孟 欣 ， 孫大慶 ， 康元環(huán) ， 張冬星 ， 單曉楓 ， 錢愛東

(吉林農(nóng)業(yè)大學動物科學技術(shù)學院 ， 吉林 長春 130118)

東北林蛙(Ranadybowskii) 是蛙科、林蛙屬無尾兩棲動物，主要分布于我國東北地區(qū)和內(nèi)蒙古東北部，其具有極高的經(jīng)濟價值和科研價值，是我國重要的野生藥用動物[1]。由于大量的人為捕殺、自然生態(tài)的破壞、外來物種的侵入等外界因素影響[2]，導致野生東北林蛙的數(shù)量驟減，其已經(jīng)被列入《世界瀕危動物紅皮書》二級保護動物，為易危(V)物種[3]。

嗜水氣單胞菌(Aeromonashydrophila)隸屬于氣單胞菌科(Aeromonadaceae)、氣單胞菌屬，廣泛存在于淡水、污水和土壤中[4]，可誘發(fā)恒溫動物、變溫動物的全身性疾病，是一種典型的人—畜—魚共患的致病菌[5-6]。因其可在多種水體以及水產(chǎn)動物體內(nèi)寄生，可引起蛙類致病甚至死亡，給蛙類人工養(yǎng)殖業(yè)和野生蛙類的生存均造成了嚴重的威脅，引起了眾多國內(nèi)外學者的高度重視[7-8]。嗜水氣單胞菌能夠引起以蛙紅腿和皮膚潰爛壞死為特征的細菌性傳染病，?？梢鸺毙猿鲅詳⊙Y等，病程短，傳播能力強，近年來此類病例正在以驚人的速度增多，造成了極高的死亡率[9-11]。本試驗對從吉林市某林蛙養(yǎng)殖場患病的東北林蛙臟器中分離純化出的病原菌進行培養(yǎng)與鑒定，并對其致病性和耐藥性進行檢測，以期為東北林蛙的疾病防控與嗜水氣單胞菌的防治提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗動物 患病林蛙和健康林蛙，均購自吉林市某林蛙養(yǎng)殖場；斑馬魚，購自長春某花鳥魚市場。

1.2 主要試劑 細菌基因組提取試劑盒(北京天根生化科技有限公司)；細菌微量生化反應管(杭州天和生物試劑有限公司)；瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒(長春飛凱生物有限公司)；藥敏紙片(杭州濱河微生物試劑有限公司)。

1.3 方法

1.3.1 病原菌的分離培養(yǎng) 觀察病蛙體表以及大腿根部等出現(xiàn)病灶的部位，無菌操作取其病料在LB培養(yǎng)基中進行病原菌分離培養(yǎng)；同時對病蛙麻醉后在無菌條件下進行剖檢，采集病蛙的肝臟、腎臟、脾臟和心臟，充分研磨制成混懸液，接種于LB培養(yǎng)基，于28 ℃恒溫條件下培養(yǎng)18 h。挑取不同顏色、形態(tài)、大小的優(yōu)勢單菌落進行純培養(yǎng)。培養(yǎng)物于4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 細菌溶血活性檢測 將LB平板中的優(yōu)勢菌群進行純化后，接種至哥倫比亞羊血瓊脂平板上，37 ℃培養(yǎng)12 h，觀察溶血圈，用毫米尺測量溶血圈的直徑，評價各優(yōu)勢菌群的溶血活性。

1.3.3 動物回歸試驗 選擇具有溶血活性的菌株用PBS稀釋至相同濃度1×108CFU/mL，選擇健康林蛙作為試驗動物，腹腔注射稀釋菌液(100 μL/只)，連續(xù)觀察7 d，記錄死亡情況，對菌株致病性進行檢測。

1.3.4 斑馬魚半數(shù)致死濃度(LD50)測定 將分離的溶血活性及致病性兼有的菌株接種于LB培養(yǎng)基中恒溫培養(yǎng)24 h，用PBS進行稀釋，稀釋濃度依次為1×106、1×105、1×104、1×103、1×102、10 CFU/mL和1 CFU/mL。選擇斑馬魚作為實驗動物，按照菌液稀釋梯度數(shù)將健康斑馬魚分為7個濃度組，每組10尾，以0.2 mL/尾的劑量對斑馬魚進行腹腔注射。每天觀察各組魚的發(fā)病情況和死亡情況，并進行記錄，計算菌株的LD50。

1.3.5 生理生化鑒定 將分離到的病原菌純培養(yǎng)物分別接種至生化反應管內(nèi)，30 ℃溫箱中孵育12～24 h。根據(jù)說明書進行結(jié)果對比，進行生理生化鑒定。

