黃潤(rùn)華 李利軍 陳思媛 田雪梅 王 帆

（四川省醫(yī)學(xué)科學(xué)院·四川省人民醫(yī)院（成都電子科技大學(xué)附屬醫(yī)院）手術(shù)室，成都 610072）

膀胱癌（bladder cancer，BC）是中國(guó)最常見的泌尿外科惡性腫瘤，近年來(lái)發(fā)病率迅速上升［1-2］。盡管早期診斷和先進(jìn)治療顯著改善了BC患者的預(yù)后，但BC晚期患者的生存率仍不足五年［3-4］。因此，探索BC腫瘤發(fā)生的分子機(jī)制及尋找新的治療靶點(diǎn)尤為迫切。研究表明，長(zhǎng)鏈非編碼RNA（long noncoding RNA，lncRNA）在腫瘤細(xì)胞周期、腫瘤細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移與化療耐藥等相關(guān)信號(hào)通路中均發(fā)揮調(diào)節(jié)作用，其作用類似于癌基因或抑癌基因［5］。結(jié)直腸癌差異表達(dá)lncRNA CRNDE（colorectal neoplasia differentially expressed）位于16號(hào)染色體，最初被鑒定為結(jié)直腸癌中的lncRNA，并以反義方向從鄰近的IRX5基因轉(zhuǎn)錄［6］。研究表明lncRNA CRNDE可作為miR-145的分子海綿來(lái)促進(jìn)胃癌細(xì)胞的增殖和遷移［7］。CHENG等［8］研究表明CRNDE在BC組織和細(xì)胞系中顯著上調(diào)，BC患者中CRNDE的過(guò)度表達(dá)與較高的TNM分期密切相關(guān)。本文主要研究CRNDE在體內(nèi)和體外對(duì)BC的作用，為BC的靶向治療提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料 12只雄性SPF級(jí)BALC/c裸鼠，4～6周齡，購(gòu)自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司［SCXK（京）2016-0011］；人BC細(xì)胞系T24、5637、UM-UC-3和正常膀胱上皮細(xì)胞SV-HUC-1購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院細(xì)胞生物學(xué)研究所（上海）；DMEM細(xì)胞培養(yǎng)液、胎牛血清（美國(guó)Invitrogen公司）；結(jié)晶紫（美國(guó)Sigma公司）；反轉(zhuǎn)錄試劑盒、SYBRGreen PCRMaster Mix試劑盒（日本TaKaRa公司）；Annexin V-FITC細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒（美國(guó)BD Pharmingen公司）；Lipofectamine 2000、TRIzol試劑、TUNEL細(xì)胞凋亡試劑盒（美國(guó)Thermo Fisher公司）；CCK-8試劑、RIPA裂解液、BCA試劑盒、ECL顯色液（上海碧云天公司）；兔抗ACTIN多抗（ab8227）、兔抗生存素（Survivin）單抗（ab134170）、兔抗胱天蛋白酶3（caspase-3，cas3，ab184787）、兔抗cas-9單抗（ab185719，英國(guó)Abcam公司）；3個(gè)不同的干擾序列CRNDE-shRNA-1、2、3和陰性對(duì)照shRNA-NC均由上海吉瑪公司設(shè)計(jì)合成；實(shí)驗(yàn)所用引物采用Primer3 Input網(wǎng)站設(shè)計(jì)，由生工生物公司合成；FACScan流式細(xì)胞儀（美國(guó)Beckman Coulter公司）；倒置顯微鏡（日本Olympus公司）；Nanodrop 2000（美國(guó)Thermo Fisher公司）。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 人BC細(xì)胞系T24、5637、UM-UC-3和正常膀胱上皮細(xì)胞SV-HUC-1在含1%青霉素-鏈霉素溶液和10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中，于37℃、含5%CO2的濕化培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.2.2 細(xì)胞轉(zhuǎn)染及分組處理 細(xì)胞在6孔板中匯合度達(dá)70%時(shí)使用Lipofectamine 2000分別將shRNA-NC、CRNDE-shRNA1、2、3轉(zhuǎn)染至T24細(xì)胞，記為shRNA-NC組、CRNDE-shRNA1、2、3組，Control組只轉(zhuǎn)染Lipofectamine 2000試劑。

