王大朋，王仁珞，范麗麗

（貴州醫(yī)科大學(xué) 環(huán)境污染與疾病監(jiān)控教育部重點實驗室/公共衛(wèi)生與健康學(xué)院，貴州貴陽 550025）

甲狀腺是人體最大的內(nèi)分泌器官，對機體的生長發(fā)育、新陳代謝等均有重要作用，其功能損傷與疾病發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。甲狀腺疾病病因復(fù)雜，除年齡、性別、遺傳等傳統(tǒng)因素外，環(huán)境因素對其影響亦引起國內(nèi)外研究人員廣泛關(guān)注[1]。砷是一種環(huán)境類金屬毒物，機體可通過呼吸道、食物和飲水?dāng)z入及皮膚吸收暴露于砷，可引起急、慢性砷中毒，導(dǎo)致多器官損傷[2]。近年來人群及動物研究發(fā)現(xiàn)，砷暴露與甲狀腺疾病發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)[3-5]。但該方面研究目前尚處于起步階段，砷致甲狀腺損傷具體類型及發(fā)病機制均未見相關(guān)報道。本研究擬在體外層面探討砷暴露對人甲狀腺細(xì)胞焦亡相關(guān)蛋白表達(dá)的影響，為砷致甲狀腺損傷分子機制研究提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 研究對象

正常人甲狀腺細(xì)胞Nthyori3-1，中科院上海生命科學(xué)研究院細(xì)胞資源中心。

1.2 儀器與試劑

INCO2108型CO2培養(yǎng)箱，德國Memmert公司；PowerPac HC型蛋白電泳儀系統(tǒng)，美國Bio Rad公司；ChemiDocTMXRS+型凝膠成像系統(tǒng)，美國Bio Rad公司；Multiskan? GO型多功能酶標(biāo)儀，美國Thermo Fisher公司。

亞砷酸鈉（NaAsO2），優(yōu)級純，美國Sigma-Aldrich公司；DMEM高糖培養(yǎng)基，細(xì)胞級，北京索萊寶科技有限公司；胎牛血清（FBS），北京索萊寶科技有限公司；BCA蛋白濃度測定試劑盒，北京索萊寶科技有限公司；NLRP3、Caspase-1、GSDMD蛋白一抗，上海愛必信生物科技有限公司；GAPDH蛋白一抗，美國ImmunoWay公司；羊抗鼠/羊抗兔二抗，上海碧云天生物技術(shù)有限公司。

1.3 實驗分組

Nthyori3-1細(xì)胞接種于含10%胎牛血清、100 μg/mL鏈霉素和100 IU/mL青霉素的DMEM高糖培養(yǎng)基中，37 ℃、5%CO2條件下常規(guī)培養(yǎng)。取生長狀態(tài)良好，且處于對數(shù)生長期的細(xì)胞按5×105個/孔密度接種于 6孔板，將NaAsO2以 0 μmol/L、2 μmol/L、4 μmol/L、8 μmol/L的濃度梯度進(jìn)行染毒，處理24 h；另外以4 μmol/L的NaAsO2處理Nthyori3-1細(xì)胞0 h、12 h、24 h、48 h。

1.4 Western-blot法檢測焦亡相關(guān)蛋白

到達(dá)各染毒終點收集細(xì)胞沉淀，RIPA裂解后16 000×g離心20 min，收集上清，采用BCA法測定蛋白濃度。按說明書依次進(jìn)行制膠、蛋白上樣（20 μg）、電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉，將相應(yīng)蛋白一抗進(jìn)行4 ℃孵育過夜后，TBST洗膜，辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗孵育90 min，ECL化學(xué)發(fā)光法進(jìn)行顯影，Image J軟件進(jìn)行灰度值分析。

1.5 統(tǒng)計學(xué)分析

采用SPSS 22.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析。所有數(shù)據(jù)符合正態(tài)分布，且具有方差齊性，數(shù)據(jù)均采用均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。采用單因素方差分析進(jìn)行多組間比較，兩兩比較采用LSD法。檢驗水準(zhǔn)α=0.05，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同劑量NaAsO2對焦亡相關(guān)蛋白表達(dá)水平的影響