1.3.6 分子生物學鑒定 取對數(shù)生長期的菌液，離心收集菌體，按照細菌基因組提取試劑盒說明書操作，提取細菌的總DNA。利用PCR對菌株的16S rDNA基因與gyrB管家基因進行擴增，引物序列見表1。將PCR產(chǎn)物進行電泳檢測，出現(xiàn)預期目的條帶后，按照試劑盒說明書進行膠回收，純化后送至長春庫美生物測序公司進行測序。將分離菌株的16S rDNA基因序列和gyrB基因序列經(jīng)NCBI中的BLSAT檢測系統(tǒng)進行序列同源性分析后，選取對比匹配度較高的幾組基因，利用MEGA 6.0構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

表1 PCR引物序列Table 1 PCR primer sequences

1.3.7 毒力基因檢測 以分離菌株DNA為模板，采用PCR方法對氣溶素(aer)、細胞毒性腸毒素(act)、黏附素(Aha)、核酸酶(exu)、絲氨酸蛋白酶(ser)、脂肪酶(Lip)、密度感應系統(tǒng)調(diào)控基因(LuxS)這7種毒力基因進行檢測，引物信息見表1。

1.3.8 藥敏試驗 采用改良K-B紙片擴散法，取20 μL純化后的分離菌株，用接種環(huán)在培養(yǎng)基中均勻涂布，將制備好的藥敏片分別按標記好的位置緊貼在培養(yǎng)基的表面。將培養(yǎng)皿放置于30 ℃恒溫箱中培養(yǎng)8～12 h后，觀察其抑菌圈的直徑(mm)，以抑菌圈直徑大小作為判定敏感度高低的標準，判斷病原菌對藥物的敏感性。

2 結(jié)果

2.1 分離優(yōu)勢菌株 觀察病蛙體表并無明顯病灶，但上肢及大腿根部出現(xiàn)了損傷以及不同程度的腫大現(xiàn)象。無菌條件下對病蛙進行剖檢，使用接種環(huán)劃線分離培養(yǎng)臟器中的病原菌。挑選形態(tài)不同的優(yōu)勢菌株接種于培養(yǎng)基中劃線培養(yǎng)，結(jié)果得到5株優(yōu)勢細菌，分別命名為R1、R2、R3、R4和R5。

2.2 細菌溶血活性檢測 對R1～R5菌株進行溶血活性檢測，測量其溶血圈的直徑，結(jié)果顯示：R1、R2菌株并無溶血活性；R3、R4、R5菌株均出現(xiàn)了溶血環(huán)，表明R3、R4、R5菌株均具有溶血活性。

2.3 動物回歸試驗 使用PBS將R3、R4、R5三株細菌的菌落數(shù)統(tǒng)一調(diào)至1×108CFU /mL，以100 μL/只的注射量對健康林蛙進行腹腔注射。結(jié)果顯示，只有注射R5菌株的林蛙出現(xiàn)了死亡現(xiàn)象，注射R1～R4菌株的林蛙均未出現(xiàn)死亡。根據(jù)回歸試驗結(jié)果，可以初步證明R5菌株具有較強致病性。

2.4 斑馬魚LD50測定 通過人工感染斑馬魚發(fā)現(xiàn)，注射1×106CFU/mL R5菌液的斑馬魚組在第1天就出現(xiàn)了死亡情況，并出現(xiàn)了明顯的行動緩慢、精神不振的現(xiàn)象，第2天死亡4尾，1周內(nèi)死亡率達到80%。經(jīng)計算，R5菌株對于斑馬魚的LD50達到1.26×103CFU，說明R5菌株具有較強的致病性。

2.5 生理生化鑒定 結(jié)果如表2所示，R5菌株可分解葡萄糖產(chǎn)酸產(chǎn)氣；可分解賴氨酸脫羧酶、氨基酸脫羧酶；可利用葡萄糖、阿拉伯糖等；不利用明膠、山梨醇等。符合嗜水氣單胞菌生理生化特征，判定分離菌為嗜水氣單胞菌。

表2 生化反應結(jié)果Table 2 Biochemical reaction results

2.6 分子生物學鑒定 對R5菌株的16S rDNA和gyrB基因進行PCR鑒定，測序后構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進化樹。結(jié)果如圖1和圖2所示，分離菌R5與嗜水氣單胞菌(GenBank登錄號：CP046954.1)的同源性高達98%。結(jié)果表明R5菌株與嗜水氣單胞菌親緣關(guān)系最近。綜合生化反應和分子水平鑒定結(jié)果，確定R5菌株為嗜水氣單胞菌。