1.2.3 RT-qPCR實(shí)驗(yàn)檢測(cè)基因mRNA表達(dá)量 用TRIzol試劑從1.2.1所述細(xì)胞系和1.2.2分組轉(zhuǎn)染細(xì)胞中提取總RNA，采用Nanodrop 2000測(cè)定RNA的純度和濃度。取等質(zhì)量的總RNA作為模板，根據(jù)制造商說(shuō)明書，使用反轉(zhuǎn)錄試劑盒轉(zhuǎn)錄成cDNA。以cDNA為模板，按照SYBR Green PCR Master Mix試劑盒步驟進(jìn)行RT-qPCR。反應(yīng)條件為：95℃10 min；95℃15 s，60℃30 s，72℃30 s，40個(gè)循環(huán)。以GAPDH為內(nèi)參，使用2-ΔΔCt法計(jì)算相對(duì)表達(dá)量。引物序列如下：lncRNA CRNDE正向引物5＇-CGCGCCCGCGCGGCGGAGGA-3＇，反向引物5＇-TATGAATTGCAGACTTTGCAGA-3＇；GAPDH正向引物5'-GTCAGCCGCATCTTCTTTTTTG-3'，反向引物5'-GCGCCCAATACGACCAAATC-3'；增殖細(xì)胞核抗原（Ki67）正向引物5＇-GAGCTAAATGAGAACAAGGAGCTA-3'，反向引物5＇-CCATGCTTTAAACATTCCGACT-3'；Survivin正 向 引 物5＇-TGCCCCGACGTTGCC-3＇，反向引物5＇-CAGTTCTTGAATGTAGAGATGCGGT-3＇。

1.2.4 克隆形成實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞增殖 將1.2.2分組轉(zhuǎn)染后的T24細(xì)胞以1 000個(gè)/孔接種于6孔板中培養(yǎng)2周。采用4%多聚甲醛固定細(xì)胞10 min，1%結(jié)晶紫染色5 min?？梢娍寺∮玫怪蔑@微鏡成像和手工計(jì)數(shù)，最后計(jì)算克隆形成率，克隆形成率（%）=（克隆數(shù)/接種細(xì)胞數(shù)）×100%。

1.2.5 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡 胰蛋白酶消化1.2.2分組轉(zhuǎn)染細(xì)胞，用預(yù)冷PBS（0.15 mol/L，pH=7.2）洗滌2次。將細(xì)胞以3 000 r/min離心5 min，棄上清，并將沉淀以1.0×105～1.0×106個(gè)/ml的密度重懸于1×結(jié)合緩沖液。將100μl樣品溶液轉(zhuǎn)移至5 ml培養(yǎng)管中，并與5μl FITC偶聯(lián)的Annexin V和5μl PI在室溫下于黑暗中孵育15 min。向每個(gè)樣品管中加入400μl 1×結(jié)合緩沖液，使用FACScan流式細(xì)胞儀進(jìn)行流式分析，數(shù)據(jù)使用FlowJo軟件進(jìn)行分析。

1.2.6 蛋白質(zhì)印跡檢測(cè)蛋白表達(dá) 采用RIPA裂解緩沖液提取1.2.2分組轉(zhuǎn)染的細(xì)胞總蛋白。BCA測(cè)定蛋白濃度并調(diào)平，取20μg蛋白經(jīng)12%SDSPAGE分離蛋白，并將其轉(zhuǎn)移至PVDF膜。以5%脫脂牛奶在TBST中封閉1 h后，caspase-3（1∶1 000）、caspase-9（1∶1 000）和ACTIN（1∶1 000）一抗4℃孵育過(guò)夜，TBST洗膜后加入辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔二抗（1∶3 000）37℃孵育1 h；洗膜后ECL曝光成像并用Quantity One軟件分析蛋白條帶的灰度值。

1.2.7 裸鼠成瘤實(shí)驗(yàn) 12只雄性SPF級(jí)BALC/c裸鼠飼養(yǎng)于無(wú)特定病原體條件下，在25℃下進(jìn)行12 h光照/黑暗循環(huán)，并自由進(jìn)食飲水。轉(zhuǎn)染CRNDEshRNA1和shRNA-NC的T24細(xì)胞以2×106個(gè)/ml分別皮下注射到裸鼠側(cè)面（每組6只小鼠）。每5 d檢測(cè)1次腫瘤體積（V），直到處死小鼠。根據(jù)以下公式計(jì)算腫瘤體積：V=0.5×長(zhǎng)度×寬度2。30 d后，以頸脫位法處死小鼠，并通過(guò)手術(shù)切除腫瘤，拍照，稱重并進(jìn)行石蠟包埋切片，以進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.8 免疫組化檢測(cè)Survivin 將1.2.7保存的腫瘤組織石蠟切片脫蠟，檸檬酸鈉緩沖液修復(fù)，滴加一抗至切片，4℃孵育過(guò)夜，二抗37℃孵育1 h，滴加辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的鏈酶蛋白親和素，37℃下作用40 min，洗滌后避光顯色并以蘇木素復(fù)染細(xì)胞核。封片后使用光學(xué)顯微鏡觀察Survivin陽(yáng)性細(xì)胞。

