李光磊， 龔詩語， 張曼曼， 李 彭， 鄧 宇， 孔志康， 邢常瑞， 袁 建

(南京財經(jīng)大學食品科學與工程學院; 江蘇省現(xiàn)代糧食流通與安全協(xié)同創(chuàng)新中心;江蘇高校糧油質量安全控制及深加工重點實驗室, 南京 210023)

保障糧油及其制品的安全供應關乎國計民生，然而從生產(chǎn)加工到最后消費的各階段，都有可能發(fā)生有害物質的侵染，這些風險因素包括重金屬、添加劑、毒素等，嚴重危害人民身體健康。因此，建立高效的檢測方法，滿足各個階段對安全檢測的需求具有重要意義。

很多傳統(tǒng)的檢測方法，如化學與色譜法，在樣品前處理時通常費力耗時，或儀器設備過于昂貴復雜，難以滿足快速檢測的需求。為了彌補傳統(tǒng)檢測方法缺陷，應對新的檢測需求，多種快速檢測方法已被建立，如熒光法、化學發(fā)光法、高光譜、表面增強拉曼散射等，這些方法的建立對糧油及其制品中有害物的快速、準確檢測和安全控制發(fā)揮了重要作用。

熒光探針技術作為獨立使用的技術手段或與其他檢測技術相結合，在快速檢測方法中具有不可替代的重要作用，但有機熒光探針在食品安全檢測方面的綜述很少。 Duan等[1]總結了有機熒光探針在食品及飲用水中的安全檢測的應用進展；Huang等[2]介紹了聚集誘導發(fā)光(AIE)類有機熒光探針在食品安全檢測的研究進展，重點闡述了AIE探針的分子設計及傳感原理。本文聚焦有機熒光探針在糧油及其制品安全檢測中的應用，從檢測原理出發(fā)以檢測目標物分類，比較各類探針優(yōu)缺點，對有機熒光探針在糧油安全檢測中的發(fā)展方向進行了展望。

1 有機熒光探針在不同類型目標物檢測中的應用

1.1 金屬離子

金屬離子與人體代謝平衡密切相關，攝入不足或過量會引起嚴重疾病。糧油及其制品是重要的金屬營養(yǎng)元素的供給來源，金屬元素含量的測定具有極其重要的現(xiàn)實意義。熒光探針為金屬離子的檢測提供一種快捷、廉價且高效的選擇。

如圖1所示，Hu等[3]利用二硫蘇糖醇(DTT)還原CuSO4制備銅微簇(CuNCs)探針1。金屬Al3+引起探針1聚集，引發(fā)AIE現(xiàn)象熒光增強，在0.01～7 μmol/L范圍內(nèi)，探針1的熒光強度與Al3+濃度呈現(xiàn)良好線性關系。在油條、薯條、饅頭和粉絲等實際樣品檢測結果與石墨爐原子吸收光譜法(GF-AAS)檢測結果高度一致。Jiang等[4]基于β-蒎烯制備了探針2，該探針與Al3+形成配合物后探針分子內(nèi)電荷轉移(ICT)增大從而點亮探針。在pH 1～9的范圍內(nèi)，探針快速(45 s)識別Al3+，其檢出限(LOD)為8.1×10-8mol/L。該探針成功用于定量檢測薯條、餅干等樣品中的Al3+。另外，Guo等[5]利用低聚噻吩制備Cu2+熒光探針3，該探針通過配體特異識別Cu2+離子，從而阻礙了ICT，探針熒光強度減弱(Turn-off型)。探針的響應時間僅為20 s，LOD達到0.42 μmol/L。在稻米等樣品檢測中，回收率為98.4%～101.4%，相對標準偏差(RSD)小于1.26%。上述各類熒光探針應用于實際糧油樣品中金屬離子檢測，相較于標準的檢測方法—原子吸收光譜法，前處理簡單，樣品經(jīng)過破碎、酸處理及過濾(或離心)即可直接用于最終熒光檢測，適用于快速檢測方法的開發(fā)。

