潘 雪， 石倩瑋

(1.中國(guó)中醫(yī)科學(xué)院廣安門(mén)醫(yī)院， 北京 100053；2.中國(guó)中醫(yī)科學(xué)院博士后科研流動(dòng)站， 北京 100700)

骨肉瘤是最常見(jiàn)的原發(fā)性惡性骨腫瘤，該腫瘤被界定為存在產(chǎn)生類骨質(zhì)和/或未成熟骨的惡性間充質(zhì)細(xì)胞。全球范圍內(nèi)，骨肉瘤的患病率為4.3%，且呈雙峰年齡分布，于15～19歲兒童及青少年人群中達(dá)到高峰，而第二個(gè)高峰則出現(xiàn)在年齡≥75歲的老年人群中[1]。從監(jiān)測(cè)、流行病學(xué)和最終結(jié)果(surveillance, epidemiology and end results，SEER)數(shù)據(jù)庫(kù)中提取數(shù)據(jù)顯示，在過(guò)去的10年中，經(jīng)過(guò)年齡調(diào)整后，每年骨肉瘤新發(fā)病例以0.4%的速度增長(zhǎng)[2]。骨肉瘤最常見(jiàn)的癥狀是骨痛，隨著病情的進(jìn)展，可逐漸出現(xiàn)局部腫脹、腫塊及關(guān)節(jié)活動(dòng)受限情況，對(duì)于確診時(shí)已轉(zhuǎn)移或復(fù)發(fā)的患者，其5年生存率往往低于30%[3]，嚴(yán)重影響患者的身心健康，并降低生活質(zhì)量。

目前，新輔助化療對(duì)于骨肉瘤的治療具有重要意義。但患者在長(zhǎng)期化療后，易出現(xiàn)多藥耐藥(multidrug resistance，MDR)，影響化療效果。因此，為解決骨肉瘤化療的MDR問(wèn)題，針對(duì)相關(guān)耐藥機(jī)制進(jìn)行新藥開(kāi)發(fā)、制定靶向治療策略成為骨肉瘤治療的新方向，而中醫(yī)藥具有多靶點(diǎn)、低毒、高效等治療優(yōu)勢(shì)，在逆轉(zhuǎn)骨肉瘤化療的多藥耐藥現(xiàn)象方面發(fā)揮著重要作用。

1 MDR已成為新輔助化療治療骨肉瘤困局

上世紀(jì)70年代前，針對(duì)骨肉瘤的治療方法有限，療效欠佳。70年代后有研究報(bào)道，應(yīng)用大劑量甲氨蝶呤、阿霉素、順鉑能夠有效治療骨肉瘤[4]，隨后將其應(yīng)用于骨肉瘤的臨床治療中，使得該病的無(wú)病生存率接近70%。因骨肉瘤的治療取得階段性進(jìn)展，輔助化療的臨床療效被國(guó)內(nèi)外學(xué)者肯定。隨著外科技術(shù)的發(fā)展，如何改善骨肉瘤患者生存率，提高保肢率逐漸受到重視。1979年Rosen等對(duì)“新輔助化療”概念的提出，進(jìn)一步完善改進(jìn)了原有的輔助化療，強(qiáng)調(diào)了術(shù)前化療，即術(shù)前化療-手術(shù)-術(shù)后化療，包括T4/T5方案，成為最早制定治療骨肉瘤的可行模式。新輔助化療在提高保肢率、降低控制轉(zhuǎn)移方面發(fā)揮了重要作用，且聯(lián)合化療干預(yù)骨肉瘤可使其5年生存率由不及20%提高至65%～70%[5]，因此該療法已成為目前骨肉瘤的首選及標(biāo)準(zhǔn)治療模式。

