孫志廣，潘 根，陳庭木，李景芳，趙利君，遲 銘，徐 波，邢運(yùn)高，劉金波，劉曉敏，葛高寧，徐錦濤，王寶祥，徐大勇

（1連云港市農(nóng)業(yè)科學(xué)院/江蘇省現(xiàn)代作物生產(chǎn)協(xié)同創(chuàng)新中心，江蘇連云港 222006；2中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院麻類(lèi)研究所，長(zhǎng)沙 410000；3南京農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，南京 210095；4蘇州農(nóng)業(yè)職業(yè)技術(shù)學(xué)院環(huán)境工程學(xué)院，江蘇蘇州 215026）

0 引言

作物遺傳種質(zhì)是國(guó)家重要的戰(zhàn)略資源，加強(qiáng)種質(zhì)資源保護(hù)與利用是開(kāi)展種源卡脖子技術(shù)攻關(guān)的重要一環(huán)。由于品種審定制度和商業(yè)化育種的需求，許多育種家在水稻育種過(guò)程中過(guò)度追求品種推廣面積，雜交組合集中選用生產(chǎn)上大面積推廣應(yīng)用的品種作為骨干親本，導(dǎo)致育成品種數(shù)量增加的同時(shí)，其遺傳多樣性持續(xù)降低，致使近年來(lái)水稻產(chǎn)量潛力徘徊不前，抗逆能力愈加脆弱[1-3]。多位學(xué)者通過(guò)品種多樣性分析表明各地區(qū)主推品種間遺傳相似性較近，遺傳基礎(chǔ)日趨狹窄[4-6]，因此，在育種過(guò)程中亟待進(jìn)一步拓寬親本選擇范圍，豐富遺傳背景、提高遺傳多樣性。

穞稻是中國(guó)長(zhǎng)江下游特有的具有雜草生長(zhǎng)習(xí)性的稻種資源，曾廣泛分布于江蘇省連云港市云臺(tái)山地區(qū)（北緯34°33′—34°46′，東經(jīng)119°13′—119°30′），不種自生，黑殼長(zhǎng)芒，落粒性極強(qiáng)（種子邊成熟邊落粒，甚至未成熟就落粒），其種子休眠性強(qiáng)，一旦條件適宜即可生長(zhǎng)發(fā)芽，因此得以長(zhǎng)期延存下來(lái)[7]。相比于栽培稻，穞稻的生長(zhǎng)環(huán)境更加惡劣，因此穞稻保留了許多栽培稻沒(méi)有的優(yōu)良性狀，其根系發(fā)達(dá)，分蘗能力強(qiáng)，具有耐寒、耐鹽、耐貧瘠等特性。種子是農(nóng)業(yè)的芯片，而種質(zhì)資源中蘊(yùn)含的優(yōu)異基因則是種子的芯片，雜草稻作為新基因/QTL的重要來(lái)源，通常能更好地適應(yīng)不同的生態(tài)環(huán)境，并能耐受許多生物和非生物脅迫，為栽培稻的培育提供重要的遺傳基礎(chǔ)。充分利用包括穞稻在內(nèi)的雜草稻的優(yōu)良基因?qū)λ居N有著十分重要的價(jià)值。然而由于耕作制度的改變、氣候的變化以及棲息地的減少，穞稻正處于瀕臨滅絕的境地，因此穞稻優(yōu)異性狀的評(píng)價(jià)、利用以及保護(hù)性工作已刻不容緩。

