趙雅儒，邳 植，劉 蕊，馬語(yǔ)嫣，吳則東

（1黑龍江大學(xué)現(xiàn)代農(nóng)業(yè)與生態(tài)環(huán)境學(xué)院，哈爾濱 150080；2黑龍江省普通高校甜菜遺傳育種重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/黑龍江大學(xué)，哈爾濱 150080；3黑龍江省種業(yè)技術(shù)服務(wù)中心，哈爾濱，150080）

0 引言

糖用甜菜(Beta vulgarisL.)是莧科、甜菜屬植物[1]，是中國(guó)重要的糖料作物之一，其糖分主要在塊根中形成[2]。為了得到優(yōu)質(zhì)的甜菜品種，對(duì)甜菜育種的要求也較為嚴(yán)格，需充分利用現(xiàn)有的甜菜資源進(jìn)行育種，為新品種的培育奠定基礎(chǔ)[3]。ZHUZHZHALOVA等[4]的研究表明，在非生物脅迫條件下進(jìn)行離體培養(yǎng)可培育出具有高抗性的甜菜等基因系，為甜菜在不良種植條件下依然能夠良好生長(zhǎng)提供可能。細(xì)胞質(zhì)雄性不育(CMS)是許多作物雜交育種的重要特性，甜菜的雜交育種也不例外[5]。

育種工作者面臨的首要任務(wù)是不斷的選擇性狀優(yōu)良的植株[6]。SSR分子標(biāo)記已經(jīng)在大豆[7]、玉米[8]、高粱[9]等作物中廣為應(yīng)用。由于SSR分子標(biāo)記具有穩(wěn)定性較好、多態(tài)性高的優(yōu)點(diǎn)，且為共顯性標(biāo)記，所以被廣泛運(yùn)用于作物育種中[10-12]。對(duì)作物進(jìn)行遺傳多樣性研究，能夠?yàn)樽魑镉N提供理論依據(jù)。孫藝琦等[13]通過(guò)SSR分子標(biāo)記技術(shù)分析了蔓荊子基原植物的遺傳多樣性，從而為蔓荊子的種質(zhì)資源提供了保護(hù)策略。徐彪等[14]以品種改良為目的，用分子標(biāo)記法分析了花生的遺傳多樣性，以此提供分子水平上的依據(jù)。

目前，世界上除了少數(shù)國(guó)家還有多胚種外，絕大多數(shù)國(guó)家使用的甜菜品種均為單胚種，而單胚種又大多是以優(yōu)良多胚授粉系為父本，二元不育系為母本雜交而成的三交種，育種家獲得不同的成對(duì)單胚細(xì)胞質(zhì)雄性不育系和保持系的數(shù)量直接決定了育種家能夠得到二元不育系的數(shù)量。本研究所用到的40對(duì)甜菜單胚細(xì)胞質(zhì)雄性不育系和保持系大多是通過(guò)多胚保持系改良而成的，為了得到更多的二元不育系，首先需要更多的遺傳基礎(chǔ)不同的純合不育系和保持系。為達(dá)到這一目標(biāo)，本試驗(yàn)對(duì)課題組現(xiàn)有的40對(duì)甜菜單胚細(xì)胞質(zhì)雄性不育系和保持系利用SSR分子標(biāo)記技術(shù)進(jìn)行分析，了解40對(duì)供試材料的遺傳多樣性，分析不育系與保持系的純度，觀察遺傳距離較大的不育系和保持系的對(duì)數(shù)，以便今后繼續(xù)進(jìn)行回交育種，確定純合度較高的不育系與保持系，為今后配制二元不育系奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)所用的材料為黑龍江大學(xué)甜菜改良團(tuán)隊(duì)的40對(duì)甜菜單胚細(xì)胞質(zhì)雄性不育系與保持系，試驗(yàn)?zāi)父?021年4月種植于黑龍江省哈爾濱市呼蘭區(qū)甜菜研究所試驗(yàn)基地內(nèi)。在種植區(qū)域內(nèi)，除種植材料不同以外，其余條件基本相同。供試材料序號(hào)及名稱見表1，其中HD-CMS1和HD-O1、HD-CMS2和HD-O2為成對(duì)的甜菜單胚細(xì)胞質(zhì)雄性不育系和保持系，以此類推。

