杜 杰， 林春蘭， 鄭繡蒨， 劉昌樹(shù)

(佳格投資(中國(guó))有限公司，上海 201103)

維生素A(VA)和維生素E(VE)是一類脂溶性維生素[1]，VA中的視黃醇活性物質(zhì)和VE中的各生育酚可作為人體有益的功效成分[2]，維生素E具有人體抗氧化的功效[3]。其中最常見(jiàn)的4種維生素E有α-VE、β-VE、γ-VE、δ-VE[4]。VA不穩(wěn)定，常以酯化物的形態(tài)存在，市面上常用的功效添加劑為維生素A醋酸酯。有研究使用相同前處理同時(shí)檢測(cè)魚(yú)肝油中維生素A、D、E的方法[5]。GB 5009.82—2016《食品中維生素A、D、E的測(cè)定》針對(duì)維生素A使用紫外檢測(cè)器，而維生素E使用熒光檢測(cè)器。前處理復(fù)雜，皂化提取需分開(kāi)進(jìn)樣且前分析時(shí)間冗長(zhǎng)。也有學(xué)者對(duì)于前處理做快速檢測(cè)VA及VE并進(jìn)行定量的方法[6]，但穩(wěn)定性差。本方法采用高效液相色譜法同時(shí)測(cè)定VA和VE，利用液相紫外檢測(cè)器的雙波長(zhǎng)進(jìn)行分析[8]，進(jìn)一步優(yōu)化了液相色譜外標(biāo)法的前處理過(guò)程，同時(shí)對(duì)不同食用油中VA和VE進(jìn)行測(cè)定，并通過(guò)方法驗(yàn)證完善和確效分析方法的準(zhǔn)確性，節(jié)約操作時(shí)間。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

食用植物油；無(wú)水乙醇(分析純)；丙酮(色譜純)；甲醇(色譜純)；二丁基羥基甲苯BHT(分析純)；α-VE CAS號(hào)10191-41-0，純度≥96%、 β-VE CAS號(hào)148-03-8，純度≥96%、 γ-VE CAS號(hào)54-28-4，純度≥96%、 δ-VE CAS號(hào)119-13-1，純度≥96%；VA醋酸酯CAS號(hào)127-47-9，純度≥95%。

1.2 儀器與設(shè)備

DHG-9420A電熱鼓風(fēng)干燥箱，HWS-12型電熱恒溫水浴鍋：KQ-300E超聲震蕩儀，TDL-5-A離心機(jī)，UV-1800紫外分光光度計(jì)，LC-VWD Agilent 1260高效液相色譜儀配紫外檢測(cè)器。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制

VA醋酸酯母液配制：準(zhǔn)確稱取0.2 gVA醋酸酯標(biāo)準(zhǔn)品，用0.1%BHT甲醇溶液溶解后，轉(zhuǎn)移入10 mL容量瓶中，定容至刻度，渦旋2 min，混勻，超聲3 min。此溶液中VA醋酸酯質(zhì)量濃度為20 mg/mL，在-20 ℃下避光保存，有效期180 d。

VA醋酸酯標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液配制：準(zhǔn)確吸取VA醋酸酯母液(20 mg/mL)0.1 mL于10 mL容量瓶中，用0.1%BHT甲醇定容至刻度，渦旋2 min，混勻，超聲3 min。此溶液中VA醋酸酯質(zhì)量濃度為200 μg/mL，在-20 ℃下避光保存，有效期15 d。

VE母液配制：分別準(zhǔn)確稱取α-VE、β-VE、γ-VE、δ-VE各100 mg，用無(wú)水乙醇溶解后，轉(zhuǎn)移入10 mL容量瓶中，定容至刻度，此溶液質(zhì)量濃度為10 mg/mL。將溶液分裝轉(zhuǎn)移至棕色試劑瓶中，在-20 ℃下避光保存有效期180 d。

VE標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液配制：吸取標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液(10 mg/mL)1 mL用無(wú)水乙醇溶解后，容量瓶中定容至10 mL，定容至刻度，此溶液質(zhì)量濃度為1 mg/mL。將溶液轉(zhuǎn)移至棕色試劑瓶中在-20 ℃下避光保存，有效期15 d。

1.3.2 油脂樣品前處理

準(zhǔn)確稱取充分混勻的油樣2 g，精確到小數(shù)點(diǎn)后4位，于10 mL容量瓶中。用丙酮定容至10 mL，渦旋2 min，混勻，超聲振蕩3 min，過(guò)0.22 μm有機(jī)濾膜，HPLC分析。

