曹永清，劉 艷，張麗慧，晉婷婷，任嘉紅

（1山西師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，太原 030000；2長治學(xué)院生命科學(xué)系，山西長治 046011）

0 引言

草甘膦(Glyphosate)俗稱農(nóng)達(dá)，學(xué)名N-（膦酸甲基）甘氨酸(C3H8NO5P)，是一種高效除草劑[1]。草甘膦雖具有低廉、高效、毒性低、殘留少、易降解等優(yōu)點(diǎn)，但一旦施用于土壤，便會借助其極性基團(tuán)與土壤顆粒緊密結(jié)合，難以祛除，長時間使用或者施用不當(dāng)容易對非靶標(biāo)生物和環(huán)境造成破壞[2]。目前，由于人們對草甘膦的無節(jié)制使用，在自然界的草甘膦量已遠(yuǎn)超出了環(huán)境對其的自然分解能力，產(chǎn)生的許多有害物質(zhì)慢慢的積累下來，通過土壤擴(kuò)散或者水流等途徑進(jìn)入食物鏈中，對生態(tài)環(huán)境乃至人類的健康帶來了很大的威脅[3-6]。目前國內(nèi)外對草甘膦污染的處理方法均存在一定的局限性，主要原因包括設(shè)備成本高、工程量大、處理效果與預(yù)期相差甚遠(yuǎn)且容易造成二次污染等[7]。因此有關(guān)草甘膦帶來的環(huán)境效應(yīng)及其修復(fù)技術(shù)逐漸成為了學(xué)者們討論的熱點(diǎn)話題。

利用微生物降解草甘膦是低成本高效率且對環(huán)境影響小的草甘膦降解方法，極具發(fā)展前景[8]。降解草甘膦的微生物種類主要包括假單胞菌屬(Pseudomonas)、節(jié)桿菌屬(Arthrobacter)以及產(chǎn)堿桿菌屬(Alcaligrenes)[9]、產(chǎn)黃菌屬(Flavobacterium)[10]等；同時土壤中的真菌也具有降解草甘膦的能力[11]。隨著草甘膦降解菌的深入研究，菌株的降解途徑也逐漸被闡明，微生物主要通過草甘膦氧化酶途徑和肌氨酸途徑[12]降解草甘膦。因此，尋找更多具有強(qiáng)降解草甘膦能力的菌株，對于開發(fā)降解草甘膦微生物菌劑以及修復(fù)草甘膦造成的環(huán)境危害都具有重大意義。

熒光假單胞菌(Pseudomonas fluorescens)CLW17是任嘉紅等[13-14]從南方紅豆杉根際篩選出的一株高效溶無機(jī)磷細(xì)菌，該菌株可顯著提高土壤中可溶性磷含量，增加植物對磷元素的吸收，還可分泌嗜鐵素、生長素以及ACC脫氨酶等來促進(jìn)植物的生長。經(jīng)過對CLW17全基因組數(shù)據(jù)進(jìn)行分析和注釋，發(fā)現(xiàn)該菌株的全基因組中存在與草甘膦降解相關(guān)的基因和途徑。為探討CLW17菌株降解草甘膦的能力，本研究通過Plackett-Burman(PB)及Central Composite Design(CCD)方法聯(lián)用對影響其降解草甘膦的相關(guān)因素進(jìn)行篩選和優(yōu)化，以期達(dá)到最大降解率；同時通過分析CLW17菌株的基因組學(xué)信息，對甘氨酸氧化酶基因thiO基因進(jìn)行敲除和回補(bǔ)，為深入探究其功能基因及揭示該菌株草甘膦降解途徑奠定基礎(chǔ)。研究結(jié)果可為利用微生物降解草甘膦的應(yīng)用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 主要菌株、質(zhì)粒P.fluorescensCLW17、

