沈林華

紹興第二醫(yī)院呼吸內(nèi)科，浙江紹興 312000

銅綠假單胞菌（Pseudomonas aeruginosa，PA）感染是醫(yī)院感染的常見(jiàn)類(lèi)型之一，其檢出率高、耐藥性強(qiáng)及致死率高等特點(diǎn)導(dǎo)致PA感染性肺炎治療難度大，患者預(yù)后差，病死率高。目前PA感染性肺炎已成為臨床醫(yī)學(xué)抗感染領(lǐng)域亟待解決的棘手問(wèn)題[1,2]。隨著抗菌藥物的問(wèn)世，臨床上有效解決了感染問(wèn)題，但其不合理應(yīng)用也導(dǎo)致細(xì)菌耐藥性問(wèn)題日益嚴(yán)重，近年來(lái)耐碳青霉烯類(lèi)銅綠假單胞菌（carbapenem–resistantPseudomonas aeruginosa，CRPA）的檢出率呈增高趨勢(shì)，甚至出現(xiàn)多重耐藥銅綠假單胞菌（multi–drug resistancePseudomonas aeruginosa，MDRPA）和泛耐藥銅綠假單胞菌（pan–drug resistancePseudomonas aeruginosa，PDRPA），大大增加了臨床對(duì)感染患者的治療難度。因此，對(duì)醫(yī)院PA感染發(fā)生率和耐藥菌進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，有利于臨床合理選擇治療方案[3,4]。PA感染性肺炎患者常伴有不同程度的肺損傷，常出現(xiàn)咯血、胸痛、低熱和呼吸困難等癥狀，肺毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞和肺泡上皮細(xì)胞損傷造成彌漫性肺間質(zhì)及肺泡水腫，導(dǎo)致的急性低氧性呼吸功能不全或呼吸衰竭，損傷到一定程度會(huì)出現(xiàn)急性呼吸窘迫綜合征[5-7]。嚴(yán)重的肺損傷不僅加重PA感染性肺炎患者的感染概率，還嚴(yán)重影響患者康復(fù)，因此對(duì)感染患者發(fā)生肺損傷進(jìn)行早期預(yù)測(cè)并及時(shí)干預(yù)具有重要的臨床意義。研究表明，肺表面活性物質(zhì)能夠降低肺泡表面張力，肺表面活性物質(zhì)蛋白B（surfactant protein B，SP–B）是肺表面活性物質(zhì)發(fā)揮功能的重要載體，其基因多態(tài)性是引起新生兒急性呼吸窘迫綜合征的重要因素，同時(shí)與肺部疾病易感性有關(guān)[8,9]。因此本研究通過(guò)分析SP–B基因多態(tài)性與PA感染性肺炎患者肺損害間的關(guān)系，擬通過(guò)SP–B基因多態(tài)性對(duì)患者是否發(fā)生肺損傷進(jìn)行預(yù)判。

1 資料與方法

1.1 一般資料

回顧性分析2019年8月至2021年8月紹興第二醫(yī)院收治的102例肺炎患者的臨床資料，根據(jù)是否感染PA分成PA組（n=36）和非PA組（n=66）。兩組患者年齡、性別和病程等一般資料比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），具有可比性。納入標(biāo)準(zhǔn)：①參照《急性肺損傷/急性呼吸窘迫綜合征診斷與治療指南（2006）》[10]中肺損傷的診斷標(biāo)準(zhǔn)，確診為肺損傷；②經(jīng)病原菌檢測(cè)確診為PA感染，痰培養(yǎng)至少連續(xù)2次為PA，且半定量均為（+++）以上；③無(wú)抗生素過(guò)敏史。排除標(biāo)準(zhǔn)：①合并肺水腫、肺栓塞等其他肺部疾病；②嚴(yán)重肝、腎等重要器官功能不足；③合并其他感染性疾??；④惡性腫瘤患者；⑤臨床資料不完整者。

1.2 方法

1.2.1 菌株鑒定和藥敏試驗(yàn) 依據(jù)《全國(guó)臨床檢驗(yàn)操作規(guī)程（第2版）》[11]，按要求分離致病菌菌株，觀察菌落生長(zhǎng)狀況。采用法國(guó)生物梅里埃有限公司的VITEK32 全自動(dòng)微生物分析儀鑒定菌株，質(zhì)控菌株金黃色葡萄球菌（ATCC 29213）、大腸埃希菌（ATCC 25922）和銅綠假單胞菌（ATCC 27853）均購(gòu)自國(guó)家衛(wèi)生健康委臨床檢驗(yàn)中心。采用K–B紙片擴(kuò)散法檢測(cè)菌株對(duì)常用抗菌藥的敏感性，按照2019年版臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化協(xié)會(huì)的標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行藥敏結(jié)果判讀。