1.3.3 高效液相色譜條件

HPLC：Agilent 1260；管柱：Athena C30，長(zhǎng)度250 mm，內(nèi)徑4.6 mm，粒徑5 μm；流速：0.8mL/min；進(jìn)樣量：10 μL；柱溫20 ℃；紫外檢測(cè)器波長(zhǎng)：325 nm和294 nm 雙波長(zhǎng)；洗脫時(shí)間：30 min；流動(dòng)相∶甲醇∶水，梯度洗脫時(shí)間見(jiàn)表1。

表1 不同時(shí)間的VA和VE標(biāo)準(zhǔn)曲線

1.3.4 計(jì)算

式中：X為試樣中VA和VE的含量/μg/100 g；P為根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算得到的試樣中VA和VE的濃度/μg/mL；V為定容體積/mL；f為換算因子(VA醋酸酯:f=0.872；VE:f=1)；100為試樣中以每100 g計(jì)算的換算系數(shù)；m為試樣的稱樣量/g；a為實(shí)際濃度/校正濃度。

VE含量=α-VE含量+0.5β-VE含量+0.1γ-VE含量+0.01δ-VE含量。

1.3.5 濃度較正

取VA和VE標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液100 μL于10 mL棕色容量瓶中，用無(wú)水乙醇定容至刻度，混勻，用1 cm石英比色皿，以無(wú)水乙醇為空白參比[8]，測(cè)定其吸光值，試液中VA和VE的濃度計(jì)算公式：

X=A×104/E

式中：X為VA和VE標(biāo)準(zhǔn)稀釋液質(zhì)量濃度/μg/mL；A為維生素稀釋液的平均紫外吸光值；104為換算系數(shù)；E為維生素1%比色光系數(shù)，各維生素在乙醇相應(yīng)的比色吸光系數(shù)見(jiàn)表2。

表2 各目標(biāo)物的波長(zhǎng)以及比色光系數(shù)

2 結(jié)果與討論

2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立

根據(jù)液相色譜紫外檢測(cè)器雙波長(zhǎng)分析[9]，利用標(biāo)準(zhǔn)品儲(chǔ)備液(VA醋酸酯、α-VE、β-VE、γ-VE、δ-VE)進(jìn)行不同濃度下標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制，不同時(shí)間的VA和VE標(biāo)準(zhǔn)曲線見(jiàn)表3。

表3 不同時(shí)間的VA和VE標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.2 專一性、精密度和回收率

2.2.1 專一性(鑒別實(shí)驗(yàn))

HPLC分析VA和VE的含量，標(biāo)準(zhǔn)品的保留時(shí)間在294 nm下32.12、29.49、28.80、26.07 min分別有α-VE、β-VE、γ-VE、δ-VE等VE組分，并保留時(shí)間在325 nm下13.77 min，有VA醋酸酯組分出峰?？ㄗ延图坝衩子蚔A和VE的保留時(shí)間與標(biāo)準(zhǔn)品保持一致，VA醋酸酯高效液相色譜圖和VE生育酚高效液相色譜圖如圖1所示，儀器方法所需時(shí)間變化如圖2所示。

圖1 325 nmVA醋酸酯高效液相色譜圖

圖2 294 nmVE各組分高效液相色譜圖

使用同時(shí)測(cè)定儀器方法進(jìn)行分析，可使分別測(cè)定的分析總時(shí)長(zhǎng)從每一針65 min減少到40 min，大大節(jié)約了分析時(shí)間，提高了檢測(cè)的效率，見(jiàn)表4。

表4 同時(shí)檢測(cè)儀器方法的優(yōu)勢(shì)

2.2.2 樣品精密度

重復(fù)實(shí)驗(yàn)樣品不同植物油進(jìn)行分析(n=6)，VA含量葵花籽油平均735.58 μg/100 g，玉米油平均672.06 μg/100 g，組間VA含量RSD分別為0.84%和1.39%，VE含量以α-TE(α當(dāng)量)葵花籽油平均53.70 mg/100 g，玉米油平均25.52mg/100 g，組間VE含量RSD分別為2.01%和3.41%，綜合重復(fù)性實(shí)驗(yàn)，結(jié)果顯示精密度良好，見(jiàn)表5～表11。本方法對(duì)VA和VE的分析具有良好的精密度和重復(fù)性。