Escherichia coliS17-1、自殺型質(zhì)粒pEX18-Gm、回補(bǔ)質(zhì)粒pJN105由本實(shí)驗室低溫保存?？股毓ぷ鳚舛龋喊逼S青霉素(Amp)100 μg/mL，慶大霉素(Gm)50 μg/mL。所需引物見表1。

表1 PCR引物

1.1.2 主要試劑 供試草甘膦為山東勝邦綠野公司生產(chǎn)（含量為41%）；氨芐青霉素、慶大霉素，溶菌酶，Solarbio公司；蛋白酶K，MERCK公司；DNA膠回收試劑盒、質(zhì)粒提取試劑盒，OMEGA公司；HindⅢ、EcoRⅠ、Q5polymerase，NEB公司；T4DNA Ligase，RNaseA，Takara公司；RapidTaqMaster Mix，Vazyme公司；其余藥品為常規(guī)分析純。

1.2 方法

1.2.1 草甘膦耐受性檢測 將CLW17菌株活化后，取500 μL于50 mL LB液體培養(yǎng)基中，28℃、180 r/min培養(yǎng)，菌懸液稀釋至10-7分別涂布于含草甘磷0.1%、0.2%、0.3%、0.4%、0.5%、0.6%、0.7%、0.8%的NA固體培養(yǎng)基，置于28℃恒溫培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)3天，觀察CLW17菌株的生長情況。

1.2.2 唯一碳源、氮源和磷源試驗 參照李冠喜等[19]的方法開展CLW17菌株的唯一碳源、氮源和磷源試驗，通過測定OD600以確定CLW17菌株以草甘膦作為唯一碳源、唯一氮源和唯一磷源生長狀況最好的培養(yǎng)基。

1.2.3 最佳碳源、氮源的確定 在含有0.4%草甘膦的基礎(chǔ)無碳培養(yǎng)基中分別加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%的麥芽糖、葡萄糖、乳糖、蔗糖，以不加碳源的培養(yǎng)基為對照；同時，在含有0.4%草甘膦的基礎(chǔ)無氮培養(yǎng)基中分別添加質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.05%的蛋白胨、硫酸銨、草酸銨、硝酸鉀、硝酸銨，以不加氮源的培養(yǎng)基為對照，參照康紀(jì)婷等[16]的方法測定發(fā)酵液無機(jī)磷及全磷含量，并計算CLW17菌株對草甘膦的降解率。

1.2.4 降解草甘膦Plackett-Burman(PB)試驗及Central Composite Design(CCD)試驗 以草甘膦降解率為響應(yīng)值，選擇影響CLW17菌株降解草甘膦的8個因子（溫度、pH、接種量、裝液量、葡萄糖加入量、硫酸銨加入量、轉(zhuǎn)速、草甘膦），每個因子取高低兩個水平，X9、X10、X11為虛擬因子，以試驗次數(shù)設(shè)置為12的PB設(shè)計法分析影響草甘膦降解的重要因子，試驗設(shè)計見表2。采用CCD法[20-21]對由PB篩選出的關(guān)鍵因子進(jìn)行試驗設(shè)計，固定其他非關(guān)鍵因子。中心復(fù)合試驗包括含3個關(guān)鍵因子的20組實(shí)驗，每個變量設(shè)置5個水平，試驗設(shè)計見表4。

