李少麗 ， 王家福 ， 康 斌 ， 李建林 ， 尹忠良

(杭州佑本動物疫苗有限公司 ， 浙江 杭州 310018)

非洲豬瘟(African swine fever，ASF)是豬的一種高度接觸性、急性出血性傳染病，是世界動物衛(wèi)生組織(OIE)法定報告的七類動物疫病之一，其病原為非洲豬瘟病毒(African swine fever virus，ASFV)，屬于非洲豬瘟病毒家族唯一成員，是一種基因組為170～193 kb、編碼150多種蛋白的雙鏈DNA病毒[1]。ASF最初于1921年在肯尼亞被發(fā)現[2]，之后在非洲撒哈拉沙漠以南、撒丁島和意大利地區(qū)作為一種地方性疾病零星散發(fā)，2007年在格魯吉亞發(fā)生[3]，2017年傳播到包括俄羅斯在內的周邊鄰國，2018年在中國、韓國暴發(fā)[4-5]，2019年在越南暴發(fā)[6]，全球大范圍ASF的暴發(fā)加大了養(yǎng)豬業(yè)防控ASF的難度。目前，國內外還沒有任何商品化疫苗批準上市，豬場主要通過加強生物安全，早發(fā)現、早排查、精準剔除等措施進行防控。

1 ASF弱毒疫苗研究進展

ASFV感染存活的豬可抵抗同種病原的感染，提示學者們開發(fā)ASF疫苗也許可對該病產生很好的控制，實際上自ASF發(fā)生以來，關于ASF疫苗的研究從未間斷。然而傳統的滅活疫苗、重組蛋白疫苗、DNA疫苗和DNAs/蛋白組合疫苗的免疫效果均不理想，因此，人們將焦點轉向ASF弱毒活疫苗，無論是自然分離弱毒株還是基因工程弱毒株，當ASFV毒力充分致弱的情況下，可對同源甚至異源毒株產生一定的攻毒保護。

人工致弱的ASFV毒株大多是采用基因工程技術敲除其毒力基因構建的，目前研究較多的ASFV毒力相關基因有MGF505-1R、MGF505-2R、MGF505-3R、MGF360-12L、MGF360-13L、MGF360-14L、CD2v、9GL、DP148R、UK、TK和NS-L等。CD2v(也稱EP402R)基因編碼ASFV血凝素。Monteagudo等[7]以強毒力BA71毒株為親本毒株，敲除CD2v后構建BA71ΔCD2，在COS-1細胞上連續(xù)傳20代，收獲上清制備疫苗，其免疫原性和保護效果與用豬肺泡巨噬細胞(Porcine alveolar macrophage，PAM)培養(yǎng)所制備的疫苗無明顯差異；BA71ΔCD2制備的疫苗接種6～8周齡試驗豬，不僅可以抵抗致死量BA71的攻擊，還可抵抗致死量異源毒株E75(也是I型)的攻擊，推斷出這種交叉保護與BA71ΔCD2引起的可同時識別BA71和E75病毒的CD8+T細胞的產生有關。然而，不是所有缺失CD2v基因的ASFV制備的疫苗都能達到良好的免疫效果。Borca等[8]將缺失CD2v基因的ASFV Georgia 2010毒株接種外周血單個核細胞(Peripheral blood mononuclear cell，PBMC)，半數血球吸附量(50% hemadsorbing doses，HAD50)試驗未出現紅細胞吸附現象，但以102～104TCID50/mL的劑量鼻腔接種試驗豬與親本毒株試驗豬表現出相似的病毒血癥和臨床癥狀，表明敲除CD2v基因只能稍微減弱ASFV Georgia 2010毒株的毒力。Chen等[9]構建了多基因家族MGF360-505R、CD2v和MGF360-505R聯合缺失的重組病毒，在PAM上制備和純化后，接種7周齡SPF豬，并用親本毒株HLJ/2018進行攻毒，結果以103和105TCID50/mL的HLJ/18-6GD和HLJ/18-7GD(以HLJ/18為骨架構建的6基因缺失株和7基因缺失株)免疫的試驗豬均能存活，并可抵抗200個豬半數致死劑量(PLD50)HLJ/18的攻擊。此外，將HLJ/18-6GD和HLJ/18-7GD兩個重組病毒分別在豬體內連續(xù)傳5代，結果，HLJ/18-6GD傳至第4代時在豬體內復制能力增強，其中1頭豬在第5次傳代后11 d死亡，提示病毒毒力返強風險較高；而HLJ/18-7GD則比較安全，將HLJ/18-7GD接種妊娠母豬后未使母豬產生明顯的繁殖障礙，安全性試驗和毒力性試驗結果均表明HLJ/18-7GD具有作為ASFV疫苗候選株的可行性，目前該重組疫苗正在進行商品育肥豬的臨床試驗，不同劑量接種組免疫保護率均在80%以上。