圖1 R5菌株16S rDNA系統(tǒng)發(fā)育進化樹Fig.1 Phylogenetic tree of 16S rDNA of R5 strain▲：本試驗分離的菌株；下同▲：Strain isolated in this experiment. The same as below

圖2 R5菌株gyrB系統(tǒng)發(fā)育進化樹Fig.2 Phylogenetic tree of gyrB of R5 strain

2.7 毒力基因檢測 PCR 擴增結(jié)果如圖3所示，R5菌株攜帶6種毒力因子，分別是Lip、act、aer、ser、LuxS和Aha，大小分別為247、232、431、128、369 bp和1 082 bp。

圖3 毒力基因的PCR擴增Fig.3 PCR amplification of virulence genesM：DL2 000 DNA Marker; 1：Lip; 2：act; 3：aer;4：exu; 5：ser; 6：LuxS; 7：Aha

2.8 藥敏試驗 藥敏試驗結(jié)果如表3所示，R5菌株對慶大霉素、四環(huán)素、鏈霉素、氟苯尼考、氧氟沙星、環(huán)丙沙星、多黏菌素B、頭孢拉啶、頭孢噻肟、頭孢吡肟、復方新諾明敏感；對丁胺卡那、氯霉素中介；對氨芐西林具有耐藥性。

表3 分離菌株藥物敏感性試驗Table 3 Antibiotic sensitivity test of the isolated strains

3 討論

嗜水氣單胞菌是淡水養(yǎng)殖類動物暴發(fā)性傳染病的主要病原菌之一，是多種水生動物的原發(fā)性致病菌，此前即有水生動物感染嗜水氣單胞菌的病例報道[12-13]。由于嗜水氣單胞菌的生存條件與蛙類的生活環(huán)境極為相似，所以其對蛙類是一種致病力強大的致病菌，主要導致蛙類的皮膚潰爛以及紅腿病，進而導致敗血癥等疾病[14-15]。東北林蛙作為典型的陸生蛙類，在水中繁殖后再登陸入林，其生活環(huán)境不僅復雜并且對飼養(yǎng)要求高，極易受到外界環(huán)境的影響。由于兩棲動物的特殊習性，相較于其他動物更易出現(xiàn)群體間的疾病傳播，所以對于其疾病的防控不容小覷[16]。Huys等從出現(xiàn)出血性敗血癥的虎紋蛙體內(nèi)分離出1株嗜水氣單胞菌，說明嗜水氣單胞菌易使蛙類感染致病，蛙類是該菌的主要宿主之一[17]。林蛙?；嫉募膊〈蟛糠志哂袀魅拘?，但針對林蛙的特效治療藥甚少，所以應重視林蛙的疾病防控，要做到最大程度上減少林蛙染病概率，制定多種疾病治療方案，才能有效提高林蛙人工養(yǎng)殖的經(jīng)濟效益[18]。

本試驗從吉林市養(yǎng)殖場患病林蛙體內(nèi)分離到5株優(yōu)勢菌株，通過溶血活性檢測和動物回歸試驗分別檢測其致病性，結(jié)果顯示菌株R5對于東北林蛙具有較強的致病性，結(jié)合生理生化鑒定初步確定該菌株為嗜水氣單胞菌。由于不同來源的嗜水氣單胞菌具有不同的理化特性，所以有必要在生化鑒定的基礎(chǔ)上進行16S rDNA基因序列的分析鑒定[19]。目前，公認16S rDNA基因檢測技術(shù)可對微生物進行快速、精準的鑒定分析，是常用于鑒定病原菌的檢測方法之一，但由于該方法具有高度保守性，使其對于相似度很高的同屬物種的分辨能力較弱[20-21]。RNA聚合酶基因gyrB，與16S rDNA基因相比具有較高的替換率，在以核苷酸序列為基礎(chǔ)的細菌類別鑒定中可作為靶分子，有助于更加準確地確定種屬分類以及新物種的發(fā)現(xiàn)，可更準確地區(qū)分同源性較高的親緣物種[22-24]。因此，本試驗選取構(gòu)建16S rDNA基因和gyrB管家基因的系統(tǒng)發(fā)育樹，對菌株R5進行后續(xù)的分子水平鑒定。結(jié)果顯示，R5菌株16S rDNA和gyrB基因序列與嗜水氣單胞菌(GenBank登錄號：CP046954.1)的同源性高達98%，進一步確定嗜水氣單胞菌是引起該養(yǎng)殖場東北林蛙患病的病原菌。