圖1 檢測金屬離子探針的結構和反應[3-5，7]

目前，多種檢測金屬離子(Hg2+、Pb2+、Cu2+、Fe2+/ Fe3+、Zn2+等)的有機熒光探針已經(jīng)被制備，并應用于體內(nèi)、體外檢測[6]，在糧油及制品中金屬離子的檢測應用主要局限于Al3+和Cu2+，有害重金屬如Pb2+、Cd2+、As的檢測應用鮮有報道。Hafuka等[7]報道了利用有機熒光探針4檢測糙米中Cd2+的方法，但該檢測方法在常規(guī)的破碎、消化前處理外還需要通過陰離子交換樹脂純化提取Cd2+，預處理過程等較復雜。因此，急需構建更多適用于檢測糧油食品中不同種類金屬離子的探針，特別是用于檢測重金屬離子的熒光探針。

1.2 陰離子

與金屬陽離子類似，陰離子與人體的健康也息息相關。糧油食品在加工過程中的食品添加劑，如高劑量的亞硫酸鹽/亞硫酸氫鹽可引起過敏反應、哮喘惡化和神經(jīng)系統(tǒng)紊亂；氰化物的過量積累會對機體造成不可逆損傷。因此，糧油制品中陰離子的種類及含量需要精確測定。

1.2.1 SO32-/HSO3-

多個國家或組織對食品中SO32-/HSO3-的量做了嚴格的規(guī)定。聯(lián)合國糧農(nóng)組織(FAO)/世界衛(wèi)生組織(WHO)認為可接受的每日攝入量應低于0.7 mg/kg體重，因此嚴格的攝入管理非常必要。

基于不同識別方式，如邁克爾加成、與醛特異反應、AIE效應等，多種檢測SO32-/HSO3-的熒光探針已經(jīng)被制備。邁克爾加成的反應條件一般較溫和，這類探針通過碳碳雙鍵與SO32-/HSO3-結合，導致原本的共軛體系或ICT改變，最終導致熒光信號發(fā)生變化。如圖2所示，Li等[8]設計了一種檢測糖樣品和活體細胞中HSO3-的熒光探針5，HSO3-與探針分子雙鍵發(fā)生邁克爾加成反應，使得探針的可見色度及熒光顏色都發(fā)生改變。和普通的熒光探針相比，近紅外(NIR)熒光探針具有更好的信號穿透能力和更低的噪音背景，這類探針受到很高關注。Li等[9]基于典型的熒光材料—半花菁骨架設計了NIR Turn-off熒光探針6，HSO3-通過邁克爾加成與探針亞乙基中的C-4原子反應，破壞了探針的共軛體系，導致705 nm處的熒光強度逐漸降低。該探針在糖類和紅酒樣品的檢測結果與傳統(tǒng)滴定檢測結果幾乎相同，回收率達到96.7%～106.1%。與之相對，Duan等[10]設計了NIR Turn-on型探針7，SO32-攻擊探針的喹啉骨架，使得其原本的吸電子性基團轉變?yōu)閺娊o電子基團，探針近紅外熒光信號增強。該探針響應時間短(少于50 s)，LOD低(31.6 nmol/L)，并成功應用于砂糖及掛面中SO32-的檢測。

圖2 檢測陰離子探針的結構和反應[8-24]