SNP(Single Nucleotide Polymorphism)標(biāo)記是指在基因組上單個(gè)核苷酸變異形成的遺傳標(biāo)記，其多態(tài)性豐富，數(shù)量多且分布廣泛，相比于其他類(lèi)型分子標(biāo)記，更能真實(shí)反映水稻品種間的親緣關(guān)系，可用于水稻種質(zhì)資源的遺傳多樣性分析[8-9]。水稻種質(zhì)資源的遺傳多樣性研究能夠指導(dǎo)水稻育種實(shí)踐，為親本選配、品種鑒定提供幫助，從而促進(jìn)利用MAS技術(shù)培育水稻新品種[10-11]。近年來(lái)，國(guó)內(nèi)外學(xué)者已對(duì)諸多普通野生稻的遺傳多樣性開(kāi)展了大量研究，挖掘了許多優(yōu)異性狀基因，并利用其作為親本培育出多個(gè)優(yōu)良品種或不育系[12-15]。陳成斌等[16]利用廣西野生稻與栽培稻進(jìn)行雜交，在后代中選育出5個(gè)優(yōu)異的穩(wěn)定品系，將廣西藥用野生稻DNA導(dǎo)入到栽培稻‘中鐵31’中培育出高光效糯稻新品種‘桂D1號(hào)’，該品種得到了大面積推廣應(yīng)用；陳明亮等[17]以‘贛香B’為母本，耐冷和耐低氧萌發(fā)的東鄉(xiāng)野生稻為父本進(jìn)行雜交，后通過(guò)連續(xù)回交，在后代中選育出不育性穩(wěn)定野敗型三系不育系贛野A，該不育系敗育徹底，異交結(jié)實(shí)率高，配合力強(qiáng)，具有很強(qiáng)的耐冷性和耐低氧萌發(fā)能力，該不育系于2019年通過(guò)江西省品種審定委員會(huì)審定。相比于此，關(guān)于穞稻的遺傳多樣性研究數(shù)量較少。魏興華[18]于2004年利用30對(duì)SSR標(biāo)記對(duì)穞稻進(jìn)行了分類(lèi)地位鑒定，揭示了穞稻與亞洲栽培稻、栽培稻野生祖先種的親緣關(guān)系，為穞稻優(yōu)良性狀的遺傳利用提供依據(jù)，但此后關(guān)于穞稻遺傳多樣性的研究鮮有報(bào)道。隨著直播稻的大面積推廣，直播稻生產(chǎn)中遇到的關(guān)鍵問(wèn)題日益受到育種家的重視，其中以出苗率低、出苗不齊最為突出。而篩選萌發(fā)耐淹性資源、發(fā)掘耐淹性基因并且選育耐淹性品種被認(rèn)為是解決直播水稻出苗率低的一種有效手段[19]。本研究擬利用SNP標(biāo)記對(duì)包括穞稻在內(nèi)的48份水稻種質(zhì)資源進(jìn)行遺傳多樣性分析，并對(duì)參試材料進(jìn)行萌發(fā)耐淹性鑒定，以期為穞稻優(yōu)良基因的育種利用和種質(zhì)資源創(chuàng)新提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 參試品種

供試種質(zhì)總計(jì)48份，除包含穞稻及其改良系外，還包含19份秈稻、17份粳稻、7份連云港地區(qū)的自生稻以及3份普通野生稻）。其中穞稻由江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院種質(zhì)資源與生物技術(shù)研究所提供，其他資源均來(lái)自本單位水稻種質(zhì)資源庫(kù)（表1）。

表1 參試品種信息

1.2 SNP分型和染色體作圖

選取48份參試種質(zhì)幼苗葉片，參照CTAB法提取水稻基因組DNA[20]，利用華智水稻生物技術(shù)有限公司1K mGPS芯片對(duì)參試材料進(jìn)行全基因組掃描，根據(jù)SNP分型結(jié)果利用MG2C version 2.1(http://mg2c.iask.in/mg2c_v2.1/)進(jìn)行染色體作圖。

1.3 SNP位點(diǎn)的多態(tài)性信息含量分析

利用多態(tài)性信息含量(polymorphism information content,PIC)對(duì)SNP位點(diǎn)的遺傳多樣性進(jìn)行評(píng)價(jià)。按照Powermarker v3.25軟件的格式要求對(duì)芯片分型數(shù)據(jù)進(jìn)行整理并導(dǎo)入計(jì)算，見(jiàn)公式(1)。

