黃瑞，朱叔敏，莫景新，黃智莉 綜述 賴仁發(fā)，李澤鍵 審校

1.暨南大學(xué)口腔醫(yī)學(xué)院，廣東 廣州 510630；2.廣州醫(yī)科大學(xué)附屬中醫(yī)醫(yī)院，廣東 廣州 510145

間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymal stem cells，MSCs)是具有自我更新和分化為多種細(xì)胞類型能力的多系細(xì)胞，在組織修復(fù)和再生醫(yī)學(xué)中起著關(guān)鍵作用[1]。在動(dòng)物模型和人體臨床試驗(yàn)中，間充質(zhì)干細(xì)胞在修復(fù)各種退行性疾病的受損組織方面顯示出巨大潛力，其通過介導(dǎo)旁分泌的方式發(fā)揮作用，調(diào)控?fù)p傷組織的微環(huán)境，達(dá)到減少炎癥、促進(jìn)血管生成等效果[2-4]。同時(shí)，MSCs可以遷移到損傷部位并分化為損傷部位的局部成分，分泌有助于組織再生的生長因子[4-6]。近年來，眾多實(shí)驗(yàn)室和臨床試驗(yàn)表明，利用間充質(zhì)干細(xì)胞治療骨性關(guān)節(jié)炎和軟骨病變具有良好的前景[7-8]。例如，從骨髓中分離的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(BMSCs)已在動(dòng)物模型和臨床實(shí)踐中證明了其形成軟骨的能力[8]。隨著研究的深入，有人認(rèn)為外泌體的旁分泌可能在關(guān)節(jié)組織的修復(fù)以及基于間充質(zhì)干細(xì)胞的其他疾病的治療中發(fā)揮作用[9]。

目前已知細(xì)胞會(huì)分泌各種類型的細(xì)胞外囊泡(EVs)，根據(jù)其大小、含量和形成機(jī)制進(jìn)行區(qū)分，EVs又主要分為凋亡小體、微囊泡以及外泌體[10]。外泌體是內(nèi)吞起源的，直徑30～150 nm的囊泡，它們可以運(yùn)送各種不同的DNA、RNA、蛋白質(zhì)和脂質(zhì)[11-12]。有相關(guān)研究證明絕大多數(shù)類型的細(xì)胞在生理和病理?xiàng)l件下都能分泌它們，這表明外泌體是一種非常重要的臨床診斷和治療工具[10，12]。隨著研究的深入，有人發(fā)現(xiàn)外泌體存在于多種細(xì)胞外液中，包括血液[13]、羊水[14]、唾液[15]、腦脊液[16]等。近年來，越來越多的研究結(jié)果表明外泌體在各種生理過程中起著重要作用，例如炎癥[17]、免疫反應(yīng)[18]、神經(jīng)元功能[19]等。不僅如此，它們還在一些疾病不同的發(fā)展階段中起作用，例如肝病[20]、神經(jīng)退行性疾病[21]、與癌癥相關(guān)的疾病[22]等。

1 不同間充質(zhì)干細(xì)胞來源外泌體在軟骨再生中的應(yīng)用

1.1 滑膜間充質(zhì)干細(xì)胞來源外泌體 滑膜間充質(zhì)干細(xì)胞具有較好的分化潛能，其旁分泌產(chǎn)生的外泌體與軟骨修復(fù)密切相關(guān)?；らg充質(zhì)干細(xì)胞來源外泌體(synovial mesenchymal stem cell-derived exosomes，SMSC-Exos)可以明顯促進(jìn)軟骨細(xì)胞的增殖和遷移。最近的一項(xiàng)研究表明，在OA 的治療中只有從過表達(dá)miR-140-5p 的MSCs 中分離出的外泌體才對(duì)軟骨細(xì)胞的增殖和遷移明顯具有促進(jìn)作用[23]。miR-140-5p 過表達(dá)SMSC-Exos來源的外泌體對(duì)大鼠OA 模型關(guān)節(jié)軟骨的成功修復(fù)，并在一定程度上延緩OA發(fā)展進(jìn)程，表明通過技術(shù)手段對(duì)外泌體進(jìn)行改造，使得分泌的外泌體具有治療OA的潛力是今后研究的方向。