不同于強度變化型探針，雙信號的比率定量不易受到探針濃度、局部微環(huán)境等因素干擾，具有更好的抗干擾能力。Asaithambi等[11]將2個半花菁骨架引入到1個化合物中制備了探針8和9，探針在初始狀態(tài)分別發(fā)出625 nm和640 nm的紅色熒光，當與SO32-/HSO3-反應，熒光信號藍移至500 nm和510 nm。LOD分別為1.8、2.1 nmol/L, 成功用于掛面等實際樣品檢測。Li等[12]和Zhang等[13]分別基于半花菁制備了檢測SO32-/HSO3-的NIR比率型熒光探針10和11，SO32-/HSO3-的結合破壞了探針分子10和11的π共軛體系及改變ICT，從而使得探針分子雙熒光信號改變，SO32-/HSO3-的含量由雙熒光信號比率定量。探針成功用于糖類樣品及細胞內(nèi)檢測。Huang等[14]報道了另外一類比率定量檢測SO32-熒光探針12，SO32-破壞了苯并吡喃和萘酰亞胺之間的熒光共振能量轉移(FRET)，從而使得供體信號熒光(570 nm)變強，同時受體熒光(650 nm)減弱，LOD為0.017 μmol/L，在豆腐皮和冰糖樣品的檢測中回收率為94%～103%?；贖SO3-與醛的親和加成反應，F(xiàn)eng等[15]等設計了一個雙光子熒光探針13，該探針與HSO3-結合后，抑制了探針分子內(nèi)ICT效應，熒光強度隨HSO3-的濃度升高逐漸淬滅，LOD達到42 nmol/L，在糖類樣品的檢測中表現(xiàn)出了很高的回收率。Gao等[16]構建了具有AIE增強現(xiàn)象的四苯基咪唑化合物14。該化合物自組裝成高度有序的納米顆粒，并顯示強烈熒光。隨著0到1個當量SO32-的加入與探針結合，原本有序組裝的納米顆粒變成無序狀態(tài)，從而導致熒光強度逐漸降低。該納米顆粒用于SO32-檢測具有極短的檢測時間(15 s)以及很低的LOD(7.4 nmol/L)，在砂糖樣品檢測的回收率為96.8%～102.4%。

多種類型的SO32-/HSO3-熒光探針被用于實際樣品檢測，其LOD遠低于比色法，且響應迅速，具有非常好的應用前景，但目前尚缺乏能快速高效區(qū)分食品中SO32-和HSO3-的熒光探針，這將是未來的一個研究關注點。

1.2.2 氰化物(CN-)

CN-被認為是毒性最強的陰離子之一，它會抑制細胞呼吸、擾亂中樞神經(jīng)系統(tǒng)。其在塑料生產(chǎn)、藥物開發(fā)等行業(yè)仍被廣泛應用，另外包括木薯、竹筍、杏仁等食品也會產(chǎn)生內(nèi)源的CN-。

以羅丹明B類似物為基本結構，Long等[17]報道了熒光探針15，在水溶液中CN-的存在會使探針分子的羥基去質子化，從而開啟ICT，探針分子熒光增強，LOD達0.5 μmol/L以下，并成功用于如發(fā)芽馬鈴薯、苦杏仁及自來水等實際樣品檢測。與該探針的識別原理類似的還有Wei等[18]報道的吩嗪類探針16，Mahalakshmi等[19]制備的萘醌類探針17，以及Niu等[20]報道的探針18。值得注意的是，該類探針與CN-形成去質子化的溶液可被HCl重新質子化，從而恢復原始狀態(tài)(自由態(tài))，因此通過固定化探針的方法，有望對探針多次重復利用。

低聚噻吩也被用于構建CN-熒光探針，Niu等[20-23]報道了turn-on型探針19和20。CN-通過親和加成反應破壞了探針分子內(nèi)電子供體(低聚噻吩基團)與電子受體間的共軛雙鍵，從而抑制了分子的ICT，探針熒光增強。特別值得一提的是探針20的LOD達到31.3 nmol/L，且檢測時間僅為30 s。探針成功用于檢測土豆、木薯和芋頭等糧食作物樣品中CN-含量。

Long等[24]構建了NIR比率型熒光探針21，CN-與探針分子的吡咯烷的結合，阻礙了探針分子內(nèi)的ICT，使得熒光發(fā)射波長藍移。在CN-濃度0～80μmol/L范圍內(nèi)，探針在519 nm處與688 nm處的熒光強度之比呈很好的線性關系。該近紅外CN-探針被用于檢測發(fā)芽馬鈴薯等多種食品樣品，LOD為0.075 μmol/L。并且該探針還被成功用于制備熒光比色試紙，使得檢測更加便捷。