表2 Plackett-Burman試驗設(shè)計及結(jié)果

表3 偏回歸系數(shù)及影響因子的顯著性分析

表4 中心組合及設(shè)計結(jié)果

1.2.5 草甘膦降解途徑的基因組分析 通過對P.fluorescensCLW17全基因序列與KEGG和NCBI的相似性分析，篩選草甘膦降解途徑中的關(guān)鍵基因，推測可能的草甘膦降解途徑。利用Protparam(ExPASy-ProtParam tool)分析了預(yù)測的蛋白基本理化性質(zhì)；利用NetPhos 3.1 Server(NetPhos-3.1-Services-DTU Health Tech)進(jìn)行磷酸化位點(diǎn)分析；利用SignalP 5.0 server(SignalP-5.0-Services-DTU Health Tech)進(jìn)行信號肽分析；利用TMHMM(TMHMM-2.0-Services-DTU Health Tech)進(jìn)行蛋白序列跨膜區(qū)分析；利用NCBI CDD數(shù)據(jù)庫(NCBI Conserved Domain Search(nih.gov))對蛋白質(zhì)保守結(jié)構(gòu)域進(jìn)行分析；利用SMART(SMART:Main page(embl.de))對蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)功能域進(jìn)行預(yù)測；利用SOPMA(NPS@:SOPMA secondary structure prediction(ibcp.fr))預(yù)測了基因編碼蛋白的二級結(jié)構(gòu)。

1.2.6thiO基因敲除突變株的構(gòu)建 采用CLW17_04770FW(HindⅢ)/CLW17_Del04770FW及CLW17_04770RV(EcoR I)/CLW17_Del04770RV引物分別從CLW17基因組中擴(kuò)增thiO基因同源前臂A和同源后臂B，利用重疊PCR將同源前臂A與同源后臂B連接起來，命名為thiO-A+B，產(chǎn)物經(jīng)DNA膠回收試劑盒回收。將thiO-A+B和質(zhì)粒pEX18-Gm酶切并連接，轉(zhuǎn)化至E.coliS17-1感受態(tài)，之后進(jìn)行菌落PCR驗證并抽提質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切驗證，測序正確后即獲得重組質(zhì)粒pEX18-Gm-thiO-A+B。通過接合轉(zhuǎn)移[22]的方法將構(gòu)建好的敲除載體pEX18-Gm-thiO-A+B導(dǎo)入CLW17中，在含有Gm(50 μg/mL)+Amp(100 μg/mL)的LB平板上分級劃線，30℃過夜培養(yǎng)，將獲得的單菌落在LAS平板上分級劃線。之后分別在LAS平板及含有Gm 50 μg/mL的LB平板影印篩選，僅能在LAS上生長的為雙交換菌株。最后使用引物CLW17_04770SQFW/CLW17_04770SQRV進(jìn)行驗證，獲得敲除突變菌株CLW17ΔthiO。DNA測序委托北京華大基因公司。

1.2.7 ΔthiO/thiO回補(bǔ)株的構(gòu)建 使用引物CLW17_Comp04770FW-EcoRⅠ/CLW17_Comp04770 RV-SpeI進(jìn)行PCR擴(kuò)增獲得thiO基因，用限制性內(nèi)切酶EcoRⅠ和SpeⅠ同時酶切thiO基因片段及質(zhì)粒pJN105后進(jìn)行連接，并轉(zhuǎn)化至E.coliS17-1感受態(tài)，之后進(jìn)行菌落PCR驗證，并抽取質(zhì)粒酶切驗證，測序正確后獲得重組質(zhì)粒thiOcomp-pJN105。通過接合轉(zhuǎn)移的方式將重組質(zhì)粒導(dǎo)入到敲除株CLW17ΔthiO中（記為ΔthiO/thiO），同時將空載體pJN105導(dǎo)入到敲除株CLW17ΔthiO作為對照（記為ΔthiO/pJN105），過夜培養(yǎng)。挑取菌苔在含有Gm 50 μg/mL M9基本培養(yǎng)基平板上分級劃線，待長出單菌落后點(diǎn)種于Gm 50 μg/mL+M9平板。挑取單菌落，以pBAD-Forward/T7為引物進(jìn)行PCR驗證，以ΔthiO/pJN105為陽性對照。

1.2.8 敲除株及回補(bǔ)株草甘膦降解率的測定 敲除株CLW17ΔthiO與回補(bǔ)株ΔthiO/thiO草甘膦降解率的測定方法同1.2.4。

語言不能脫離文化而存在，脫離文化的語言學(xué)習(xí)是難以成功的。同一事物在不同文化中意義可能千差萬別，因此，了解語言所處的特定文化背景是交際成功的保障。