Zsak等[10]用強毒力毒株E70和2株Vero細胞適應的ASFV毒株(MS16和BA71V)感染PAM，結果顯示E70可以在PAM上復制，在感染后48 h病毒滴度可達107TCID50/mL，而MS16和BA71V感染后檢測不到病毒滴度，但這2種毒株在Vero細胞上可以正常復制，基因序列分析顯示，MS16 和 BA71V2這2種病毒缺乏MGF360和MGF530基因，表明這2種基因可促進病毒在巨噬細胞中繁殖，在決定病毒宿主范圍中起關鍵作用。Reis等[11]以Benin 97/1為骨架，構建可以調節(jié)I型干擾素(IFN)的MGF360和MGF530/505雙基因缺失的重組病毒Benin△MGF，免疫試驗豬后用致死量Benin 97/1攻擊，結果所有試驗豬均在接種5～6 d后出現一過性發(fā)熱，無任何其他臨床癥狀，而OURT88/3毒株同樣缺失這2種基因接種試驗豬后，有3/4的豬產生攻毒保護，表明不同分離株缺失MGF360和MGF530/505這2種基因后的效果不同。另外，Benin△MGF接種試驗豬5～7 d后血清中分泌IFN-γ的細胞數量增多，而接種OURT88/3后相應細胞數量增多不明顯，因此，推測保護性免疫反應可能與誘導的T細胞反應不同有關。

另外，也有將ASFV的DP148R、TK、NS-L基因缺失構建重組病毒的報道。DP148R是ASFV感染早期轉錄的基因，Reis等[12]將ASFV強毒株 Benin 97/1敲除DP148R基因構建重組病毒接種豬骨髓細胞(Porcine bone marrow cell，PBM)，并于接種后24、48、72 h和96 h取樣檢測病毒滴度，發(fā)現Benin△DP148R與Benin 97/1表現出幾乎相同的生長曲線，Benin△DP148R在接種后24～48 h病毒滴度可達106TCID50/mL，重組病毒在豬巨噬細胞上的復制能力沒有明顯降低。然而，Benin△DP148R對豬的致病力卻明顯降低，Benin△DP148R接種的所有豬全部存活，表明DP148R雖不是病毒復制必需基因，但在宿主的免疫防護中起關鍵作用。ASFV在感染細胞的胞質內復制并合成病毒DNA復制所需要的各種酶基因，如胸腺激酶基因(TK基因)。Moore等[13]將ASFV Malawi毒株的TK基因敲除后制備重組病毒，重組病毒在Vero細胞上生長良好但在豬巨噬細胞上的生長受到抑制，接種重組病毒的試驗豬只出現短暫的發(fā)熱和較低的死亡率，重組病毒對豬的致病力降低，再用親本毒株攻擊試驗豬未出現ASFV典型癥狀，表明TK基因是ASFV在豬巨噬細胞復制的必需基因，也是ASFV的毒力基因。Zsak等[14]以ASFV E70毒株為骨架，缺失高度保守的NL-S基因構建重組病毒，結果NL-S基因的缺失并未影響重組病毒在豬巨噬細胞或Vero細胞上的復制，但對豬的致病力卻明顯降低，表明NL-S基因是ASFV復制的非必需基因，也是ASFV的毒力基因。

ASFV有24種基因型，基因組龐大且大部分功能未知，據目前研究結果可以看出，影響病毒毒力的基因不止一種，不同毒株即使缺失相同的毒力基因產生的致病效果也可能不同，因此，構建多基因缺失的重組病毒也許是開發(fā)活疫苗候選毒株比較好的選擇。

2 ASFV適應細胞的研究進展

目前，ASFV活疫苗制備和商業(yè)化生產的主要問題是缺乏支持重組病毒復制并保持良好免疫原性的細胞系。單核巨噬細胞、包括肺泡巨噬細胞在內的組織巨噬細胞和豬骨髓細胞是ASFV感染豬的主要靶細胞，它們在抗原提呈、細胞因子分泌和吞噬過程的免疫反應中起重要作用[15-16]。King等[17]將ASFV弱毒株OURT/88/3在豬骨髓巨噬細胞中培養(yǎng)，Gallardo等[18]將NH/68毒株在PAM細胞中培養(yǎng)，兩者均可對異源強毒株UG65的攻擊產生100%保護。Genovesi等[19]在豬骨髓細胞和血液單核/巨噬細胞的培養(yǎng)液中加入鼠源集落刺激因子(CSF-1)，可使具有典型單核巨噬細胞形態(tài)和功能的巨噬細胞數量增加，加入CSF-1的試驗組與對照組相比，在接種ASFV后的病毒滴度和細胞病變增強，表明CSF-1可增加ASFV對細胞的敏感性，并延長細胞在體外的存活時間。