食品中定量檢測CN-的國家標準(GB 5009.36—2016)為分光光度法和LC，其中分光光度法需要較為復雜的前處理，而CN-在LC檢測前還需要用氯胺-T衍生，操作煩瑣。熒光探針是檢測CN-最簡單、經(jīng)濟和快速的方法之一。

1.3 有機物

食品中的外源有機物包括違規(guī)添加的食品添加劑、非法添加物、加工過程中生成的有害物質及污染物等，如面粉中的非法添加物過氧化苯甲酰、豆制品及海鮮中非法使用的甲醛、深度油炸油中的三酰甘油聚合物等。

1.3.1 過氧化苯甲酰(BPO)

BPO是一種小分子活性氧(ROS)，由于其氧化漂白作用被廣泛用于食品加工業(yè)。BPO可通過食品攝入或皮膚吸收進入體內(nèi)，造成潛在風險。2009年，食品法典委員會(CAC)規(guī)定了小麥粉中BPO的最大使用量為75 mg/kg[25]，中國及歐盟禁止在小麥粉中使用BPO，其含量的精確檢測對保障食品安全具有非常重要的意義。

如圖3所示，Zeng等[30]報道了2種檢測BPO的香豆素類熒光探針22和23。其中探針22的碳碳雙鍵作為與BPO反應的特異活性位點，探針氧化分解，探針熒光由紅色變?yōu)樗{色。BPO含量可通過470 nm與655 nm處熒光強度比定量，該探針響應時間快(< 6 min)，LOD為163 nmol/L。探針23以頻哪醇硼酸酯為識別基團，通過與BPO的選擇性氧化反應，引發(fā)分子內(nèi)隨后自發(fā)的消除反應，ICT減弱，導致探針熒光顏色由紅色變?yōu)榫G色，探針的響應時間比探針22稍長(< 15 min)，但LOD更低(56 nmol/L)。2種探針在小麥粉、面條和餃子粉等實際樣品中檢測均不需要復雜前處理，但探針23檢測實際樣品時的回收率僅為30.4%～66.7%，遠低于探針22的90%～114%，Zeng等[30]推測可能是由于探針23的識別基團頻哪醇硼酸酯可以與淀粉鏈中的羥基結合，干擾了探針對實際樣品中BPO的高選擇性。同樣以頻哪醇硼酸酯為識別基團，Tian等[28]在半花青骨架的基礎上制備了NIR探針24，其識別檢測原理與探針23類似，該檢測限達到47 nmol/L，并且在小麥粉樣品的實際檢測中有很高的回收率(平均偏差 < 3%)?；谙嗤R別基團，Ding等[29]設計了推拉電子(D-π-A)結構的雙光子熒光探針25，探針在小麥粉檢測中回收率為93%～105%，同樣未出現(xiàn)探針23較低回收率的問題?？梢?，合理的探針設計可以避免樣品基質中羥基對頻哪醇硼酸酯識別BPO的干擾，但相應機制尚不明確，如何實現(xiàn)理性化設計有待研究。

圖3 檢測有機物探針的結構和反應[26-33，35-36]

基于BPO的氧化性，Zeng等[30]設計了可同時檢測HSO3-和BPO的熒光探針26。探針以吩噻嗪為主體結構，吩噻嗪骨架上的硫原子若被BPO氧化成亞砜，探針產(chǎn)生一個熒光開啟信號。在小麥粉和面條樣品中的檢測回收率為90%～103%。該探針被制備成檢測BPO的紙基試紙條，當暴露于不同濃度(0～150 μmol/L)的BPO 10 min，紙基試紙從無熒光變?yōu)閺娋G色熒光。紙基試紙條進一步簡化了探針檢測操作，有利于在基層和現(xiàn)場推廣應用。

1.3.2 甲醛(FA)

FA是一種活性羰基物質(RCS)，常被用作防腐劑或用來改變食品顏色和氣味(很多時候是違法的)。2011年5月我國頒布的《食品添加劑使用標準》不再將FA列為食品添加劑范疇。為了降低FA可能帶來的危害，早期檢測對于FA濃度的控制尤為重要。