2 結(jié)果與分析

2.1 CLW17菌株對草甘膦的耐受性

CLW17菌株在草甘膦含量為0.1%～0.4%的NA平板上長勢良好，均表現(xiàn)為旺盛生長；當(dāng)草甘膦濃度大于0.4%，菌株生長受到抑制；當(dāng)達(dá)到0.8%時，菌株停止生長。這說明CLW17菌株對草甘膦的最大耐受濃度為0.7%，菌株在該濃度以下均能發(fā)揮降解作用，但濃度低于0.4%時CLW17能更高效地降解草甘膦。

2.2 CLW17菌株降解草甘膦的最適碳源和氮源

2.2.1 唯一碳源、氮源、磷源試驗 CLW17菌株在以草甘膦為唯一碳源、氮源、磷源的培養(yǎng)基上均能生長。由圖1可知，菌株在以草甘膦為唯一磷源的培養(yǎng)基上生長最好，以草甘膦為唯一碳源的培養(yǎng)基次之，以草甘膦為唯一氮源的培養(yǎng)基上生長最差，說明CLW17菌株能夠高效利用草甘膦作為自身生長的磷源。因此，后續(xù)實(shí)驗均采用草甘膦作為CLW17菌株生長的唯一磷源。這也進(jìn)一步說明該菌株具有應(yīng)用于草甘膦污染土壤的巨大潛力。

圖1 CLW17在以草甘膦為唯一碳源、氮源、磷源培養(yǎng)基上的生長狀況

2.2.2 最佳碳源和氮源的確定 不同碳源對于CLW17菌株降解草甘膦的影響程度如圖2所示。CLW17菌株在添加外源碳源的條件下對草甘膦的降解率均顯著高于無碳源培養(yǎng)時對草甘膦的降解率，其中以葡萄糖作為唯一碳源時對草甘膦的降解率最大，說明CLW17菌株降解草甘膦時所需的最佳碳源為葡萄糖，因此后續(xù)實(shí)驗均采用葡萄糖作為CLW17菌株降解草甘膦培養(yǎng)基中的唯一碳源。

圖2 不同碳源對CLW17菌株降解草甘膦的影響

不同氮源對于CLW17菌株降解草甘膦的影響程度如圖3所示。由圖3可以看出，添加外源氮源條件下CLW17菌株降解草甘膦的效率顯著高于無氮源培養(yǎng)時對草甘膦的降解率，且以硫酸銨為唯一氮源時對草甘膦的降解率最大，因此后續(xù)實(shí)驗均采用硫酸銨作為CLW17菌株降解草甘膦培養(yǎng)基中的唯一氮源。

圖3 不同氮源對CLW17菌株降解草甘膦的影響

2.3 降解草甘膦關(guān)鍵影響因子的篩選

Plackett-Burman試驗設(shè)計及結(jié)果如表2所示。利用Design Expert 12軟件進(jìn)行ANOVA分析，由分析結(jié)果可知（表3），X2（初始pH）、X5（葡萄糖加入量）、X6（硫酸銨加入量）對降解率的影響均表現(xiàn)為負(fù)效應(yīng)，其他各因素對降解率的影響均表現(xiàn)為正效應(yīng)。經(jīng)過試驗得到以草甘膦降解率為響應(yīng)值的線性回歸方程：Y=-9.45169+4.62282X1-11.01X5-8.69X6，方程中Y為預(yù)測的降解率，Xi為變量。其中由貢獻(xiàn)值可知，X1（溫度）、X5、X6對草甘膦降解率影響較大，ANOVA分析中P值為0.0071，表明擬合效果極顯著。決定系數(shù)(R2)為0.7621，調(diào)整系數(shù)(adjR2)為 0.6729，變化系數(shù)(CV)為33.77%，精密度為8.7223，說明該數(shù)學(xué)模型可以較好的反映實(shí)驗結(jié)果，能夠用來對草甘膦降解率進(jìn)行評估。