雖然用豬的原代細胞PBMC或PAM接種ASFV重組病毒與自然感染途徑非常相似，有利于研究ASFV和宿主細胞之間關系，但這些細胞制備繁瑣、批次間差異大、從動物中提取細胞成本高，限制了疫苗抗原的規(guī)?；慨a。為此，研究學者曾嘗試用已建立的細胞系培養(yǎng)ASFV。Krug等[20]將ASFV Georgia07毒株在Vero細胞上傳110代后，病毒在家豬體內的復制能力喪失。Balysheva等[21]發(fā)現，ASFV的Stavropol 01/08毒株在A4C2/9K細胞中繁殖33代后喪失了致病性。Gallardo等[18]和Sánchez等[22]將弱毒株NH/P68在COS-7細胞上培養(yǎng)后，其對試驗豬的免疫保護力降低至33%，但在野豬肺(Wild boar lung，WSL)細胞上傳代后仍可感染豬并在豬體內繁殖。Krug等[20]將豬脾臟中分離的ASFV-G毒株在Vero細胞上傳110代，比較ASFV-G毒株與細胞適應毒株在Vero細胞和豬巨噬細胞上的繁殖能力，結果顯示，隨著傳代次數的增加，ASFV-G對Vero細胞的適應能力逐漸增強，病毒滴度可達107TCID50/mL以上，相反，在豬巨噬細胞上的繁殖能力下降，至第110代毒株的毒力完全喪失，而用細胞適應毒株免疫試驗豬后不能保護ASFV-G的攻擊；基因序列分析顯示，ASFV對PAM細胞感染力的喪失可能是由于在Vero細胞傳代過程中缺失了MGF360和MGF505基因所致。Carrascosa等[23]對ASFV在肺泡細胞、單核細胞和Vero細胞中的產量進行了比較，得出采用單層培養(yǎng)時，PBMC或者PAM感染ASFV后產生的病毒粒子要比感染Vero細胞高出10倍；未經任何處理的懸浮培養(yǎng)的PAM細胞比卡介苗(BCG)處理過的細胞所產病毒粒子量略少，但相差不多；雖懸浮培養(yǎng)的PAM細胞比貼壁方式產生的病毒粒子略少，但相比單層培養(yǎng)，懸浮培養(yǎng)系統更簡便，更容易獲得大量細胞；此外，PBMC比PAM雖產生稍多的病毒粒子，但PBMC不容易獲得。因此，PAM的懸浮培養(yǎng)也許是可進行ASFV規(guī)模化放大培養(yǎng)的良好系統。值得關注的是，近期，日本學者Masujin等[24]在豬原代腎巨噬細胞中利用慢病毒載體引入SV40T基因和豬端粒酶逆轉錄酶基因，建立了永生化的豬腎巨噬細胞系(Immortalized porcine kidney macrophages，IPKM)，結果顯示，IPKM細胞系對ASFV強毒力毒株Armenia07、Kenya05/Tk-1和Espana75以及人工致弱毒株Lisbon60V均易感，且可產生明顯的細胞病變，推測IPKM也許可感染各種毒力和基因型的ASFV分離株。Portugal等[25]開發(fā)的豬巨噬細胞系(Zuckermann macrophage-4，ZMAC-4)對多種ASFV野毒分離株易感，ASFV致弱毒OURT88/3在ZMAC-4細胞上具有與在豬原代骨髓細胞上相似的感染動力學曲線和病毒滴度，且OURT88/3病毒在ZMAC-4細胞上傳12代不改變該毒株的免疫原性，因此，ZMAC-4細胞可能是研究ASFV繁殖的良好選擇。

綜上，采用現有猴源腎細胞系如Vero、COS-1、COS-7等培養(yǎng)ASFV或其重組病毒，雖操作簡便，容易規(guī)?；囵B(yǎng)，但就目前研究結果看，傳代容易引起某些基因缺失和移碼突變，進而導致病毒復制力或免疫原性改變。而豬源原代細胞(如PAM、PBMC和PBM等)雖容易培養(yǎng)各種ASFV分離株和重組病毒，并能保持病毒的免疫原性，但制備繁瑣、批次間差異大、不易規(guī)?；囵B(yǎng)，同時還涉及到動物福利，也限制了其規(guī)?；慨a。對于新開發(fā)的IPKM和ZMAC-4細胞及其他正在研究中的細胞系，需持續(xù)關注和進一步探究其作為病毒復制候選載體的可行性。

3 展望

非洲豬瘟為我國一類動物疫病，非洲豬瘟相關疫苗研究工作必須在P3及以上生物安全等級實驗室獲批開展，而目前包括我國在內的其他國家均未見批準上市銷售使用的非洲豬瘟疫苗。我國農業(yè)農村部獸醫(yī)局專家強調，所謂“非洲豬瘟中試苗、自家苗，甚至走私苗”，沒有通過科學、客觀、嚴格的評審評價，其安全性和有效性都無法保證，特別是活疫苗，更可能存在不可預知的生物安全風險，違規(guī)使用不僅控制不了非洲豬瘟疫情，反而會造成病毒擴散，擴大病毒污染面，進而干擾非洲豬瘟防控工作。因此，在當前形勢下，養(yǎng)殖場(戶)加強豬場的生物安全防護水平，提高自主防護意識，是最現實且最經濟有效的選擇。當然，我們也希望安全性更高、免疫效果確實的非洲豬瘟疫苗能夠盡早批準上市，造福養(yǎng)殖業(yè)。