FA非常容易與胺衍生物發(fā)生反應，-NH2常常被用作FA的識別基團。Xu等[31]制備了一種簡單的萘基熒光探針27，探針的-NH2識別FA后，探針通過2-Aza-Cope重排及水解反應生成具有吸電子性質的醛基，從而形成電子推拉體系，ICT增強，探針熒光強度增加。LOD為0.57 mmol/L，在實際樣品太妃糖中的檢測結果與HPLC檢測結果一致。Zhou等[32，33]報道了2種基于-NH2識別基團及光致電子轉移(PET)原理用于檢測食品FA的探針28和29。探針28 是具有雙發(fā)射增強型的FA反應分子，在近100%水溶液中，探針的-NH2與FA反應形成的亞胺，抑制了分子原本的PET，熒光增強。探針分別在 365 nm和 400 nm 處激發(fā)，在415 nm和505 nm處顯示熒光響應。2個激發(fā)波長強度都定量檢測FA濃度，但400 nm激發(fā)獲得了更寬的FA定量檢測范圍(0～2.7 × 10-2mol/L)，LOD為6 μmol/L。當探針29與FA反應，-NH2轉化為亞胺，使得熒光團HOMO能量低于喹啉的HOMO能量，原本的PET過程受到抑制，熒光增強，LOD低至900 nmol/L。此外，通過靜電紡絲技術制備了含有聚乙烯醇和探針的納米纖維，使檢測更加簡便。這2個探針初步成功應用于豆腐皮等實際樣品中FA的檢測。

1.3.3 其他

高溫油炸過程會發(fā)生包括水解、氧化和聚合等許多復雜的反應，并產(chǎn)生具有潛在毒性物質。其中三酰甘油聚合物含量代表食用油的聚合程度，被廣泛用于評價食用油品質控制、初榨油鑒別和油氧化[34]。

Wu等[35]報道了AIE探針30，該探針通過煎炸油中的黏度介導機制檢測三酰甘油聚合物。在高溫油炸過程中，氧化反應生成氧化三酰甘油單體(ox-TGM)，聚合生成三酰甘油二聚體和低聚物，導致油炸油的黏度增加，限制了探針分子內(nèi)運動，阻礙了非輻射衰變，熒光發(fā)射增強。在3.5%～11.75%范圍三酰甘油聚合物的濃度與探針熒光強度線性相關，探針1 min內(nèi)完成檢測，檢測結果與目前食品行業(yè)的國家標準方法HPLC分析結果高度一致，表明了該探針在糧油檢測應用中的可行性。

聯(lián)氨廣泛用于軍事、航天、藥物合成等領域，但聯(lián)氨對生物體具有高毒性。美國環(huán)境保護署(EPA)確定最低濃度為10 μg/kg的聯(lián)氨是一種潛在致癌物，因此需建立靈敏的檢測方法追溯聯(lián)氨在環(huán)境和食品中的富集。

Qi等[36]制備了聯(lián)氨探針31，醋酸酯基團與聯(lián)氨反應而分解，基于激發(fā)態(tài)分子內(nèi)質子轉移(ESIPT)機制探針熒光強度增強。該探針具有寬的線性范圍(0～20個當量)以及高選擇性。探針在淘米水中聯(lián)氨檢測結果表明探針應用不易受檢測環(huán)境影響。

1.4 真菌毒素

糧油中的真菌毒素以黃曲霉毒素和赭曲霉毒素最具代表性，常見于谷物、油籽等食品中[37]。黃曲霉毒素B1(AFB1)在黃曲霉毒素系列中毒性最強，具有致突變、致畸、和致癌作用，被國際癌癥研究機構(IARC, 2002)歸為I類致癌物[38]。赭曲霉毒素中以赭曲霉毒素A(OTA)最普遍，毒性最強，具有潛在腎毒性。