2.4 降解草甘膦關(guān)鍵影響因素CCD試驗結(jié)果及效應(yīng)分析

將PB試驗篩選出的3個關(guān)鍵因子進(jìn)行組合設(shè)計，結(jié)果如表4所示。經(jīng)回歸擬合得到二次方程模型Y=-637.55284+38.08443X1+23.81997X5+239.05650X6-0.233762X1X5-4.85006X1X6-3.01244X5X6-0.599247X12-0.784240X52-68.55762X62（Y為預(yù)測的響應(yīng)值，X1為溫度，單位℃，X5、X6分別為葡萄糖和硫酸銨加入量，單位g/L）。由表5可得，因素X6對降解效果的線性效應(yīng)顯著，而因素X1和X5不顯著；因素X12、X52、X62對降解效果的曲面效應(yīng)極顯著；X1X6對降解率的交互影響極顯著，X5X6對降解率的交互影響顯著，而X1X5對降解率的交互影響不顯著?；貧w模型P值(prob＞F)＜0.0001，失擬項(P=0.4660＞0.05)，說明擬合程度好。決定系數(shù)(R2)為0.9387，調(diào)整系數(shù)(adjR2)為 0.8835，變化系數(shù)(CV)為2.23%，精密度為12.262，表明該模型的可信度較高，能較好的反映實(shí)際情況，可以對降解率進(jìn)行合理的預(yù)測。

表5 降解率優(yōu)化的模型適配和方差分析結(jié)果

由Design Expert 12軟件對模型優(yōu)化處理得到CLW17菌株降解草甘膦的最佳條件為：固定其他因素（草甘膦加入量0.4%，100 mL三角瓶裝液量50 mL，接種量1%，初始pH 7.0，轉(zhuǎn)速200 r/min），關(guān)鍵因素溫度30℃，蒙金娜培養(yǎng)基中葡萄糖9.82 g/L，硫酸銨0.47 g/L，其他成分按基礎(chǔ)配方，理論計算對草甘膦的降解率達(dá)到70.03%。為了驗證模型的準(zhǔn)確性，采用優(yōu)化后的條件，共重復(fù)3次試驗，3天后測定CLW17菌株對草甘膦的降解率分別為71.72%、73.87%、72.84%，菌株對草甘膦平均降解率為72.81%，與預(yù)測值70.03%較相近，表明模型擬合較好。證明了采用PB和CCD方法聯(lián)用優(yōu)化CLW17菌株降解草甘膦的條件的可行性。

2.5 草甘膦降解途徑關(guān)鍵基因篩選

通過對CLW17全基因組數(shù)據(jù)分析和注釋，該菌株預(yù)測到的與草甘膦降解可能相關(guān)基因如表6所示。其中thiO基因編碼甘氨酸氧化酶，參與草甘膦氧化酶(CN)途徑，在該酶作用下，草甘膦分子C-N鍵斷裂，生成氨甲基磷酸(AMPA)和乙醛酸。乙醛酸進(jìn)一步代謝為甘氨酸或通過甘氨酸循環(huán)轉(zhuǎn)化為微生物生物量和二氧化碳，而AMPA可以被C-P裂解酶降解，釋放無機(jī)磷和甲胺，后者被降解為甲醛；此外，C-P裂解酶是由phn或htx操縱子指定的一個小途徑的酶，參與肌氨酸(C-P)途徑，在該酶作用下，草甘膦分子C-P鍵斷裂，釋放無機(jī)磷酸鹽和肌氨酸。肌氨酸可能通過肌氨酸氧化酶進(jìn)一步降解為甘氨酸和甲醛[23-26]。根據(jù)已報道的草甘膦降解途徑，預(yù)測CLW17草甘膦降解的可能途徑如圖4所示，包括C-N途徑和C-P途徑。