1.2.2 DNA提取 采集所有研究對(duì)象外周靜脈血標(biāo)樣3ml，加入乙二胺四乙酸（ethylenediamine tetraacetic acid，EDTA））抗凝，離心分離血漿，常規(guī)酚–氯仿法從外周血白細(xì)胞中提取基因組DNA，嚴(yán)格按照外周血DNA提取試劑盒（北京百奧森泰生物技術(shù)有限公司）說(shuō)明書(shū)操作，將提取出的DNA樣本放置于–20℃低溫箱備用。

1.2.3 合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)–限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性分析 根據(jù)GeneBank數(shù)據(jù)庫(kù)提供的基因序列設(shè)計(jì)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）引物[12]（上海碧云天生物技術(shù)有限公司），反應(yīng)總體積10μl。

SP–B基因1580 C/T位點(diǎn)PCR反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性5min、95℃變性45s、65.5℃退火45s、72℃延伸1min，重復(fù)變性、退火和延伸3個(gè)步驟5個(gè)循環(huán)，每個(gè)循環(huán)退火溫度降低0.5℃，95℃變性45s，59.5℃退火45s、72℃延伸1min，再重復(fù)變性、退火和延伸3個(gè)步驟30個(gè)循環(huán)，72℃延伸10min。

引物序列：F：5’–CTCGAATTCCGTGAACTCC AGCACCACCC–3’，R：5’–GTGAGCTTGCAGCCCTC TCA–3’，270bp，內(nèi)切酶為DdeⅠ。SP–B基因8714 G/C位點(diǎn)PCR反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性5min、95℃變性45s、63.5℃退火45s、72℃延伸1min，重復(fù)變性、退火和延伸3個(gè)步驟5個(gè)循環(huán)，每個(gè)循環(huán)退火溫度降低0.5℃，95℃變性45s，57.5℃退火45s、72℃延伸1min，再重復(fù)變性、退火和延伸3個(gè)步驟30個(gè)循環(huán)，72℃延伸10min。引物序列：F：5’–CTCGAATTCAGGACA TACACACAGTCCT–3’。R：5’–CCAGCTGAGCTTTC AGCAGA–3’，784bp，內(nèi)切酶為HinfⅠ。

產(chǎn)物用1.5%～3.0%瓊脂糖凝膠電泳1h，自動(dòng)凝膠成像系統(tǒng)分析。

1.2.4 肺功能測(cè)定 采用日本MINATO AS507肺功能檢查儀測(cè)定肺功能，記錄記錄用力肺活量（forced vital capacity，F(xiàn)VC）、一秒鐘用力呼氣容積（forced expiratory volume in one second，F(xiàn)EV1）和FEV1/FVC；意大利科時(shí)邁PET型肺功能儀測(cè)定患者一氧化碳彌散值（diffusing capacity of the lung for carbon monoxide，DLCO），記錄DLCO占預(yù)計(jì)值的百分比[（DLCO（%）]；使用PERIFLUX經(jīng)皮血氧分壓監(jiān)測(cè)儀檢測(cè)患者血氧分壓（blood oxygen partial pressure，PaO2）。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 21.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理分析，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，組間比較采用t檢驗(yàn)，Hardy–Weinberg平衡檢驗(yàn)樣本的群體代表性，頻率比較采用χ2檢驗(yàn)；P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 PA感染情況

102例肺炎患者共檢出PA36株，占肺炎患者35.29%；檢測(cè)結(jié)果為CRPA感染6例，占PA感染患者的16.67%；檢測(cè)結(jié)果為MDRPA感染12例，占PA感染患者的33.33%；檢測(cè)結(jié)果為PDRPA感染2例，占PA感染患者的5.56%。各年度PA感染率以及CRPA、MDRPA和PDRPA發(fā)生率比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。

2.2 36株P(guān)A抗菌療效分析

36例PA感染患者對(duì)氨芐西林全部耐藥，其次為阿莫西林和美羅培南；36例PA感染患者對(duì)環(huán)丙沙星和妥布霉素敏感，見(jiàn)表1。

表1 36株P(guān)A抗菌療效分析

2.3 肺炎患者SP–B基因1580位點(diǎn)基因多態(tài)性

樣本群體代表性符合Hardy–Weinberg平衡檢驗(yàn)，PA組1580位點(diǎn)基因型TT、TC和CC的分布頻數(shù)與非PA組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），等位基因T的頻率明顯低于非PA組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），見(jiàn)表2。