隨著現(xiàn)代醫(yī)學(xué)的發(fā)展，絕大多數(shù)學(xué)者認(rèn)為化療是提高骨肉瘤患者遠(yuǎn)期生存率的主要手段，阿霉素、甲氨蝶呤、順鉑及異環(huán)磷酰胺是公認(rèn)的治療骨肉瘤有效化療藥物，且在藥物劑量的認(rèn)知上亦達(dá)成共識(shí)。盡管在骨肉瘤化療方案上尚未形成定論，但多年來(lái)通過(guò)臨床工作者的不斷研究和探索，已證實(shí)新輔助化療能為患者帶來(lái)一定的益處，并被廣泛應(yīng)用于臨床治療中。雖然該療法能在一定程度上延緩骨肉瘤患者的生存期，但不斷提高的化療強(qiáng)度已經(jīng)接近人體耐受極限，即使增大藥量、增加聯(lián)合化療藥物種類或改變給藥途徑，仍然有20%～30%的病例收效甚微，MDR即是治療的一大挑戰(zhàn)。目前普遍認(rèn)為，MDR是腫瘤細(xì)胞對(duì)化療藥物殺傷作用最重要的抵御與自我保護(hù)機(jī)制，由一種藥物誘發(fā)產(chǎn)生耐藥性的同時(shí)，對(duì)其他抗腫瘤藥物也產(chǎn)生藥物對(duì)抗反應(yīng)，是惡性腫瘤化療失敗和復(fù)發(fā)的重要原因，導(dǎo)致骨肉瘤患者的生存狀況難以得到改善[6-8]。

2 骨肉瘤化療的MDR發(fā)生機(jī)制

自從1970年Biedle等首次發(fā)現(xiàn)MDR以來(lái)，國(guó)內(nèi)外學(xué)者進(jìn)行了廣泛、深入的基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)與臨床研究，探尋MDR產(chǎn)生的分子機(jī)制取得了一定的進(jìn)展。目前，在涉及MDR的病理機(jī)制中，多項(xiàng)研究聚焦于腫瘤細(xì)胞對(duì)藥物的攝取減少及外泵增加方面，ATP結(jié)合盒(atp-binding cassette，ABC)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白超家族的參與和MDR形成具有密切關(guān)聯(lián)[9]。

P-糖蛋白(p-glyeoprotein, P-gp)是其中被研究最早、最深入的ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白超家族成員。P-gp是一種分子量170 kD的跨膜糖蛋白，由位于人類染色體7q21.1的ABCBI(MDR1)基因編碼，它具有“藥泵功能”，其跨膜區(qū)域可結(jié)合藥物，2個(gè)ATP結(jié)合域相互靠近與ATP結(jié)合釋放能量，促使中心孔道開(kāi)放，將藥物轉(zhuǎn)運(yùn)至細(xì)胞外使?jié)舛认陆?，最終導(dǎo)致化療耐藥，這是產(chǎn)生MDR的經(jīng)典途徑[10-12]。多項(xiàng)研究[13-15]表明，P-gp的高表達(dá)是骨肉瘤產(chǎn)生MDR現(xiàn)象的關(guān)鍵機(jī)制，也是影響患者預(yù)后的重要因素，較高的復(fù)發(fā)率及轉(zhuǎn)移率與其相關(guān)。

除了P-gp介導(dǎo)的MDR經(jīng)典途徑以外，多藥耐藥相關(guān)蛋白(multidrug resistance-associated protein，MRP)介導(dǎo)的化療藥物外排也是產(chǎn)生MDR的另一條重要途徑。MRP與P-gp具有諸多相似之處，亦屬于ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白超家族成員，是第一個(gè)被發(fā)現(xiàn)的ABCC亞家族轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白。MRP蛋白在體內(nèi)主要分布于細(xì)胞質(zhì)內(nèi)的質(zhì)膜系統(tǒng)，具有解毒防御、分泌作用，可介導(dǎo)細(xì)胞膜及細(xì)胞質(zhì)囊泡內(nèi)部的物質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)，調(diào)整細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)分布，目前已發(fā)現(xiàn)9種具有轉(zhuǎn)運(yùn)功能的MRP，分別為MRP1-MRP9[16]。MRP可以轉(zhuǎn)運(yùn)砷等重金屬，保護(hù)機(jī)體免受環(huán)境中氧化態(tài)重金屬陰離子的傷害。MRP1是該家族中研究最為透徹的一個(gè)蛋白。有研究發(fā)現(xiàn)，腫瘤細(xì)胞膜上大量表達(dá)MRP1，MRP1可轉(zhuǎn)運(yùn)蒽環(huán)霉素和長(zhǎng)春花生物堿等抗癌藥物，通過(guò)識(shí)別化療藥物與谷胱甘肽(glutathione，GSH)形成的共軛物，將其排出細(xì)胞外，從而導(dǎo)致耐藥[17]。MRP1介導(dǎo)的藥泵功能和經(jīng)典的P-gp介導(dǎo)耐藥機(jī)制有部分相同底物，二者不同之處在于MRP1介導(dǎo)的藥物轉(zhuǎn)運(yùn)外排途徑是伴有GSH的共軛轉(zhuǎn)運(yùn)而進(jìn)行的?；诂F(xiàn)有的研究報(bào)道，P-gp及MRP1過(guò)表達(dá)被認(rèn)為是腫瘤MDR最主要的因素。屠重棋等[18]研究對(duì)正常成年骨組織及骨肉瘤組織進(jìn)行免疫組化檢測(cè)對(duì)比分析，結(jié)果證實(shí)71.11%骨肉瘤組織中MRP1表達(dá)呈陽(yáng)性，且MRP的表達(dá)與該腫瘤惡性程度呈正相關(guān)。