其中Pij表示第i個(gè)標(biāo)記第j個(gè)等位變異出現(xiàn)的頻率。

1.4 品種的遺傳多樣性及聚類(lèi)分析

將SNP分型數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)換為[0、1]二元矩陣，應(yīng)用PowerMaker 3.25軟件計(jì)算每個(gè)SNP位點(diǎn)的重要等位基因頻率(major allele frequency,MAF)和基因多樣性指數(shù)(gene diversity index,GD)，利用Minitab 18軟件進(jìn)行每條染色體MAF、GD和PIC箱式圖的繪制，同時(shí)用Nei's方法計(jì)算遺傳距離，采用非加權(quán)配對(duì)算術(shù)平均法(UPGMA)構(gòu)建遺傳關(guān)系樹(shù)狀圖，利用FigTree version 1.4.3進(jìn)行樹(shù)狀圖的修飾和亞群分類(lèi)。

1.5 萌發(fā)耐淹性鑒定

參照孫志廣等[21]的方法進(jìn)行參試種質(zhì)萌發(fā)耐淹性鑒定，以淹水10 cm、萌發(fā)7天的胚芽鞘長(zhǎng)(coleoptile length,CL)為指標(biāo)，對(duì)48份參試種質(zhì)資源進(jìn)行萌發(fā)耐淹性鑒定，隨機(jī)區(qū)組排列，3次重復(fù)，每重復(fù)調(diào)查12粒種子胚芽鞘長(zhǎng)度，精確到1 mm，剔除雙極值后，取3次胚芽鞘長(zhǎng)度平均值作為表型值。利用HemI 1.0軟件，采用Kendall's tau距離的相似度測(cè)度算法，進(jìn)行參試種質(zhì)資源萌發(fā)耐淹性聚類(lèi)分析。試驗(yàn)于2020年12月—2021年3月在連云港市農(nóng)業(yè)科學(xué)院中心實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行。

2 結(jié)果與分析

2.1 多態(tài)性SNP位點(diǎn)的分布

利用1K mGPS水稻SNP芯片對(duì)所有參試種質(zhì)資源進(jìn)行檢測(cè)，共獲得位于水稻12條染色體上的5207個(gè)SNP分型數(shù)據(jù)位點(diǎn)，其中4785個(gè)具有良好的多態(tài)性，比率高達(dá)91.9%。統(tǒng)計(jì)分析顯示，平均每條染色體上分布398.8個(gè)多態(tài)性SNP位點(diǎn)（圖1），其中位于水稻第1染色體上的有572個(gè)，占比11.95%，為所有染色體上最多；第8染色體上最少，總計(jì)310個(gè)，占比6.48%。這些多態(tài)性SNP標(biāo)記相對(duì)均勻的分布在水稻12條染色體上，平均每1 Mb的區(qū)間內(nèi)含有13個(gè)多態(tài)性SNP標(biāo)記，能夠滿(mǎn)足遺傳多樣性分析的需要。

圖1 多態(tài)性SNP位點(diǎn)在水稻染色體上的分布

2.2 SNP位點(diǎn)的多態(tài)性信息含量分析

利用上述4785個(gè)多態(tài)性SNP標(biāo)記在參試水稻種質(zhì)中共檢測(cè)出9570個(gè)等位基因，平均每個(gè)位點(diǎn)檢測(cè)出2個(gè)等位變異，多態(tài)性信息含量(PIC)變化范圍為0.0400～0.5957，中值為0.3639，眾數(shù)為0.0400，平均值為0.3123。多態(tài)性信息含量分布結(jié)果表明，在0.3～0.4范圍內(nèi)的多態(tài)性SNP數(shù)量出現(xiàn)峰值，達(dá)到2020個(gè)（圖2）；主基因頻率(MAF)變化范圍為0.3333～0.9792，中值為0.6667，眾數(shù)為0.5208，平均值為0.6972；基因多樣性指數(shù)(GD)變化范圍為 0.0408～0.6667，中 值 為0.4575，眾數(shù)為0.4965，平均值為0.3839。箱線(xiàn)圖結(jié)果顯示，水稻第2、5染色體上MAF、GD和PIC相對(duì)集中，第8、10和11則相對(duì)離散。在所有染色體中，第6染色體上的MAF中位數(shù)數(shù)值最大，但是GD和PIC數(shù)值最小。值得注意的是，基因多樣性指數(shù)在第2、5染色體上出現(xiàn)異常值，多態(tài)性信息含量在第2、3、5、7染色體上出現(xiàn)較多異常值（圖3）。