表2 肺炎患者SP–B基因1580位點(diǎn)基因多態(tài)性

2.4 肺炎患者SP–B基因8714位點(diǎn)基因多態(tài)性

樣本群體代表性符合Hardy–Weinberg平衡檢驗(yàn)，PA組8714位點(diǎn)基因型GG、GC和CC的分布頻數(shù)與非PA組比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）；等位基因G的頻率低于非PA組，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=1.445，P=0.486），見(jiàn)表3。

表3 肺炎患者SP–B基因8714位點(diǎn)基因多態(tài)性

2.5 SP–B基因1580位點(diǎn)不同基因型患者肺功能水平比較

根據(jù)位點(diǎn)多態(tài)性研究結(jié)果，選擇位點(diǎn)多態(tài)性具有顯著差異性的SP–B基因1580位點(diǎn)進(jìn)行肺功能水平研究，研究對(duì)象為PA組患者。SP–B基因1580位點(diǎn)CC、CT和TT基因型患者肺功能水平比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），TT基因型患者PaO2、DLCO和FEV1/FVC明顯高于CT和TT基因型患者，F(xiàn)VC、FEV1明顯低于CT和TT基因型患者，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），見(jiàn)表4。

表4 SP–B基因1580位點(diǎn)不同基因型患者肺功能水平比較（±s）

表4 SP–B基因1580位點(diǎn)不同基因型患者肺功能水平比較（±s）

注：△1mmHg=0.133kPa

3 討論

我國(guó)醫(yī)院感染病原菌仍以PA、克雷伯菌和腸桿菌屬等革蘭陰性菌為主，因此對(duì)感染病原菌特征和耐藥性進(jìn)行研究對(duì)指導(dǎo)臨床合理用藥、規(guī)避耐藥風(fēng)險(xiǎn)具有重要意義[13]。PA感染性肺炎患者和普通肺炎患者的SP–B基因多態(tài)性與ARDS等肺損傷疾病被認(rèn)為與基因突變有關(guān)，主要由于缺乏肺表面活性物質(zhì)。SP–B是構(gòu)成肺表面活性物質(zhì)的重要蛋白，其含量和活性的改變會(huì)對(duì)肺功能產(chǎn)生影響進(jìn)而引起肺部相關(guān)疾病，影響疾病進(jìn)展[14-16]。

本研究結(jié)果顯示，PA感染性肺炎患者占肺炎患者的35.29%，其中CRPA感染占總感染人數(shù)的16.67%，MDRPA感染占總感染人數(shù)的33.33%，PDRPA感染占總感染人數(shù)的5.56%，說(shuō)明PA是醫(yī)院獲得性感染病原菌中的重要組成部分。此外，PA感染患者往往存在多重耐藥的特征，是臨床治療困難的重要因素。通過(guò)對(duì)PA感染患者進(jìn)行耐藥性分析，36例PA感染患者對(duì)氨芐西林全部耐藥，其次為阿莫西林和美羅培南，說(shuō)明PA感染患者對(duì)β–內(nèi)酰胺類(lèi)抗生素和碳青霉烯類(lèi)抗生素耐藥性較高。郭咸希等[17]對(duì)133例痰培養(yǎng)PA陽(yáng)性患者抗菌藥物應(yīng)用分析的研究顯示，PA對(duì)氨芐西林、阿莫西林和復(fù)方磺胺甲唑等抗菌藥物完全耐藥，亞胺培南和美羅培南的耐藥性也超過(guò)50%，與本研究基本一致。此外，本研究中36例PA感染患者對(duì)環(huán)丙沙星和妥布霉素敏感率超過(guò)60%，說(shuō)明PA感染患者對(duì)氟喹諾酮類(lèi)和氨基糖苷類(lèi)抗生素較敏感，提示臨床可以使用這類(lèi)抗生素予以治療，但其用法用量仍需結(jié)合實(shí)際情況。既往研究顯示，PA對(duì)慶大霉素、頭孢吡肟、環(huán)丙沙星和左氧氟沙星等抗生素的耐藥性低于20%[18]，與本研究部分一致。