表6 CLW17草甘膦降解相關(guān)基因預(yù)測

圖4 CLW17草甘膦降解代謝途徑的推測

2.6 甘氨酸氧化酶基因thiO的生物信息學(xué)分析

thiO蛋白質(zhì)的理化性質(zhì)：序列分析表明，thiO基因的開放閱讀框為1101 bp，據(jù)Protparam在線軟件分析，該開放閱讀框共編碼366個氨基酸。編碼蛋白理論分子量為39.09 kDa，等電點(diǎn)(pI)為5.30，脂肪系數(shù)為101.26，平均疏水性為 0.096，分子式為C1756H2758N480O513S9，不穩(wěn)定系數(shù)為38.43，是穩(wěn)定蛋白。

thiO蛋白磷酸化、信號肽及跨膜結(jié)構(gòu)域：用NetPhos 3.1 Server在線軟件，對thiO蛋白進(jìn)行磷酸化位點(diǎn)分析。結(jié)果表明，thiO蛋白有11個Ser、5個Thr、2個Tyr可能成為蛋白磷酸化位點(diǎn)；據(jù)SignalP 5.0 server在線軟件分析，thiO蛋白具有信號肽（圖5A）；據(jù)TMHMM在線軟件分析，該蛋白擁有一個跨膜結(jié)構(gòu)域，為跨膜蛋白（圖5B）。

圖5 thiO蛋白信號肽及跨膜結(jié)構(gòu)域預(yù)測

thiO蛋白結(jié)構(gòu)功能域：應(yīng)用NCBI CCD數(shù)據(jù)庫對thiO基因編碼的氨基酸序列進(jìn)行蛋白質(zhì)保守結(jié)構(gòu)域預(yù)測，結(jié)果顯示，該蛋白質(zhì)屬于thiamin ThiO家族，該家族由同源四聚體組成，依賴于FAD的甘氨酸氧化酶硫代。采用SMART軟件對thiO蛋白的結(jié)構(gòu)功能域進(jìn)行預(yù)測，在位于7～24的區(qū)域存在一個跨膜基序，該基序由大約18個氨基酸殘基組成。

thiO蛋白結(jié)構(gòu)分析：用SOPMA在線軟件對thiO蛋白二級結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測。結(jié)果顯示，其主要以α-螺旋、β折疊、延伸鏈和無規(guī)則卷曲等為蛋白最大量的結(jié)構(gòu)原件。在該氨基酸序列中，α-螺旋有125處，占總二級結(jié)構(gòu)的34.15%；β折疊有42處，占總二級結(jié)構(gòu)的11.48%；延伸鏈有66處，占總二級結(jié)構(gòu)的18.02%；無規(guī)則卷曲有133處，占總二級結(jié)構(gòu)的36.34%。

2.7 CLW17菌株甘氨酸氧化酶基因thiO的功能

2.7.1thiO基因敲除突變株和回補(bǔ)株的構(gòu)建 通過同源重組技術(shù)獲得thiO基因敲除突變株CLW17ΔthiO，結(jié)果如圖6A所示，3、5、6、7、9泳道擴(kuò)增出的條帶大小約為1399 bp，明顯小于陽性對照CLW17野生株的大小(2488 bp)。將3、5、6、7、9泳道的克隆送測序公司進(jìn)行測序，測序結(jié)果表明thiO基因敲除突變體構(gòu)建成功。

圖6 CLW17ΔthiO和ΔthiO/thiO PCR鑒定

將測序驗證成功的重組載體經(jīng)接合轉(zhuǎn)移導(dǎo)入到CLW17ΔthiO中，通過平板篩選后，挑取單菌落進(jìn)行PCR鑒定，同時以空載體pJN105導(dǎo)入到CLW17ΔthiO為對照，結(jié)果如圖6B所示，以ΔthiO/thiO為模板擴(kuò)增出了目的片段，而以ΔthiO/pJN105為模板，沒有擴(kuò)增出目的片段，證明thiO基因回補(bǔ)株構(gòu)建成功。