圖2 SNP標(biāo)記在48份水稻種質(zhì)中多態(tài)性信息含量(PIC)的分布

圖3 參試種質(zhì)12條染色體上MAF(A)、GD(B)和PIC(C)比較

2.3 遺傳多樣性分析

聚類(lèi)分析結(jié)果表明，參試種質(zhì)被劃分為2大類(lèi)群，即秈稻亞群和粳稻亞群。秈稻亞群由25份種質(zhì)組成，其中18份為來(lái)自中國(guó)不同省份的秈稻品種（品系）、5份為連云港地區(qū)來(lái)源的秈型自生稻，2份為印度來(lái)源常規(guī)秈稻品種(Dular、N22)；粳稻亞群由23份種質(zhì)組成，其中18份為來(lái)自中國(guó)不同省份的粳稻品種（品系）、2份為來(lái)自連云港地區(qū)的粳型自生稻和3份普通野生稻（文昌野生稻、元江野生稻、東鄉(xiāng)野生稻）（圖4）。穞稻及其改良系被分類(lèi)于粳稻亞群中，說(shuō)明穞稻可作為栽培稻尤其是栽培粳稻遺傳改良的優(yōu)異種質(zhì)資源。

圖4 根據(jù)Nei’s遺傳距離的水稻資源UPGMA聚類(lèi)圖

2.4 萌發(fā)耐淹性鑒定

參照聚類(lèi)分析，將所有參試材料分為秈稻亞群和粳稻亞群進(jìn)行萌發(fā)耐淹性鑒定。結(jié)果顯示，在低氧萌發(fā)狀態(tài)下，秈稻亞群的胚芽鞘長(zhǎng)平均值為1.98 cm，而粳稻亞群的胚芽鞘長(zhǎng)平均值為2.70 cm，兩者之間存在極顯著差異（圖5A），說(shuō)明粳稻較秈稻具有更強(qiáng)的萌發(fā)耐淹能力?；诿劝l(fā)耐淹性的聚類(lèi)分析結(jié)果顯示，萌發(fā)耐淹能力最強(qiáng)的4個(gè)種質(zhì)明顯聚為一類(lèi)，這4個(gè)種質(zhì)分別是穞稻改良系、穞稻、SH16311和東鄉(xiāng)野生稻，在淹水條件下它們的平均胚芽鞘長(zhǎng)均超過(guò)3.10 cm。參試秈稻種質(zhì)中萌發(fā)耐淹性最強(qiáng)的為贛73B，其在淹水情況下的胚芽鞘長(zhǎng)度為2.46 cm，在所有參試種質(zhì)中排名第20，這也間接說(shuō)明秈稻萌發(fā)耐淹能力弱于粳稻（圖5B）。值得注意的是，在萌發(fā)耐淹能力最強(qiáng)的4個(gè)資源中有3個(gè)是野生稻或雜草稻，進(jìn)一步說(shuō)明野生稻或雜草稻蘊(yùn)含有較多優(yōu)異性狀，應(yīng)加強(qiáng)對(duì)野生稻或雜草稻有利基因的挖掘和利用。