隨著研究的深入，眾多學(xué)者發(fā)現(xiàn)骨肉瘤化療的MDR并不是通過(guò)單一途徑介導(dǎo)發(fā)生，可能是多種機(jī)制相互作用的結(jié)果。針對(duì)化療藥物的解毒作用，目前研究較深入的是谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶(glutathione S-transferase，GST)。有學(xué)者認(rèn)為，GSTP1的過(guò)度表達(dá)與多種惡性腫瘤的化學(xué)抵抗及預(yù)后有關(guān)。一項(xiàng)以60例30歲以下患者骨肉瘤標(biāo)本為對(duì)象的研究表明，GSTP1過(guò)表達(dá)與術(shù)前化療的組織學(xué)不良反應(yīng)有密切關(guān)聯(lián)[19]。另外，細(xì)胞凋亡也是化療誘導(dǎo)細(xì)胞死亡的重要方式，細(xì)胞周期停滯及凋亡的一系列相關(guān)基因表達(dá)均可參與化療細(xì)胞毒性的調(diào)節(jié)，如p53、B淋巴細(xì)胞瘤-2(B-cell lymphoma-2，Bcl-2)基因等[20，21]。由此可見(jiàn)，細(xì)胞解毒、細(xì)胞凋亡抑制與腫瘤細(xì)胞的耐藥有關(guān)。近年來(lái)，關(guān)于DNA損傷修復(fù)機(jī)制、骨肉瘤干細(xì)胞、細(xì)胞自噬作用的研究亦在不斷開(kāi)展，但仍有很多耐藥因素尚未被闡釋明晰，需要進(jìn)一步探索。

3 骨肉瘤化療耐藥逆轉(zhuǎn)策略

現(xiàn)階段，如何逆轉(zhuǎn)MDR、提高骨肉瘤化療效果已成為一項(xiàng)世界性難題。通過(guò)對(duì)腫瘤MDR產(chǎn)生的分子機(jī)制進(jìn)行研究，已經(jīng)明確一些關(guān)鍵蛋白及異常生物過(guò)程調(diào)控在MDR中發(fā)揮著重要作用，并基于此開(kāi)發(fā)了相關(guān)蛋白分子抑制劑，以嘗試逆轉(zhuǎn)腫瘤化療耐受。

其中，P-gp抑制劑能通過(guò)抑制細(xì)胞中P-gp轉(zhuǎn)運(yùn)活性發(fā)揮MDR逆轉(zhuǎn)作用，臨床中常應(yīng)用鈣離子通道抑制劑維拉帕米和環(huán)孢霉素A及其衍生物，但由于其毒副作用巨大，干擾化療藥物的藥代動(dòng)力學(xué)，使得MDR逆轉(zhuǎn)劑的臨床應(yīng)用受到限制。另外，針對(duì)MRP1介導(dǎo)腫瘤細(xì)胞MDR逆轉(zhuǎn)劑的研究方向主要包括兩方面，一是針對(duì)MRP1介導(dǎo)藥物中GSH的共軛物外排轉(zhuǎn)運(yùn)特點(diǎn)，通過(guò)抑制GST/GSH系統(tǒng)，耗竭細(xì)胞內(nèi)GSH，從而減少M(fèi)RP1對(duì)化療藥物的外排轉(zhuǎn)運(yùn)，如丁硫氨酸硫酸亞胺(buthionine sulfoximine，BSO)；二是針對(duì)MRP1轉(zhuǎn)運(yùn)底物的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)而合成的化合物,如以異惡唑?yàn)榛A(chǔ)的化合物L(fēng)Y40291、喹啉化合物MS-209、LY335979等[22]。目前這些MRP1逆轉(zhuǎn)劑尚處于體外實(shí)驗(yàn)階段，屬于前期研究階段，是否對(duì)人體有效還需要進(jìn)一步的臨床驗(yàn)證。