1.2.9 TUNEL細(xì)胞凋亡檢測(cè) 將1.2.7保存的腫瘤組織石蠟切片脫蠟，按照TUNEL細(xì)胞凋亡試劑盒說(shuō)明書操作染色，封片后使用光學(xué)顯微鏡觀察凋亡細(xì)胞。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 所有數(shù)據(jù)均為至少3次重復(fù)實(shí)驗(yàn)的統(tǒng)計(jì)結(jié)果，表示為±s。使用SPSS18.0軟件進(jìn)行分析，組間數(shù)據(jù)比較通過(guò)獨(dú)立的t檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 LncRNA CRNDE的表達(dá) 人BC細(xì)胞系T24、5637、UM-UC-3中CRNDE的表達(dá)較正常膀胱上皮細(xì)胞SV-HUC-1顯著上調(diào)（P＜0.05），見圖1A。與對(duì)照組相比，shRNA-NC組CRNDE表達(dá)水平差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，CRNDE-shRNA 1、2、3組CRNDE表達(dá)量均明顯降低（P＜0.05），且CRNDE-shRNA1組中CRNDE表達(dá)量最低，見圖1B，因此采用CRNDEshRNA1序列進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

圖1 RT-qPCR檢測(cè)CRNDE表達(dá)Fig.1 RT-qPCR was commended to measure expression of CRNDE

2.2 下調(diào)lncRNA CRNDE抑制T24細(xì)胞增殖 與對(duì)照組相比，CRNDE-shRNA1組T24細(xì)胞克隆形成率明顯降低（P＜0.05），Ki67和Survivin的表達(dá)量均顯著下調(diào)（P＜0.05），shRNA-NC組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見圖2。

圖2 下調(diào)lncRNA CRNDE對(duì)T24細(xì)胞增殖的影響Fig.2 Effect of down-regulation of lncRNA CRNDE on T24 cells proliferation

2.3 下調(diào)lncRNA CRNDE誘導(dǎo)T24細(xì)胞凋亡 對(duì)照組、shRNA-NC組和CRNDE-shRNA1組細(xì)胞凋亡率分別為（4.7±2.3）%、（4.9±2.0）%和（28.0±3.0）%，shRNA-NC組細(xì)胞凋亡率較對(duì)照組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），CRNDE-shRNA1組細(xì)胞凋亡率顯著升高（P＜0.05，圖3A、B）。與對(duì)照組相比，shRNA-NC組cleaved cas3/cas3和cleaved cas9/cas9差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，CRNDE-shRNA1組cleaved cas3/cas3和cleaved cas9/cas9顯著升高（P＜0.05，圖3C）。

2.4 下調(diào)lncRNA CRNDE抑制裸鼠移植瘤的生長(zhǎng) 在30 d時(shí)，CRNDE-shRNA1組腫瘤體積（約800 mm3）僅為shRNA-NC組（約2 400 mm3）的1/3，腫瘤體積明顯減?。≒＜0.05），腫瘤重量也明顯低于shRNA-NC組（P＜0.05），見圖4。

圖4 下調(diào)lncRNA CRNDE對(duì)裸鼠移植瘤生長(zhǎng)的影響Fig.4 Effect of down-regulation of lncRNA CRNDE on growth of transplanted tumors in nude mice

2.5 下調(diào)lncRNA CRNDE誘導(dǎo)腫瘤組織中癌細(xì)胞的凋亡 CRNDE-shRNA1組細(xì)胞凋亡率（47±9）%相較于shRNA-NC組（3±3）%顯著增加（P＜0.05），見圖5A；與shRNA-NC組相比，CRNDE-shRNA1組Survivin陽(yáng)性細(xì)胞明顯減少（P＜0.05），見圖5B。

圖3下調(diào)lncRNA CRNDE對(duì)T24細(xì)胞凋亡的影響Fig.3 Effect of down-regulation of lncRNA CRNDE on T24 cell apoptosis