圖5 參試種質(zhì)資源萌發(fā)耐淹性比較及其聚類(lèi)分析

3 討論與結(jié)論

穞稻是江蘇連云港地區(qū)特有的稻種資源，具有根系發(fā)達(dá)、分蘗能力強(qiáng)、抗旱、耐鹽等優(yōu)良性狀，能夠?yàn)樵耘嗟酒贩N改良和生物技術(shù)研究提供豐富的基因資源，探討江蘇穞稻與秈粳栽培稻的遺傳多樣性對(duì)于指導(dǎo)穞稻的研究和利用有著重要的價(jià)值。1985年，江蘇省農(nóng)科院糧食作物研究所的蔣荷先生已開(kāi)展穞稻特征特性的研究，從根系、莖稈、葉片、生育期、落粒性、休眠性、抗逆性等系統(tǒng)性的對(duì)穞稻進(jìn)行了研究，充分肯定了穞稻的優(yōu)良特征特性，并呼吁加強(qiáng)穞稻的保護(hù)和利用[7]；陳增建等[22]于1990年對(duì)江蘇穞稻的核型進(jìn)行了初步分析，表明穞稻染色體帶型豐富、特征明顯，為穞稻的生物學(xué)特性提供了細(xì)胞遺傳學(xué)方面的證據(jù)；2004年魏興華等[18]利用30對(duì)SSR標(biāo)記比較了穞稻與野生稻以及亞洲栽培稻的遺傳差異，認(rèn)為穞稻是較原始的亞洲栽培稻種粳稻類(lèi)型，這與本研究結(jié)果是一致的，相比于RFLP、AFLP和SSR標(biāo)記，本研究采用的SNP標(biāo)記數(shù)量巨多且分布廣泛，能夠區(qū)分野生稻和栽培稻，也能將秈粳稻區(qū)分開(kāi)，更能真實(shí)反映水稻品種間的親緣關(guān)系。隨著分子生物學(xué)的不斷發(fā)展，基于檢測(cè)全基因組上各堿基變異的全基因組重測(cè)序技術(shù)將逐漸成為遺傳多樣性分析的有效方法。2007年井文等[23]利用秋光/穞稻/秋光BC1F1群體定位了2個(gè)花粉不育性QTL；隨后的2008年，其利用該群體檢測(cè)到4個(gè)控制種子休眠性的QTL和1個(gè)控制抽穗期的QTL[24]；2009年張啟武等[25]比較了穞稻與粳稻恢復(fù)系C堡籽粒灌漿速率，并對(duì)其進(jìn)行遺傳分析。此后，鮮有關(guān)于江蘇穞稻的研究被報(bào)道，由此可見(jiàn)，穞稻的的發(fā)現(xiàn)和研究工作起步并不晚，但是此后真正的保護(hù)和利用工作卻十分滯后。

遺傳多樣性研究對(duì)種質(zhì)資源評(píng)價(jià)和利用具有重要意義，明確江蘇穞稻的遺傳背景，準(zhǔn)確評(píng)估其與栽培稻間的遺傳多樣性，有利于穞稻優(yōu)異基因的挖掘和高效利用。從分子水平上看，PIC數(shù)值越大，物種間遺傳背景差異越大，遺傳多樣性越高。本研究利用4785個(gè)多態(tài)性SNP標(biāo)記進(jìn)行遺傳多樣性分析，PIC平均值為0.3123，介于0.25和0.50之間，按照BOTSTEIN等[26]的理論，參試種質(zhì)資源具有中度的多態(tài)性。此外遺傳多樣性分析能夠準(zhǔn)確區(qū)分秈粳稻，通過(guò)聚類(lèi)分析發(fā)現(xiàn)來(lái)自印度的2個(gè)秈稻品種（Dular和N22）明顯歸為一類(lèi)，說(shuō)明不同地理來(lái)源間種質(zhì)資源遺傳多樣性差異較大，這可能是由于我國(guó)和印度接壤地區(qū)多為高海拔地帶，加之國(guó)界限制，導(dǎo)致兩國(guó)間水稻種質(zhì)資源逐漸形成了不同的遺傳背景。在國(guó)內(nèi)秈稻種質(zhì)中，來(lái)自廣東省的品種被歸為一類(lèi)，表明來(lái)源相同的種質(zhì)在親緣關(guān)系上較近，遺傳差異較小，從一定程度上揭示中國(guó)同一地區(qū)品種遺傳基礎(chǔ)相對(duì)狹窄，亟需引入更多的優(yōu)異基因、拓寬品種的遺傳多樣性。在粳稻亞群里，3個(gè)普通野生稻（文昌野生稻、東鄉(xiāng)野生稻和元江野生稻）在聚類(lèi)分析中和其他粳稻種質(zhì)資源差異較大，親緣關(guān)系較遠(yuǎn)，屬于典型的野生稻種質(zhì)資源。穞稻及其改良系同樣被聚類(lèi)于粳稻亞群中，說(shuō)明從分子水平上看，穞稻更加接近粳稻類(lèi)型，從形態(tài)學(xué)上，通過(guò)比較穞稻的粒型、穎毛，也驗(yàn)證了聚類(lèi)分析的結(jié)果。由于本研究中選用的種質(zhì)資源較少且種類(lèi)不全，尤其是古老地方品種較少，穞稻的起源是由于栽培稻的突變野化還是原始粳稻與野生稻自然雜交的結(jié)果尚需更多的證據(jù)。與普通野生稻不同的是，穞稻和栽培粳稻品種間的親緣關(guān)系相對(duì)較近，但是穞稻較好的保留了普通野生稻的優(yōu)良性狀。由于穞稻和粳稻品種具有良好的親和力，與栽培粳稻配組更易成功，因此更加有利于穞稻優(yōu)良基因在栽培粳稻遺傳改良上的利用。