縱觀現(xiàn)有可行的MDR逆轉(zhuǎn)方法，或因造成明顯不良反應(yīng)，或因價(jià)格昂貴、技術(shù)難度高，或因缺乏進(jìn)一步臨床循證數(shù)據(jù)支撐，使MDR的臨床干預(yù)受限。因此，探討MDR產(chǎn)生機(jī)制的同時(shí)，仍需不斷尋求安全、有效的化療耐藥逆轉(zhuǎn)方法。

4 中藥在逆轉(zhuǎn)骨肉瘤耐藥中的應(yīng)用前景

近年來(lái)，中藥已成為抗腫瘤研究的熱點(diǎn)問(wèn)題，中藥資源豐富，能夠通過(guò)多途徑、多靶點(diǎn)發(fā)揮療效，在腫瘤治療中的重要性不斷提高。針對(duì)腫瘤MDR機(jī)制的復(fù)雜性，中藥是有潛力開(kāi)發(fā)成為能夠逆轉(zhuǎn)耐藥的理想藥物，其天然產(chǎn)物活性成分能夠影響腫瘤MDR，受到腫瘤屆醫(yī)學(xué)同道的廣泛關(guān)注[23]。這些潛在的治療藥物或具有鈣通道阻滯作用，或影響與耐藥相關(guān)蛋白的表達(dá)，或通過(guò)調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡等方式發(fā)揮逆轉(zhuǎn)MDR的作用。

4.1 粉防己堿

粉防己堿又名漢防己甲素，是一種雙芐基異喹啉類生物堿，主要來(lái)源于中藥防己根。粉防己堿具有廣泛的藥理作用，包括抗腫瘤活性，具有鈣通道阻滯作用。王進(jìn)等[24]研究發(fā)現(xiàn)，粉防己堿對(duì)骨肉瘤耐藥細(xì)胞系U2OS/DOX具有逆轉(zhuǎn)作用且其療效優(yōu)于維拉帕米及環(huán)孢霉素A。Lu等[25]通過(guò)評(píng)估粉防己堿對(duì)骨肉瘤中MDR的預(yù)防作用也得到了類似結(jié)論，結(jié)果表明粉防己堿能通過(guò)抑制P-gp過(guò)度表達(dá)，進(jìn)而預(yù)防紫杉醇引起的MDR，這種變化機(jī)制可能與抑制骨肉瘤中的核因子κB(nuclear factor kappa-B，NF-κB)信號(hào)傳導(dǎo)有關(guān)。

4.2 姜黃素

姜黃素是姜黃根莖植物中重要的成分之一，具有良好的抗炎及抗癌特性，能夠起到逆轉(zhuǎn)MDR的作用。有研究[26]表明，姜黃素能增加阿霉素對(duì)阿霉素抗性骨肉瘤細(xì)胞株U2OS/ADM的毒性作用，且呈劑量依賴關(guān)系，可有效逆轉(zhuǎn)U2OS/ADM細(xì)胞的MDR現(xiàn)象。Si等[27]通過(guò)體內(nèi)外兩方面實(shí)驗(yàn)證實(shí)，姜黃素具有增強(qiáng)抗腫瘤藥物活性、抑制多藥耐藥細(xì)胞增殖、侵襲及轉(zhuǎn)移作用，其下調(diào)P-gp且抑制P-gp外排泵功能可能有助于MDR逆轉(zhuǎn)。

4.3 三七皂苷R1

三七總皂苷是三七的主要活性成分，其特征化合物即為三七皂苷R1，該化合物對(duì)多種器官、組織具有良好的調(diào)節(jié)作用，而且已被證實(shí)在癌癥中能夠發(fā)揮抗腫瘤作用[28]。在骨肉瘤的研究中，三七皂苷R1能夠劑量依賴性地削減骨肉瘤細(xì)胞活力及遷移能力，并誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡。Lu等[29]通過(guò)研究也發(fā)現(xiàn)，三七皂苷R1能夠抑制骨肉瘤細(xì)胞中的阿霉素抗性。從機(jī)制上分析，其能夠有效阻斷白細(xì)胞介素-6(interleukin-6，IL-6)誘發(fā)的Janus激酶2(janus kinase 2，JAK2)/信號(hào)傳導(dǎo)及轉(zhuǎn)錄激活因子3(signal transducer and activator of transcription 3，STAT3)通路的激活，臨床應(yīng)用前景廣闊。