1.2 骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞來源外泌體 間充質(zhì)干細(xì)胞釋放的外泌體在細(xì)胞間通訊和組織修復(fù)中發(fā)揮著重要的作用。MSC-Exos在大鼠皮膚創(chuàng)傷模型和大鼠骨-軟骨缺損模型中已被證明具有免疫調(diào)節(jié)作用，并具有一定的再生能力[24-25]。骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞來源的外泌體(bone marrow mesenchymal stem cell-derived exosomes，BMMSC-Exos)在體外和首例人體實(shí)驗(yàn)中也顯示出免疫調(diào)節(jié)特性[26-27]。VONK 等[28]首次證明了BMMSC-Exos在人類OA軟骨中既具有再生特性又具有免疫調(diào)節(jié)特性。當(dāng)BMMSC-Exos與OA軟骨細(xì)胞共培養(yǎng)時(shí)，BMMSC-Exos 不僅可以抑制TNF-α介導(dǎo)的COX2 和促炎性白細(xì)胞介素的上調(diào)，還能抑制TNF-α誘導(dǎo)的膠原酶活性。同時(shí)BMMSC-Exos 還可誘導(dǎo)軟骨細(xì)胞、蛋白多糖和II 型膠原的細(xì)胞外基質(zhì)成分的產(chǎn)生[28]。BMMSC-Exos 所展現(xiàn)出的潛力使它可能成為治療OA 的最佳療法之一，該療法不僅可以促進(jìn)軟骨修復(fù)，而且還能抑制軟骨的退變。BMMSC-Exos有希望在OA 早期階段使病變關(guān)節(jié)改善并防止OA進(jìn)一步發(fā)展。

1.3 脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞來源外泌體 早在2002年，已有研究證實(shí)脂肪組織也是間充質(zhì)干細(xì)胞的重要來源[29]。與骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(BMMSCs)相比，脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞(AMSCs)在分化為脂肪細(xì)胞、軟骨、骨骼和骨骼肌等中胚層來源的細(xì)胞和組織方面具有同等的潛力[30]。大量研究表明，AMSCs高表達(dá)成軟骨所必需的CD73、CD90、CD105 和CD106[30-31]。WU 等[32]通過在小鼠OA 模型中連續(xù)數(shù)周于關(guān)節(jié)腔內(nèi)多次注射MSCIPFP-Exos 證明MSCIPFP-Exos 可以進(jìn)入關(guān)節(jié)軟骨的受損區(qū)域，促進(jìn)軟骨細(xì)胞合成。同時(shí)，MSCIPFP-Exos 可以抑制IL-1β誘導(dǎo)的軟骨細(xì)胞凋亡，促進(jìn)IL-1β處理的軟骨細(xì)胞的合成代謝并抑制其分解代謝。由于ROCKEL 等[33]發(fā)現(xiàn)自噬在維持軟骨穩(wěn)態(tài)中起著重要作用，WU 等[32]進(jìn)一步研究得出MSCIPFP-Exos 保護(hù)軟骨免受傷害的機(jī)制可能與miR100-5p介導(dǎo)的抑制mTOR 信號(hào)通路提高自噬水平有關(guān)。由于mTOR/自噬信號(hào)通路在OA 的發(fā)展中起著關(guān)鍵作用，因此以該通路為基礎(chǔ)治療OA 可能是一個(gè)可行的方法。同時(shí)還需要更多的研究來闡明機(jī)制，以優(yōu)化MSC-Exos對(duì)OA的治療效果。