表1 80份供試材料序號(hào)及名稱

續(xù)表1

1.2 DNA提取

利用CTAB法提取甜菜基因組DNA，用NanoDrop 2000紫外分光光度計(jì)測(cè)定DNA的純度和濃度，純度的判定以O(shè)D260/OD280的值在1.8～2.0之間為標(biāo)準(zhǔn)。將測(cè)定純度合格的DNA的濃度稀釋至10 ng/μL備用。

1.3 SSR引物篩選

篩選出條帶較清晰的SSR引物。引物序列來(lái)自黑龍江大學(xué)甜菜遺傳育種重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室及參考文獻(xiàn)[15]。SSR引物由上海生工生物工程股份有限公司合成。

1.4 PCR擴(kuò)增

PCR反應(yīng)體系為：總體系為5 μL，其中2.5 μL的2×PCR Master Mix，正反向 Primer(10 μmol/L)各0.2 μL，1 μL DNA模板(10 ng/μL)，最后加去離子水至5 μL。

PCR反應(yīng)程序?yàn)椋海?）94℃預(yù)變性3 min；95℃變性15 s，退火15 s，72℃延伸15 s，35個(gè)循環(huán)；72℃終延伸5 min。（2）Touch down反應(yīng)程序參考邳植等[16]的研究方法進(jìn)行。其中，根據(jù)引物篩選，不同引物所需要的退火溫度不同，見表2。

表2 SSR引物多態(tài)性分析及退火溫度

續(xù)表2

1.5 電泳

采用8%的非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳，在180 V條件下電泳90 min，之后用紅色熒光核酸染料浸染凝膠，用凝膠成像儀觀察條帶并拍照保存。

1.6 數(shù)據(jù)處理與分析

采用人工讀帶，在同一遷移率位置上，有條帶的記為1，無(wú)條帶的記為0[17]；利用Popgene軟件分析有效等位基因數(shù)(Ne)、Shannon’s信息指數(shù)(I)和Nei’s基因多樣性指數(shù)(H)，通過(guò)MEGA 7軟件利用類平均法(UPGMA)構(gòu)建聚類分析圖并計(jì)算供試材料之間的遺傳距離[18-20]。

2 結(jié)果與分析

2.1 SSR引物多態(tài)性分析

通過(guò)篩選，共得到35對(duì)條帶清晰、多態(tài)性較高的SSR引物。每對(duì)SSR引物在80份供試材料中擴(kuò)增得到的條帶數(shù)在2～12之間，平均每對(duì)引物擴(kuò)增條帶數(shù)為5.257；Ne在1.265～4.010之間；I的最大值為1.481，最小為0.364；H最大值為0.751，最小值為0.209。Ne、I、H的平均值分別為2.306、0.891和0.519。

2.2 聚類分析

通過(guò)MEGA軟件得到聚類分析圖，見圖1。結(jié)果表明，除品系22的遺傳距離與其他材料之間的遺傳距離較大，單獨(dú)為一類群；其他供試材料可分為4個(gè)類群，類群Ⅰ中共分為4個(gè)亞類群，其中，有9對(duì)原配組甜菜單胚細(xì)胞質(zhì)雄性不育系與保持系聚合在一起；類群Ⅱ中共包含6份不同的細(xì)胞質(zhì)雄性不育系和保持系；類群Ⅲ中包含3個(gè)亞類群，其中有2對(duì)原配組單胚細(xì)胞質(zhì)雄性不育系與保持系聚合在一起，分別為品系53和54、73和74。類群Ⅳ可分為4個(gè)亞類群，有3對(duì)原配組單胚細(xì)胞質(zhì)雄性不育系與保持系聚合在一起。

圖1 40對(duì)甜菜單胚細(xì)胞質(zhì)雄性不育系與保持系聚類分析圖

2.3 遺傳距離分析

利用MEGA 7軟件計(jì)算80份供試材料的遺傳距離在0.120～0.462之間，其中品系59和61、63和74，即HD-CMS31和HD-CMS30、HD-CMS32和HD-O37的遺傳距離最遠(yuǎn)，為0.462；品系29和30，即HD-CMS15和HD-O15的遺傳距離最近，為0.120。