4.4 槲皮素

槲皮素是一種常見(jiàn)的黃酮類化合物，具有抗炎、抗氧化、抑制癌細(xì)胞增殖作用，并能夠誘導(dǎo)其凋亡[30]。已有研究報(bào)道[31-33]，槲皮素在多種惡性腫瘤中作為輔助藥物能增強(qiáng)化療藥物的治療效果，具有較大的開(kāi)發(fā)潛力。Zhang等[34]研究對(duì)槲皮素聯(lián)合順鉑治療骨肉瘤的效果進(jìn)行評(píng)價(jià)，結(jié)果證實(shí)槲皮素能夠通過(guò)調(diào)節(jié)miR-217-KRAS，增強(qiáng)順鉑治療骨肉瘤的敏感性，值得進(jìn)一步研究。

4.5 雷公藤甲素

雷公藤甲素(triptolide, TP)來(lái)源于中藥雷公藤，其生物活性強(qiáng)，具有抗炎、免疫調(diào)節(jié)、抗腫瘤等多種藥理作用[35]。在抗腫瘤方面，TP能夠抑制多種腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)并誘導(dǎo)其發(fā)生凋亡或者自噬，抑制血管生成，減少遠(yuǎn)端轉(zhuǎn)移[36]。在TP抗骨肉瘤效應(yīng)方面，有文獻(xiàn)報(bào)道[37]TP作為絲裂原激活蛋白激酶磷酸酶-1(mitogen-activated protein kinase phosphatase 1，MKP-1)的抑制劑，能夠阻止MKP-1的表達(dá)，增強(qiáng)順鉑誘導(dǎo)的骨肉瘤細(xì)胞死亡，表明TP與順鉑能夠協(xié)同抑制骨肉瘤細(xì)胞增殖。這些研究結(jié)果提示，TP具有逆轉(zhuǎn)骨肉瘤化療MDR的潛能，能夠與化療藥物協(xié)同發(fā)揮抗腫瘤效應(yīng)。

5 總結(jié)與展望

中藥具有多成分、多途徑、多靶點(diǎn)的特點(diǎn)，治療腫瘤歷史源遠(yuǎn)流長(zhǎng)且毒性小，在逆轉(zhuǎn)骨肉瘤MDR方面已展現(xiàn)出治療優(yōu)勢(shì)及潛力，但仍存在一定的局限性?？v觀現(xiàn)有的研究報(bào)道，大多體外實(shí)驗(yàn)具有一定的局限性，針對(duì)中藥單體的藥理作用及機(jī)制還有待進(jìn)一步通過(guò)體內(nèi)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證；目前，中藥復(fù)方干預(yù)骨肉瘤的防治研究相對(duì)較少，中醫(yī)歷來(lái)重視整體觀及辨證論治，因此復(fù)方的應(yīng)用有著廣闊的發(fā)展前景。在今后的研究中，可進(jìn)行相關(guān)研究探討中藥復(fù)方能否通過(guò)多藥味的協(xié)同作用，增強(qiáng)機(jī)體的抗癌能力，提高化療敏感性，進(jìn)而逆轉(zhuǎn)MDR。以上問(wèn)題的進(jìn)一步完善，將為拓展臨床應(yīng)用提供科學(xué)依據(jù)，對(duì)開(kāi)發(fā)切實(shí)有效的新藥具有重要價(jià)值；近年來(lái)，已有多種檢測(cè)新技術(shù)涌現(xiàn)，對(duì)疾病的預(yù)防、診斷及預(yù)后意義深遠(yuǎn)。因此，亟需對(duì)中藥MDR逆轉(zhuǎn)劑處理或未處理的化療耐受腫瘤細(xì)胞進(jìn)行整體的蛋白質(zhì)和基因組定量分析，探求經(jīng)中藥處理后細(xì)胞內(nèi)蛋白及基因表達(dá)差異，并通過(guò)生物信息學(xué)技術(shù)分析這些差異蛋白或基因所在的信號(hào)網(wǎng)絡(luò)，為進(jìn)一步闡釋中藥基于多靶點(diǎn)、多階段性特性逆轉(zhuǎn)骨肉瘤化療MDR的分子機(jī)制，提供方向及切入點(diǎn)。