1.4 胚胎間充質(zhì)干細(xì)胞來源外泌體 近年來，成人間充質(zhì)干細(xì)胞(MSCs)已經(jīng)在實(shí)驗(yàn)室和臨床研究中用于軟骨修復(fù)[28，34-35]。然而，成人間充質(zhì)干細(xì)胞的臨床應(yīng)用受到供體來源和個(gè)體身體條件的限制，隨著供體年齡的增加，細(xì)胞增殖和分化等能力逐漸下降[36]。而由多能胚胎干細(xì)胞(embryonic stem cell-mesenchymal stem cells，ESC-MSCs)來源的MSCs 已逐漸展現(xiàn)出自己的潛力。ESC 的自我更新能力和多能性確保了細(xì)胞批次間的可變性更小，這使得ESC-MSC 的供應(yīng)更加穩(wěn)定[37]。此外，有研究認(rèn)為ESC-MSCs 有與成人MSCs 相似的免疫調(diào)節(jié)特性和再生潛能[38]。WANG等[39]在已建立OA 模型的小鼠關(guān)節(jié)內(nèi)注射源自ESC-MSCs 的外泌體，發(fā)現(xiàn)可以減輕軟骨破壞和基質(zhì)降解。ZHANG等[25]也得出相似的研究結(jié)果，骨-軟骨缺損處顯示出軟骨和軟骨下骨的完全恢復(fù)，且具有良好的表面規(guī)則性、與相鄰軟骨完全結(jié)合等特點(diǎn)。這些研究表明ESC-MSCs可以通過在軟骨基質(zhì)的合成和降解二者之間達(dá)到平衡而緩解OA，外泌體在這之中起到重要作用。同時(shí)，上述研究還表明利用人類胚胎間充質(zhì)干細(xì)胞來源的外泌體進(jìn)行軟骨修復(fù)比目前的細(xì)胞療法更有優(yōu)勢(shì)。

2 不同間充質(zhì)干細(xì)胞來源外泌體成軟骨的潛在機(jī)制

2.1 激活A(yù)KT、ERK、Wnt 等信號(hào)通路促進(jìn)軟骨細(xì)胞增殖、遷移 CD73 是目前已知的能將細(xì)胞外單磷酸腺苷(AMP)轉(zhuǎn)化為腺苷的細(xì)胞外5'-核苷酸酶，腺苷又能通過與腺苷受體的相互作用引發(fā)促存活的AKT 和ERK 信號(hào)傳導(dǎo)。據(jù)報(bào)道，外泌體激活A(yù)KT 和ERK 促生存信號(hào)是外泌體介導(dǎo)的組織修復(fù)和再生的重要途徑，并已被證明在創(chuàng)傷愈合[24]、骨修復(fù)[40]中起重要作用。正是由于外泌體CD73 介導(dǎo)的AKT 和ERK 信號(hào)傳導(dǎo)的腺苷激活，使得在軟骨修復(fù)過程中實(shí)現(xiàn)了細(xì)胞的快速增殖和遷移。ZHANG 等[41]證明由外泌體介導(dǎo)的軟骨細(xì)胞增殖和遷移增加現(xiàn)象可被AKT 或ERK 磷酸化抑制劑所抑制，但基質(zhì)合成不受其影響。同時(shí)，TAO 等[23]研究發(fā)現(xiàn)，MSC-EXO 所攜帶的Wnt5a 和Wnt5b 通過Wnt 信號(hào) 通路 激活YAP 來促進(jìn)軟骨細(xì)胞增殖和遷移，但ECM 的分泌明顯減少。據(jù)報(bào)道m(xù)iR-92a-3p 過表達(dá)的MSC-EXO 在軟骨形成和退變過程中對(duì)Wnt5a 起著積極的調(diào)節(jié)作用，這增強(qiáng)了軟骨細(xì)胞的聚集蛋白聚糖、COMP 和COL2A1的表達(dá)[42]。