共計(jì)14對(duì)成對(duì)的甜菜單胚細(xì)胞質(zhì)雄性不育系和保持系聚合在一起，這14份不同的甜菜單胚細(xì)胞質(zhì)雄性不育系之間的遺傳距離有所不同，其中品系11與品系27的遺傳距離為0.304；品系27與品系29、31、35、37之間的遺傳距離分別為0.288、0.337、0.304和0.321；品系31與品系35、47、53之間的遺傳距離分別為0.304、0.359和0.359；品系61、65與品系53之間的遺傳距離分別為0.408和0.348；品系67、69與品系61之間的遺傳距離分別為0.402和0.370；品系73與67的遺傳距離為0.364；品系73與品系77的遺傳距離為0.386。這些遺傳距離較大的不育系與其異型保持系可以配制不同的二元不育系。

3 結(jié)論與討論

3.1 結(jié)論

本試驗(yàn)所用的甜菜單胚細(xì)胞質(zhì)雄性不育系與保持系材料，大多是多胚不育系與保持系改良而來(lái)，用SSR引物分析供試樣本的遺傳多樣性并采用UPGMA法進(jìn)行聚類分析。試驗(yàn)結(jié)果表明，35對(duì)SSR引物的多態(tài)性良好；通過(guò)遺傳多樣性分析，80份甜菜單胚細(xì)胞質(zhì)雄性不育系與保持系的遺傳距離在0.120～0.462之間。聚類結(jié)果顯示，除品系22與其他材料的遺傳距離較大外，其余79份供試材料可分為4大類群；共有14對(duì)原配組細(xì)胞質(zhì)雄性不育系與保持系聚合在一起，說(shuō)明這14對(duì)不育系和保持系之間細(xì)胞核基因組的差異極小，可以直接用于今后的育種。還有26對(duì)未聚合在一起的不育系與保持系遺傳距離大，細(xì)胞核之間還存在著較大的差異，需要繼續(xù)進(jìn)行回交和自交至純合。

3.2 討論

目前中國(guó)現(xiàn)有的甜菜種質(zhì)資源較少，由于甜菜的遺傳基礎(chǔ)較窄，培育出新的甜菜品種較為困難。隨著分子標(biāo)記技術(shù)的發(fā)展，分子標(biāo)記技術(shù)也越來(lái)越受到認(rèn)可，其可靠性及高效性加快了分子育種的研究進(jìn)程，同時(shí)在分子層面上揭示了樣本的親緣關(guān)系和遺傳距離等，因此利用分子標(biāo)記技術(shù)分析作物遺傳多樣性的應(yīng)用越來(lái)越廣泛[21-23]。遺傳多樣性的研究對(duì)選擇具有更優(yōu)組合能力的親本非常重要，可以增加雜交后獲得優(yōu)良基因型的機(jī)會(huì)，通過(guò)了解群體間和群體內(nèi)的親緣關(guān)系，能夠更高效的選擇雜交組合方式，為育種提供進(jìn)一步的理論依據(jù)[24-25]。由于甜菜是無(wú)限花序作物，在之前的田間種植過(guò)程中，可能因?yàn)榭壅植患皶r(shí)或植株間發(fā)生混雜等原因?qū)е峦瑢?duì)不育系與保持系之間不純合。本實(shí)驗(yàn)對(duì)課題組現(xiàn)有的甜菜單胚細(xì)胞質(zhì)雄性不育系與保持系進(jìn)行遺傳多樣性分析，以觀察同對(duì)不育系與保持系之間細(xì)胞核的一致性程度，明確它們的遺傳距離。在今后種植時(shí)，可將聚合在一起的14對(duì)原配組之間遺傳距離大的不育系和其異型保持系作為配制二元不育系的親本，用于雜交育種的研究。未聚合的26對(duì)原配組不育系與保持系之間繼續(xù)進(jìn)行回交與自交，以達(dá)到細(xì)胞核同核的目的，并在今后再次進(jìn)行檢測(cè)。通過(guò)遺傳多樣性分析，加大了培育出甜菜新品種的可能性，同時(shí)可以減少育種工作中的盲目性，有效的提高了甜菜育種效率，奠定了配制二元不育系的基礎(chǔ)。