如圖4所示，Jia等[39]報道了用AIE探針與氧化石墨烯構建的適配體傳感器32。在沒有 AFB1的情況下，探針與適配體聚集復合物通過靜電相互作用吸附在氧化石墨烯表面，由于氧化石墨烯的淬滅效應，不發(fā)射熒光。而在AFB1存在的情況下，適配體與AFB1結合，進而從氧化石墨烯表面釋放，熒光發(fā)射增強。該檢測可以通過簡單地混合探針、適配體、氧化石墨烯及待檢測樣品，操作簡便。并且該傳感器對食品中的其他黃曲霉毒素具有高度選擇性，在已知濃度的食品樣品(玉米、大米等)中得到驗證，LOD為0.25ng/mL。Xia等[40]利用雙末端莖狀適配體信標和AIE探針構建了AFB1傳感器33。該適配體信標保護適配體探針不被外切核酸酶 I (Exo. I) 水解，并能夠特異性識別AFB1。Exo. I是一種核酸酶，可以催化從3'末端起始的單鏈DNA中去除核苷酸，即體系沒有AFB1時，該配體信標結構可避免適配體探針被Exo. I水解，帶正電荷的AIE探針會聚集在帶負電荷的DNA上而點亮；當AFB1存在時，AFB1與適配體競爭結合，導致雙鏈適體信標的結構轉化為兩條單鏈暴露3'末端而被Exo. I水解，AIE探針無法聚集，從而熒光信號低。該檢測方法成功應用于花生油和蠶豆醬中AFB1的分析，在實際樣品檢測應用中，樣品僅需簡單的提取和離心的預處理程序，總回收率為92.75%～118.70%。Zhu等[41]通過相同的AIE探針和酶消化過程的協(xié)同設計了赭曲霉毒素適配體傳感器34，由單鏈DNA設計了OTA適配體。當溶液中沒有目標分子OTA時，探針適配體被Exo. I酶解，探針無法聚合，顯示微弱熒光信號；當溶液中存在目標分子OTA時，適配體會與目標OTA結合，適配體3'末端被隱藏，抵抗Exo. I酶消化過程，此時目標OTA的結合將導致適體序列的更大保留，探針熒光被點亮。該傳感器的LOD為0.4 ng/mL。文章僅展示了在紅酒和咖啡樣品中的檢測應用，未涉及糧油及其制品，但該探針的特異性實驗顯示了該檢測器在不同檢測基質中的應用可能。

圖4 檢測AFB1和OTA探針的結構[39-41]

2 總結與展望

本文重點介紹了有機熒光探針的最新研究進展及其在糧油食品檢測中的應用?；谟袡C熒光探針的傳感技術表明，有機熒光探針可以有效檢測糧油食品中多種內(nèi)源和外源污染物，在完善糧油檢測體系方面具有巨大潛力。

然而有機熒光探針在糧油檢測應用上仍然面臨一些挑戰(zhàn)，主要原因在于糧油及其制品通常樣品基質復雜，存在難以預計的干擾及較多的背景噪音。因此在探針的設計及應用時應當注意：首先，探針熒光波長應與檢測基質熒光波長有顯著差別或選擇不會產(chǎn)生內(nèi)源熒光的化學發(fā)光探針，降低檢測基質中的背景熒光的影響。其次，相較于開關型探針，比率型探針通過雙波長檢測，具有更好的抗干擾能力，因此應注重發(fā)展顏色顯著變化的比率型探針。再次，探針的選擇性識別是準確檢測的前提，因此迫切需要針對檢測物精確設計具有高選擇性的探針，特別是應該注重與常用的特異識別技術的結合，如抗體抗原反應、適配體識別、分子印跡、核酸雜交技術等。另外，熒光探針技術在糧油領域的應用仍然處在早期階段，在熒光探針的開發(fā)過程中，應注意探針的成本、毒性等問題。

有機熒光探針在糧油及其制品檢測領域取得了快速的發(fā)展，但在廣泛應用于實際領域之前仍存有很多工作需要做，這些工作的完成需要多領域不同學科的密切合作。