表5 葵花籽油樣品精密度分析

表6 玉米油樣品精密度分析

表7 橄欖油樣品精密度分析

表8 大豆油樣品精密度分析

表9 菜籽油樣品精密度分析

表10 芝麻油樣品精密度分析

表11 花生油樣品精密度分析

2.2.3 樣品回收率

稱取樣品分別添加低、中、高3個(gè)加標(biāo)水平的標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，計(jì)算樣品含量與加標(biāo)后含量的偏差，回收率=(加標(biāo)后測(cè)定值-樣品本底值)/加標(biāo)量×100%。不同加標(biāo)水平的VA和VE回收率見(jiàn)表12，樣品中VA醋酸酯、α-VE、β-VE、γ-VE、δ-VE回收率范圍分別為95.8%～104.4%、96.2%～101.9%、98.2%～107%、103%～112%、98.5%～101%，回收率范圍滿足GB/T 27404—2008《實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量控制規(guī)范食品理化檢測(cè)》。

表12 不同加標(biāo)水平的VA和VE回收率

2.2.4 檢出限(LOD)和定量限(LOQ)

將樣品用丙酮配置成一系列濃度的溶液，按檢測(cè)方法制備、測(cè)定并進(jìn)行含量分析，直至分析峰面積低于S/N范圍時(shí)，選擇前一樣品濃度，分析3次后確認(rèn)滿足檢出限和定量限范圍。計(jì)算色譜圖的S/N比。其中S為響應(yīng)信號(hào)值；N為噪聲值。S/N為3∶1的濃度為最低檢出限；S/N為10∶1的濃度為最低定量限，VA和VE的檢出限和定量限見(jiàn)表13。

表13 VA和VE的檢出限和定量限

2.3 油樣中VA和VE的檢測(cè)

利用本方法對(duì)不同植物油中VA和VE進(jìn)行測(cè)定。對(duì)葵花籽油檢測(cè)結(jié)果可知，葵花籽油中檢測(cè)出α-VE、β-VE、γ-VE、δ-VE等4種VE，其中α-VE含量最多，δ-VE未檢出?？ㄗ延蜆悠分蠽E(α-TE)的含量為(54.33±2.92)mg/100 g，葵花籽油中VA含量為(735.58±3.86)μg/100 g。玉米油的檢測(cè)結(jié)果顯示，玉米油中檢測(cè)出α-VE、β-VE、γ-VE、δ-VE等4種VE含量，其中γ-VE含量最多，β-VE未檢出。玉米油中VE(α-TE)的含量為(24.78±1.36)mg/100 g，玉米油中VA含量為(676.75±2.15)μg/100 g，其他植物油含量見(jiàn)表14。

表14 不同植物油中VA和VE含量

3 結(jié)論

利用液相色譜法測(cè)定食用油中VA和VE，由于標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)VA醋酸酯以及VE的紫外吸收波長(zhǎng)不同[10]，利用現(xiàn)代液相色譜儀器的優(yōu)勢(shì)，紫外檢測(cè)器雙波長(zhǎng)的選擇，通過(guò)雙波長(zhǎng)檢測(cè)同時(shí)測(cè)定了VA和VE的各組分。實(shí)現(xiàn)節(jié)約測(cè)試時(shí)間和同種樣品同步化處理[11]。實(shí)驗(yàn)由標(biāo)準(zhǔn)曲線外標(biāo)法定量，丙酮溶解油中維生素物質(zhì)，操作簡(jiǎn)易。實(shí)驗(yàn)表明，該方法的專一性強(qiáng)、VA的精密度RSD為0.84%～1.39%，回收率范圍在95.8%～104.4%；VE的各組分精密度RSD為2.01%～4.14%，回收率范圍在96.2%～112%。本方法也可應(yīng)用于測(cè)定食用油中VA和VE。測(cè)得葵花籽油VA含量(735.58±3.86)μg/100 g，VE的含量為(54.33±2.92)mg/100 g；玉米油VA含量(676.75±2.15)μg/100 g，VE的含量為(24.78±1.36)mg/100 g。通過(guò)實(shí)驗(yàn)條件測(cè)定和方法驗(yàn)證，建立了一個(gè)有效同時(shí)測(cè)定食用油中VA和VE的方法，該方法相較于標(biāo)準(zhǔn)方法更適用于食用油產(chǎn)品的測(cè)定，減少萃取和皂化多過(guò)程中對(duì)樣品維生素物質(zhì)的干擾，節(jié)約操作時(shí)間和溶劑。相較于分別利用液相色譜法測(cè)定單一VA和VE進(jìn)行2次處理2次上機(jī)，節(jié)約了成本，具有步驟簡(jiǎn)單，重復(fù)性好精密度高等特點(diǎn)。該方法可以應(yīng)用于不同油脂中VA和VE的含量分析，提供優(yōu)質(zhì)功能性和營(yíng)養(yǎng)化訴求的研究依托，為進(jìn)一步提升油脂行業(yè)的檢驗(yàn)檢測(cè)和健康廚房糧油趨勢(shì)提供了參考。