2.7.2thiO基因敲除株及回補(bǔ)株草甘膦降解率的測定采用鉬銻抗比色法分別測定CLW17野生菌株、敲除株CLW17ΔthiO及回補(bǔ)株ΔthiO/thiO草甘膦降解率。結(jié)果顯示（表7），CLW17野生株和回補(bǔ)株ΔthiO/thiO對草甘膦降解率分別為72.81%和54.33%，明顯高于thiO基因敲除株CLW17ΔthiO(32.78%)?？梢钥闯觯珻LW17菌株thiO基因敲除后該菌株的降解草甘膦能力有很大降低，但降解草甘膦能力并沒有完全消失。以上結(jié)果表明，thiO基因在該菌株草甘膦降解過程中起著重要作用，結(jié)合CLW17草甘膦降解基因及其降解途徑的預(yù)測，當(dāng)thiO基因缺失時，推測C-P裂解酶直接參與的C-P途徑在其降解過程中發(fā)揮了一定作用，也就是說該菌株存在C-N和C-P兩個降解途徑。

表7 不同菌株草甘膦降解率

3 結(jié)論與討論

草甘膦在造福人類的同時，也帶來了嚴(yán)重的環(huán)境和生態(tài)危害。隨著對草甘膦農(nóng)藥研究的進(jìn)一步深入以及對農(nóng)藥微生物修復(fù)技術(shù)的掌握，生物修復(fù)因低毒、低耗，使其成為了一項具有極大發(fā)展前景的技術(shù)，在草甘膦環(huán)境污染治理方面的作用也越來越突出[9]。

P.fluorescensCLW17是本團(tuán)隊前期分離到的一株多功能細(xì)菌，該菌株具有較強(qiáng)草甘膦耐受能力，能耐受濃度為0.7%的草甘膦，并且在濃度為0.4%的草甘膦培養(yǎng)基中生長旺盛。根據(jù)文獻(xiàn)報道，當(dāng)草甘膦濃度為0.01%時，Burkholderia vietnamiensisAQ5-12對其降解率高達(dá)92.32%[20]；Bacillus subtilisBs-15草甘膦降解率為66.97%[27]；Enterobacter cloacaeK7草甘膦降解率為40%[28]。本研究通過PB試驗和CCD試驗聯(lián)用對影響CLW17菌株降解草甘膦的關(guān)鍵因素進(jìn)行優(yōu)化，在最優(yōu)條件下，該菌株對草甘膦降解率為72.81%，具有較高的草甘膦降解率。全基因組數(shù)據(jù)分析表明，CLW17菌株具有草甘膦降解途徑中重要酶類的編碼基因，如甘氨酸氧化酶，編碼C-P裂解酶的多種多肽。對草甘膦氧化酶途徑中的關(guān)鍵基因，即甘氨酸氧化酶基因thiO進(jìn)行敲除，使得菌株對草甘膦降解率下降到32.78%，明顯低于野生株的72.81%，這表明thiO基因與CLW17菌株對降解草甘膦的能力密切相關(guān)，但該基因敲除后菌株對草甘膦降解能力并沒有完全消失，也暗示著該菌株存在肌氨酸(C-P)途徑。

總之，P.fluorescensCLW17具有草甘膦降解性能，其降解代謝途徑已被推測，并從基因?qū)用孀C實(shí)了該菌株具有草甘膦降解能力。后續(xù)實(shí)驗有望進(jìn)一步驗證其他基因功能，就酶的性質(zhì)，以及各酶之間的關(guān)系等方面進(jìn)行深入研究，以期闡明該菌株降解草甘膦的機(jī)理。

通過本研究的數(shù)據(jù)證明，P.fluorescensCLW17是一株具有極大潛力應(yīng)用價值的生物修復(fù)菌株。此次探究的結(jié)果為有機(jī)磷農(nóng)藥污染的治理提供了重要的理論依據(jù)，同時也為降解草甘膦微生物菌劑的研發(fā)提供了良好的實(shí)驗材料。