogen IVIS成像系統(tǒng)進(jìn)行熒光拍照，殺傷率基于孔中的腫瘤細(xì)胞的熒光值，計(jì)算公式：殺傷率（%）=100-（效應(yīng)細(xì)胞和靶細(xì)胞共培養(yǎng)熒光值/靶細(xì)胞熒光值）×100%。

1.2.4.2 ELISA法檢測(cè)IFN-γ釋放 按照效靶比10∶1將效應(yīng)細(xì)胞（NT、Mock和CART19細(xì)胞）與腫瘤細(xì)胞（NALM6-GL和K562-CD19）共培養(yǎng)24 h，收集上清離心后，用ELISA標(biāo)準(zhǔn)方法檢測(cè)IFN-γ的分泌量。

1.2.5 體內(nèi)實(shí)驗(yàn)評(píng)價(jià)CART19細(xì)胞的抗腫瘤能力 6周齡雌性NOD/SCID小鼠尾靜脈注射1×106個(gè)的NALM6-GL細(xì)胞建立急性淋巴細(xì)胞白血病小鼠模型，于建模第2～4天連續(xù)3 d注射Mock細(xì)胞和CART19細(xì)胞5×106個(gè)/次，每組3只，每周采用Xenogen IVIS成像系統(tǒng)進(jìn)行熒光拍照，并計(jì)算生存率。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用GraphPad Prism 5軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)，數(shù)據(jù)以±s表示，每組實(shí)驗(yàn)至少獨(dú)立重復(fù)3次，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 載體構(gòu)建、病毒包裝及轉(zhuǎn)導(dǎo)效率評(píng)估 采用鼠源CD19 scFv、突變型IgG4鉸鏈區(qū)、CD28跨膜域和胞內(nèi)活化信號(hào)4-1BB以及CD3ζ構(gòu)建了逆轉(zhuǎn)錄病毒載體質(zhì)粒（圖1A）。采用制備的CART19逆轉(zhuǎn)錄病毒及對(duì)照組病毒轉(zhuǎn)染活化的T細(xì)胞，流式細(xì)胞儀檢測(cè)轉(zhuǎn)染效率分別為20.60%和1.43%（圖1B）。Western blot檢測(cè)轉(zhuǎn)染細(xì)胞人源CD3ζ的表達(dá)，結(jié)果顯示，與NT和Mock組相比，CART19組外源性CD3ζ的表達(dá)顯著（圖1C）。

圖1 CART19的設(shè)計(jì)及轉(zhuǎn)導(dǎo)T細(xì)胞的表達(dá)Fig.1 CART19 design and expression in transduced T cells

2.2 CART19可特異性識(shí)別CD19+腫瘤細(xì)胞并表達(dá)IFN-γ、脫顆粒 流式細(xì)胞儀檢測(cè)CART19細(xì)胞的IFN-γ和CD107a的表達(dá)，結(jié)果顯示與CD19-細(xì)胞系共培養(yǎng)相比，CD19+細(xì)胞系可以明顯刺激T細(xì)胞表達(dá)IFN-γ以及發(fā)生脫顆粒（圖2A、B）。通過流式細(xì)胞儀檢測(cè)CART19細(xì)胞的CFSE表達(dá)，結(jié)果顯示與CD19-細(xì)胞系共培養(yǎng)相比，CD19+細(xì)胞系可以明顯刺激T細(xì)胞增殖（圖2C）。

圖2 CD19特異性刺激CART19細(xì)胞表達(dá)IFN-γ和CD107aFig.2 CD19 specifically stimulates expression of IFN-γand CD107a in CART19 cells