動物回歸試驗和斑馬魚LD50測定結(jié)果顯示，經(jīng)人工感染純化后的R5菌株，可使東北林蛙和斑馬魚在短時間內(nèi)死亡，證明該菌具有較強的致病性。嗜水氣單胞菌與其他病原微生物的致病過程基本一致，大致分為黏附、入侵、定植、增殖、產(chǎn)生毒素，其利用不同毒力因子調(diào)節(jié)自身的基因，從而來適應不同的要求[25]。一般認為，嗜水氣單胞菌致病作用與其攜帶的多種毒力因子(外毒素、胞外蛋白酶、黏附素)密切相關(guān)，可能是多功能和多因子相互協(xié)同作用的結(jié)果，毒力基因分布不同的菌株，致病性也存在一定的差異[26-28]。本試驗毒力因子檢測結(jié)果顯示，R5菌株可攜帶Lip、act、aer、ser、LuxS、Aha這6種毒力因子。嗜水氣單胞菌所產(chǎn)生的氣溶素和細胞毒性腸毒素，已被確定為主要的致病因子[29-30]，二者為典型的外毒素，具有腸毒性、溶血活性、細胞毒性等生物學特性，與動物出血病和敗血癥有關(guān)。氣溶素作為一種水溶性蛋白質(zhì)，可在細胞表面形成具有通道孔的七聚體，導致細胞死亡，表現(xiàn)出血癥狀[31]，與本試驗林蛙體表出現(xiàn)紅腫的結(jié)果一致。絲氨酸蛋白酶廣泛存在于原核和真核細胞中，可以參與菌體的一些生化反應，進而影響菌株的毒力。研究發(fā)現(xiàn)，絲氨酸蛋白酶的表達與氣溶素的表達呈現(xiàn)正相關(guān)的關(guān)系[32-33]。LuxS基因可以促進細菌生物膜的形成，進而影響?zhàn)じ侥芰σ约叭苎钚?，使細菌的感染能力增強[34]。脂肪酶在激活氣單胞菌的氣溶素活性、增強細菌在宿主細胞中黏附能力等方面均具有重要作用[35]。當嗜水氣單胞菌侵襲機體時，其會在體內(nèi)快速、大量繁殖，所產(chǎn)生的毒力因子單獨或協(xié)同作用，導致機體內(nèi)細胞破壞，從而導致機體抵抗力降低，出現(xiàn)出血、敗血等病癥，嚴重時可引起死亡[36]。因此，進一步研究嗜水氣單胞菌的致病機制對于該菌的防治具有重要的意義。

目前關(guān)于嗜水氣單胞菌疫苗的研究已經(jīng)有了顯著的進展，但由于制作成本以及技術(shù)等方面的原因，在水生動物細菌性疾病的防治中，傳統(tǒng)藥物和抗菌藥物依舊是常用的方法之一[37]。王闖等的藥敏試驗結(jié)果顯示，東北林蛙源嗜水氣單胞菌對氟喹諾酮類、氨基糖苷類抗菌藥以及部分頭孢類藥物敏感[38]，與本試驗結(jié)果基本一致，可見東北林蛙感染嗜水氣單胞菌可使用慶大霉素、環(huán)丙沙星、頭孢拉啶等藥物嘗試治療。但菌株R5對于氨芐西林耐藥，說明此次引發(fā)東北林蛙致病的病原菌具有較高的耐藥性，可能與曾長期使用或不科學使用抗菌藥，導致該病原菌株產(chǎn)生多重耐藥性相關(guān)。由于近年來水產(chǎn)養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)中濫用抗菌藥的現(xiàn)象層見迭出，其所導致的水環(huán)境污染以及大量耐藥菌株的產(chǎn)生成為了科研人員與養(yǎng)殖戶所要面臨的嚴峻問題[39]。所以在養(yǎng)殖過程中要有針對性地選擇敏感性藥物，并交替使用不同類別的抗菌藥物，盡可能避免抗藥菌株的產(chǎn)生。利用抗菌藥對感染嗜水氣單胞菌的蛙類進行治療只是權(quán)宜之計，嗜水氣單胞菌的防治仍需不斷地進行探索和改進，需要“以防為主，防治結(jié)合”的綜合防治方法[40]。尋找替代抗菌藥物的相關(guān)研究也成為了當下水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)對動物疾病防治的重要研究方向，這也對我國綠色健康的水產(chǎn)養(yǎng)殖環(huán)境的形成有著重大的意義。