SP–B基因具有高度多態(tài)性，其各區(qū)段包含多個(gè)單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)，既往研究已證實(shí)SP–B基因多態(tài)性能夠引起急性呼吸窘迫綜合征、慢性阻塞性肺疾病和先天性肺泡沉積癥等多種疾病[19-21]。本研究結(jié)果顯示，PA組SP–B基因1580位點(diǎn)基因型TT、TC和CC的分布頻數(shù)與非PA組具有顯著差異，PA組患者等位基因T的頻率明顯低于非PA組；SP–B基因8714位點(diǎn)基因型GG、GC和CC的分布頻數(shù)與非PA組無(wú)顯著差異，等位基因G的頻率低于非PA組，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，說(shuō)明SP–B基因1580位點(diǎn)和8714位點(diǎn)多態(tài)性與患者是否對(duì)PA易感有關(guān)。根據(jù)位點(diǎn)多態(tài)性研究結(jié)果，選擇位點(diǎn)多態(tài)性具有顯著差異性的SP–B基因1580位點(diǎn)進(jìn)行肺功能水平的研究，結(jié)果顯示SP–B基因1580位點(diǎn)CC、CT和TT基因型肺功能水平有顯著差異，TT基因型患者PaO2、DLCO和FEV1/FVC明顯高于CT和TT基因型患者，F(xiàn)VC、FEV1明顯低于CT和TT基因型患者。研究顯示，在肺功能不全人群中SP–B前蛋白表達(dá)水平較高，說(shuō)明其水平與肺功能具有一定關(guān)聯(lián)[22-24]。SP–B基因1580位點(diǎn)C/T等位基因變化可以改變蛋白氨基末端糖基化位點(diǎn)，進(jìn)而影響SP–B蛋白分泌、加工和折疊，導(dǎo)致蛋白質(zhì)功能上的改變。有研究顯示，SP–B基因1580位點(diǎn)C等位基因是急性呼吸窘迫綜合征易感因素[25]。本研究結(jié)果顯示，肺功能水平越差的患者T等位基因頻率明顯降低，意味著C等位基因頻率明顯升高，C等位基因的明顯升高使患者對(duì)肺損傷疾病易感，與既往研究結(jié)果一致。SP–B基因8714位點(diǎn)位于編碼區(qū)外，其基因多態(tài)性對(duì)肺損傷易感性可能不具有顯著影響，但該位點(diǎn)等位基因變化仍舊能夠引起SP–B mRNA穩(wěn)定性下降。從既往研究結(jié)果看，GG基因型在巴西白種人急性呼吸窘迫綜合征患者中分布頻率明顯升高[26]，因此認(rèn)為G等位基因是急性呼吸窘迫綜合征易感基因，本研究結(jié)果也顯示肺功能水平較差的患者G等位基因增高，但可能受樣本量因素影響，致使PA組與非PA組差異不顯著。綜合SP–B基因1580位點(diǎn)和8714位點(diǎn)結(jié)果來(lái)看，這種基因多態(tài)性可能導(dǎo)致患者肺組織中SP–B蛋白水平和功能上的變化，可能與ARDS等肺損傷疾病的發(fā)生、發(fā)展有關(guān)，而SP–B基因1580位點(diǎn)和8714位點(diǎn)多態(tài)性與患者對(duì)PA易感有關(guān)和肺損傷程度有關(guān)，肺功能越差的患者和PA感染患者SP–B基因1580位點(diǎn)C等位基因頻率均明顯升高（T等位基因頻率明顯降低），SP–B 8714位點(diǎn)G等位基因均降低，因此可以初步推測(cè)PA感染性肺炎患者其肺損傷可能性越高。

綜上所述，PA感染性肺炎患者SP–B基因多態(tài)性與其肺部疾病進(jìn)展具有一定關(guān)聯(lián)，臨床可以通過(guò)聯(lián)合檢測(cè)患者SP–B基因多態(tài)性對(duì)PA感染性肺炎患者是否發(fā)生ARDS等進(jìn)行預(yù)測(cè)以指導(dǎo)臨床治療，通過(guò)合理規(guī)避肺部感染和肺部進(jìn)一步損傷的危險(xiǎn)因素以阻止肺損傷發(fā)生發(fā)展。本研究不足之處在于樣本數(shù)量有限，無(wú)法涵蓋所有可能性。同時(shí)，本研究?jī)H初步建立SP–B基因的幾個(gè)代表性位點(diǎn)與PA感染性肺炎患者肺損傷進(jìn)展之間的聯(lián)系，更多相關(guān)的基因多態(tài)性研究還需其他更深入的研究，不同地區(qū)、不同科室的病原菌分布和耐藥性可能會(huì)出現(xiàn)較大差異，臨床仍應(yīng)以實(shí)際情況為主要原則指導(dǎo)用藥。