2.3 CART19細(xì)胞可以特異性殺傷CD19+腫瘤細(xì)胞并釋放IFN-γ 按照不同效靶比（E∶T）將效應(yīng)細(xì)胞同NALM6-GL共培養(yǎng)4 h，結(jié)果顯示隨著效靶比的不斷增加，CART19對(duì)靶細(xì)胞的殺傷逐漸增強(qiáng)，而NT及Mock T細(xì)胞組無明顯變化（圖3A）。在此選取效靶比10∶1進(jìn)行24 h的共培養(yǎng)，收取培養(yǎng)上清液進(jìn)行IFN-γ的ELISA檢測(cè)，結(jié)果顯示在靶細(xì)胞為NALM6-GL的共培養(yǎng)中，CART19組的IFN-γ的釋放明顯高于NT組和Mock組，在靶細(xì)胞為K562-CD19的共培養(yǎng)中，CART19組的IFN-γ的釋放也明顯高于NT組和Mock組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.001，圖3B）。

2.4 CART19細(xì)胞在急性淋巴白血病小鼠中的抗腫瘤作用 為了評(píng)估CART19在體內(nèi)的功能，采用NALM6-GL尾靜脈注射建立急性淋巴細(xì)胞白血病的小鼠模型（圖4A）。與Mock組相比，注射CART19細(xì)胞組的小鼠腫瘤負(fù)荷明顯減輕（圖4B），Mock組小鼠在35 d內(nèi)全部死亡，而CART19細(xì)胞組小鼠在44 d均存活，CART19細(xì)胞組的生存率也明顯提升（圖4C）。結(jié)果顯示構(gòu)建的CART19在體內(nèi)具有明顯的抗腫瘤作用。

圖4 CART19細(xì)胞在體內(nèi)表現(xiàn)出顯著的抗白血病效應(yīng)Fig.4 CART19 cells display significant antileukemic activity in vivo

3 討論

CAR-T免疫療法在治療血液系統(tǒng)惡性腫瘤特別是B細(xì)胞惡性腫瘤已經(jīng)取得成果［10-11］，經(jīng)過治療70%～90%的B系急性淋巴細(xì)胞白血?。˙-cell acute lymphoblastic leukemia，B-ALL）患者可以達(dá)到完全緩解，然而隨著更多長期隨訪數(shù)據(jù)的公布，CAR-T治療后的高復(fù)發(fā)率也成為CAR-T發(fā)展的最大障礙，其中CD19 CAR-T細(xì)胞在體內(nèi)缺乏持久性是造成CD19+陽性復(fù)發(fā)的重要原因［1-2］。TURTLE等［12］研究發(fā)現(xiàn)，CD19+陽性復(fù)發(fā)僅發(fā)生在沒有持續(xù)性CAR-T細(xì)胞的患者中，因此提高CAR-T細(xì)胞在體內(nèi)的持續(xù)性是降低CD19+復(fù)發(fā)的重要手段之一。CAR結(jié)構(gòu)中與CAR-T細(xì)胞在體內(nèi)持久性關(guān)聯(lián)較多的研究是共刺激域部分，CD28和4-1BB是目前研究最多的兩種共刺激域分子，多項(xiàng)研究表明，相比于CD28，含有4-1BB共刺激域的CAR-T細(xì)胞在體內(nèi)存活時(shí)間更長［4，13］。CD19-28ζ的CAR-T細(xì)胞在體內(nèi)的中位存活時(shí)間是3個(gè)月，而有68%CD19-BBζCAR-T細(xì)胞超過了6個(gè)月，最長高達(dá)20個(gè)月，因此在CAR結(jié)構(gòu)設(shè)計(jì)重點(diǎn)是含有4-1BB對(duì)維持CAR-T在體內(nèi)的持續(xù)性［14-16］。