如圖1所示，隨著NaAsO2處理濃度的增加，Nthyori3-1細(xì)胞中NLRP3、Caspase-1、GSDMD蛋白表達(dá)水平均逐漸升高，其中NLRP3、GSDMD蛋白表達(dá)呈明顯劑量-反應(yīng)關(guān)系（P＜0.05）。

圖1 不同劑量NaAsO2對Nthyori3-1細(xì)胞焦亡相關(guān)蛋白表達(dá)水平的影響

2.2 NaAsO2暴露不同時間對焦亡相關(guān)蛋白表達(dá)水平的影響

如圖2所示，與對照組相比，NLRP3、Caspase-1、GSDMD蛋白表達(dá)水平隨染毒時間的延長均呈現(xiàn)明顯增加趨勢，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。與12 h組相比，染毒24 h、48 h的NLRP3、GSDMD表達(dá)顯著上升（P＜0.05）。NLRP3在染毒48 h后的表達(dá)水平較24 h明顯上升，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。

圖2 NaAsO2暴露不同時間對Nthyori3-1細(xì)胞焦亡相關(guān)蛋白表達(dá)水平的影響

3 結(jié)論

人群流行病學(xué)和有限的動物實驗均發(fā)現(xiàn)砷暴露可對甲狀腺及其功能造成不同程度的損傷[3-6]。然而，砷暴露對體外人甲狀腺細(xì)胞的毒性作用目前未見相關(guān)報道。本研究以Nthyori3-1細(xì)胞為研究對象，探討砷暴露對其毒性作用及可能機制。

細(xì)胞焦亡是近年來新發(fā)現(xiàn)的一種促炎性、程序性細(xì)胞死亡方式，由GSDMD分子被NLRP3炎癥小體剪切活化后在細(xì)胞膜上形成孔洞而導(dǎo)致其完整性破壞，釋放其細(xì)胞內(nèi)容物以及白介素等促炎物質(zhì)，引發(fā)炎癥級聯(lián)反應(yīng)，進(jìn)而造成細(xì)胞損傷[6]。炎癥小體主要由NLRP3、ASC及Caspase-1前體（pro-Caspase-1）組成。在內(nèi)源性或外源性物質(zhì)刺激下，活化的Caspase-1能夠特異性切割GSDMD，使其生成C端和N端，GSDMD的N端與細(xì)胞膜上的磷脂結(jié)合，使細(xì)胞膜形成許多小孔，細(xì)胞的完整性遭到破壞，導(dǎo)致細(xì)胞腫脹、破裂，釋放細(xì)胞內(nèi)的炎性物質(zhì)，從而誘導(dǎo)細(xì)胞焦亡的發(fā)生[7]。

近年來，有限的研究發(fā)現(xiàn)砷可誘導(dǎo)不同細(xì)胞發(fā)生焦亡。LI等[8]用NaAsO2處理人肝L-02細(xì)胞，觀察發(fā)現(xiàn)IL-1β和活化的Caspase-1水平隨著染砷劑量的增加而增加。用NaAsO2處理肝癌細(xì)胞可以誘導(dǎo)其發(fā)生細(xì)胞焦亡[9]。另有研究發(fā)現(xiàn)，長期接觸NaAsO2可誘導(dǎo)TNF-α的產(chǎn)生，進(jìn)而引起NLRP3介導(dǎo)的炎性細(xì)胞活化，誘導(dǎo)胰腺細(xì)胞發(fā)生細(xì)胞焦亡[10]。但是，砷對甲狀腺細(xì)胞焦亡的影響目前尚不清楚。本研究以人正常甲狀腺Nthyori 3-1細(xì)胞為研究對象，首次探討了不同濃度砷暴露不同時間對其焦亡相關(guān)蛋白表達(dá)的影響，結(jié)果顯示NaAsO2染毒Nthyori 3-1細(xì)胞后，其細(xì)胞內(nèi)的NLRP3、Caspase-1、GSDMD蛋白表達(dá)量較對照組均顯著增加。

綜上，本研究發(fā)現(xiàn)無機砷能夠誘導(dǎo)甲狀腺細(xì)胞焦亡相關(guān)蛋白表達(dá)水平升高，進(jìn)而可能引起甲狀腺細(xì)胞焦亡，具體機制有待進(jìn)一步深入研究。