2.2 通過調(diào)節(jié)外泌體包含的miRNA譜促進(jìn)軟骨組織再生 迄今為止，有關(guān)外泌體miRNA 的研究表明，miR-30d-5p、miR-199b 和miR-133b-3p 會(huì) 阻 止RUNX2基因表達(dá)，從而抑制成骨細(xì)胞分化[43]。研究發(fā)現(xiàn)miR-140-3p通過抑制BMP-2的表達(dá)而降低成骨細(xì)胞活性，另一方面，miR-885-5p負(fù)性調(diào)控BMP-2的表達(dá)，從而促進(jìn)成骨細(xì)胞的分化和礦化[44]。據(jù)報(bào)道，miR-140-5p過表達(dá)的SMSC-EXO可有效促進(jìn)軟骨細(xì)胞的增殖和遷移，并可通過RALA阻斷ECM分泌明顯減少的副作用，而SMSC-Exos的作用有限[23]。WU等[32]研究證明，MSCIPFP-Exos 中過表達(dá)的miR-100-5p 可能通過mTOR/自噬信號(hào)通路參與關(guān)節(jié)軟骨的維持。而最近的一項(xiàng)研究也表明miR-92a-3p 過表達(dá)的MSC-EXO在軟骨形成和退變過程中通過Wnt5a 促進(jìn)軟骨細(xì)胞的合成[42]。如果特定的miRNA可以減輕OA中的炎癥或組織破壞，則可以將它們包裝在外泌體或納米顆粒中來治療OA。

2.3 通過增加抗炎性因子、減弱促炎性因子的表達(dá)改善炎癥使軟骨細(xì)胞存活 滑膜炎癥現(xiàn)在被認(rèn)為是OA 癥狀和進(jìn)展的一個(gè)重要特征[45]。在骨關(guān)節(jié)炎的早期，有一些獨(dú)特的趨化因子信號(hào)與滑膜炎癥有關(guān)[46]。例如，來自白細(xì)胞介素-1β(IL-1β)刺激的滑膜成纖維細(xì)胞(SF)的外泌體已被證明能誘導(dǎo)軟骨細(xì)胞的骨關(guān)節(jié)炎改變[47]。DOMENIS 等[48]的研究表明在外泌體的作用下，巨噬細(xì)胞產(chǎn)生一系列促炎細(xì)胞因子和趨化因子，包括CCL8、IL-1β、MMP12、CCL15、MMP7 和CCL20，導(dǎo)致關(guān)節(jié)軟骨的炎癥和退化。而通過抗炎干預(yù)可以促進(jìn)軟骨細(xì)胞存活并降低發(fā)生創(chuàng)傷后骨關(guān)節(jié)炎的風(fēng)險(xiǎn)[49]。ZHANG等[41]發(fā)現(xiàn)，MSC-EXOs在軟骨損傷處誘導(dǎo)再生M2巨噬細(xì)胞的浸潤，同時(shí)伴有促炎滑膜細(xì)胞因子的減少，這與ZHANG 等[27]研究發(fā)現(xiàn)的MSC-EXOs免疫調(diào)節(jié)特性相一致。這表明MSC-EXOs可以通過調(diào)控巨噬細(xì)胞等免疫細(xì)胞以增加抗炎因子如IL-10的表達(dá)，減弱促炎性因子如IL-1β、TNF-α表達(dá)，從而促進(jìn)軟骨細(xì)胞存活。

3 小結(jié)

由于具有修復(fù)受損組織的能力，MSC-EXOs在再生醫(yī)學(xué)中得到了廣泛關(guān)注，目前已經(jīng)在MSC-EXOs實(shí)驗(yàn)中研究了不同的疾病模型。現(xiàn)有研究結(jié)果表明，不同間充質(zhì)干細(xì)胞來源的外泌體在修復(fù)各種退行性疾病的受損組織方面顯示出巨大潛力。但是，EXO療法應(yīng)用于臨床實(shí)際仍存在一些難題，還需大量其他研究以證明MSC-EXOs在治療OA中的有效性和可行性。