另外研究不多的鉸鏈區(qū)結(jié)構(gòu)對(duì)CAR-T細(xì)胞的功能也有十分重要的作用［17］。有研究表明來源于突變型的IgG4長鉸鏈區(qū)可以促進(jìn)抗腫瘤作用，首先IgG4與高親和力受體FcγR1（CD64）的結(jié)合力較低，其次長片段可以增強(qiáng)單鏈可變區(qū)（scFv）的靈活性從而緩解CAR與腫瘤抗原的空間限制，進(jìn)而促進(jìn)CAR-T細(xì)胞和靶細(xì)胞之間免疫突觸形成［5，18］。采用突變型的IgG4長鉸鏈區(qū)可以在不改變CAR介導(dǎo)的抗原裂解的同時(shí)降低與Fc-γ受體的結(jié)合，從而消除脫靶效應(yīng)，進(jìn)一步提高T細(xì)胞的持久性和抗腫瘤反應(yīng)［7］。具體的突變位點(diǎn)是在IgG4鉸鏈區(qū)的CH2部分中含有2個(gè)突變點(diǎn)L235E和N297Q，而且這種突變既不會(huì)影響CAR的表達(dá)也不會(huì)改變CAR-T細(xì)胞對(duì)CD19+腫瘤細(xì)胞的特異性殺傷［7］。

構(gòu)建這種基于突變型IgG4長鉸鏈區(qū)和4-1BB共刺激域的CAR，經(jīng)過逆轉(zhuǎn)錄病毒包裝、轉(zhuǎn)導(dǎo)和擴(kuò)增，獲得了CART19細(xì)胞。體外實(shí)驗(yàn)證明了CART19細(xì)胞可以有效殺傷CD19+腫瘤細(xì)胞并分泌大量IFN-γ，并且CD19+腫瘤細(xì)胞也可以特異性刺激CART19細(xì)胞表達(dá)IFN-γ、脫顆粒以及促進(jìn)增殖，體內(nèi)實(shí)驗(yàn)也證明CART19細(xì)胞具有抗腫瘤作用并且可以延長白血病小鼠的生存率。

除了共刺激域和鉸鏈區(qū)，CAR的結(jié)構(gòu)中研究較多的還有scFv，有研究表明降低scFv親和力會(huì)提高CAR-T細(xì)胞活化的閾值，避免過度活化從而保持記憶表型，使CAR-T細(xì)胞能夠長期存活［19］；鼠源scFv的免疫原性可能會(huì)導(dǎo)致CAR-T細(xì)胞在體內(nèi)無法持續(xù)存活，而人源化的scFv可以降低人體對(duì)CAR產(chǎn)生的免疫應(yīng)答，有望延長CAR-T在體內(nèi)的存活時(shí)間，因此本課題組可以繼續(xù)改進(jìn)CAR的結(jié)構(gòu)，提高CAR-T在體內(nèi)的持續(xù)性，從而降低疾病復(fù)發(fā)［12］。

目前，除了改變CAR結(jié)構(gòu)提高CAR-T細(xì)胞在體內(nèi)持續(xù)性之外，還可通過制備來源于記憶性干細(xì)胞樣T細(xì)胞（memory stem cell T cells，Tscm）的CAR-T細(xì)胞也是提高CAR-T細(xì)胞在體內(nèi)的持續(xù)性的重要方法之一。Tscm細(xì)胞不僅具有干細(xì)胞特性，還可在體外分化成中央記憶性T細(xì)胞（central memory T cell，Tcm）和效應(yīng)記憶性T細(xì)胞（effector memory Tcell，Tem），提高自我更新、增殖和存活能力［20-21］，更重要的是CD19CAR修飾的Tscm細(xì)胞還具有強(qiáng)大而持久的抗腫瘤能力［22］，因此選擇Tscm細(xì)胞作為來源制備CAR-T細(xì)胞以增強(qiáng)其持久性和殺傷性。

本研究成功構(gòu)建了基于突變型IgG4長鉸鏈區(qū)和4-1BB共刺激域的CAR-T細(xì)胞，為進(jìn)一步研究CAR-T細(xì)胞在體內(nèi)存活的機(jī)制及下一步臨床試驗(yàn)奠定了基礎(chǔ)。