種質(zhì)資源的遺傳多樣性分析也可以利用表型性狀進(jìn)行。本研究對(duì)參試種質(zhì)進(jìn)行了萌發(fā)耐淹性鑒定，并根據(jù)淹水條件下的胚芽鞘長(zhǎng)度對(duì)參試種質(zhì)進(jìn)行了聚類(lèi)分析。結(jié)果表明，萌發(fā)耐淹能力最強(qiáng)的4個(gè)種質(zhì)均來(lái)自粳稻亞群，在淹水條件下平均胚芽鞘長(zhǎng)均超過(guò)了3.10 cm，遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于其他種質(zhì)，它們中有3個(gè)為野生稻或雜草稻，說(shuō)明野生稻或雜草稻具有較強(qiáng)的萌發(fā)耐淹性，而栽培稻在馴化過(guò)程中丟失了該優(yōu)異等位基因，這可能和野生稻或雜草稻惡劣的生長(zhǎng)環(huán)境相關(guān)，進(jìn)一步說(shuō)明野生稻或雜草稻含有較多的栽培稻所不具有的優(yōu)良性狀等位基因，是栽培稻改良的重要遺傳基礎(chǔ)，因此加強(qiáng)對(duì)野生稻或雜草稻遺傳多樣性研究及其就地保護(hù)工作十分必要。充分利用穞稻等雜草稻不同的遺傳特性，拓寬水稻新品種的遺傳基礎(chǔ)，對(duì)水稻種質(zhì)資源的開(kāi)發(fā)和利用以及突破性重大品種的創(chuàng)制具有非常重要的現(xiàn)實(shí)意義。

本研究利用SNP分子標(biāo)記技術(shù)對(duì)48份參試種質(zhì)資源進(jìn)行遺傳多樣性分析，并通過(guò)UPGMA法根據(jù)遺傳距離進(jìn)行聚類(lèi)分析。結(jié)果表明SNP可以有效用于供試材料的遺傳多樣性分析，參試種質(zhì)多態(tài)性信息含量(PIC)平均值為0.3123，基因多樣性指數(shù)(GD)的平均值為0.3839，表明參試種質(zhì)具有中度的多態(tài)性。聚類(lèi)分析將穞稻劃分于粳稻亞群，說(shuō)明穞稻與粳稻具有較近的親緣關(guān)系。表型鑒定結(jié)果表明，穞稻具有很強(qiáng)的耐低氧萌發(fā)能力。本研究為穞稻優(yōu)異基因的挖掘和創(chuàng)新利用提供理論參考。