圖5 下調(diào)lncRNA CRNDE對(duì)腫瘤組織細(xì)胞凋亡的影響Fig.5 Effect of down-regulation of lncRNA CRNDE on apoptosis in tumor tissue

3 討論

CRNDE是一種眾所周知的致癌lncRNA，在包括BC在內(nèi)的多種癌癥中表達(dá)上調(diào)［8-10］。失調(diào)的lncRNA通過(guò)多種機(jī)制在BC的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮至關(guān)重要的作用，其可在與蛋白質(zhì)、miRNA和mRNA相互作用的過(guò)程中充當(dāng)向?qū)?、支架和分子海綿，從而形成復(fù)雜的信號(hào)調(diào)節(jié)網(wǎng)絡(luò)［11-12］。CRNDE的高表達(dá)與癌癥患者的臨床病理特征和預(yù)后不良密切相關(guān)，包括TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、組織學(xué)分級(jí)和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移［13-14］。此外，CRNDE過(guò)表達(dá)可增強(qiáng)癌細(xì)胞的惡性表型，如增殖和遷移能力增強(qiáng)、凋亡細(xì)胞減少和細(xì)胞快速生長(zhǎng)等［15-17］。研究表明CRNDE在神經(jīng)膠質(zhì)瘤中顯著上調(diào)，并通過(guò)激活mTOR促進(jìn)細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲［16］。本研究結(jié)果表明，人BC細(xì)胞中CRNDE表達(dá)顯著上調(diào)，下調(diào)CRNDE表達(dá)可顯著減少T24細(xì)胞的集落形成，并下調(diào)Ki67和Survivin mRNA表達(dá)。細(xì)胞增殖標(biāo)記蛋白Ki67的表達(dá)水平可用于評(píng)估細(xì)胞的增殖能力［18］。Survivin是目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)的最強(qiáng)的凋亡抑制因子之一，可直接作用于caspase，主要通過(guò)黏附于活化的caspase-3、7參與細(xì)胞凋亡，通過(guò)調(diào)節(jié)細(xì)胞周期，使腫瘤細(xì)胞逃逸G2/M檢測(cè)關(guān)卡而獲得惡性增殖潛能［19］。因此下調(diào)CRNDE表達(dá)可顯著抑制BC細(xì)胞增殖。

腫瘤細(xì)胞中凋亡減弱、誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡是腫瘤治療的主要方式之一。LI等［20］研究表明，敲低lncRNA CRNDE表達(dá)能夠增加肝癌細(xì)胞中Bax和cleaved caspase-3表達(dá)，并降低Bcl-2表達(dá)，從而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。Caspase-9是起始凋亡蛋白酶，線粒體釋放細(xì)胞色素C并通過(guò)其與caspase-9前體結(jié)合形成凋亡復(fù)合物，激活caspase-9介導(dǎo)的線粒體信號(hào)凋亡通路引起細(xì)胞凋亡［21］。Caspase-3是細(xì)胞凋亡過(guò)程中的執(zhí)行凋亡蛋白酶，可導(dǎo)致DNA片段化和細(xì)胞骨架破壞等一系列引起細(xì)胞凋亡的事件［22］。本研究表明下調(diào)CRNDE表達(dá)可顯著增加細(xì)胞凋亡率，并上調(diào)活化caspase-3和活化caspase-9蛋白表達(dá)。提示下調(diào)lncRNA CRNDE可能通過(guò)激活caspase途徑誘導(dǎo)BC細(xì)胞凋亡。

體內(nèi)實(shí)驗(yàn)表明，沉默CRNDE表達(dá)可抑制裸鼠移植瘤的體積和重量［23］。本研究結(jié)果表明下調(diào)lncRNA CRNDE能有效抑制小鼠體內(nèi)BC的腫瘤生長(zhǎng)，并增加腫瘤組織中TUNEL陽(yáng)性細(xì)胞率，抑制凋亡因子Survivin表達(dá)。因此下調(diào)lncRNA CRNDE能夠阻止BC腫瘤的發(fā)展進(jìn)程。

綜上所述，lncRNA CRNDE在人BC中高表達(dá)，下調(diào)lncRNA CRNDE能夠抑制BCT24細(xì)胞增殖，通過(guò)caspase途徑誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，可有效阻止異種移植腫瘤的生長(zhǎng)。但CRNDE在BC中的分子作用機(jī)制尚不明確，仍需進(jìn)一步探索?？傊狙芯拷沂玖薈RNDE在BC中的生物學(xué)功能，預(yù)示CRNDE可能成為治療BC的新靶標(biāo)。