陳曉祥， 楊 璐， 于思琳， 郭雪麗， 張 珂

(石河子大學(xué)藥學(xué)院1，石河子 832002) (新疆林果樹種選育與栽培重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室2，烏魯木齊 830052) (新疆林木資源與利用國家林業(yè)和草原局重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室3，烏魯木齊 830052) (哈爾濱醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院4，哈爾濱 150000)

葡萄籽是葡萄科葡萄屬葡萄(Vitisvinifera)果實(shí)的種子。新疆吐魯番屬于國家優(yōu)質(zhì)葡萄主要生產(chǎn)基地，擁有極豐富的葡萄品種。所產(chǎn)葡萄通常多數(shù)用于釀酒[1]，而在此過程中會產(chǎn)生大量以葡萄籽為主的皮渣廢棄物[2]，這說明我國具有豐富的的葡萄籽資源。

葡萄籽油以葡萄籽提煉制成，富含90%左右的不飽和脂肪酸[3]，以亞油酸和油酸為主，可促進(jìn)膽固醇代謝，使人體血液黏稠度降低，改善血液微循環(huán)，起到防止血栓形成、防治動脈硬化和心肌梗塞的作用[4]。同時(shí)葡萄籽油還是少量具有良好活性的親脂性化合物的天然寶貴來源，如生育酚、生育三烯酚和甾醇等[5,6]。目前葡萄籽油已作為部分降壓藥的有效成分應(yīng)用于醫(yī)藥領(lǐng)域[4]，還可與其他油脂復(fù)配，提高食用油的抗氧化力并延長保質(zhì)期[7]。但葡萄籽油中這些活性物質(zhì)的含量及活性隨著提油技術(shù)、葡萄品種、種植條件等因素的不同而存在一定的差異[8，9]。

目前我國對葡萄籽油的研究多集中于部分品種，如赤霞珠、霞多麗、紅提等[8，10,11]，提取方式多采用索式提取法，且只對含量較高的幾種脂肪酸進(jìn)行相對定量[12,13]。此種方法耗時(shí)長，樣品用量大，脂肪酸的組成及含量的檢測有限[14,15]。因此，為進(jìn)一步開發(fā)葡萄籽，提高對不同品種葡萄籽的利用效率，本研究采集了40個作為新疆吐魯番地區(qū)主栽品種的葡萄，建立了超聲波輔助提取法提取油脂，氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀為基礎(chǔ)進(jìn)行定性和定量的方法，對這些葡萄籽進(jìn)行油脂提取和脂肪酸成分及含量分析，以選擇出更適宜進(jìn)行葡萄籽油提取的葡萄品種，促進(jìn)葡萄籽在食品、化妝品和制藥行業(yè)中作為二次原料再利用[16]。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

1.1.1 原料及試劑

40個品種葡萄鮮樣，采于新疆吐魯番，分離出新鮮葡萄籽后，于-20 ℃冰箱中保存?zhèn)溆?。十九烷酸乙酯?7種脂肪酸甲酯混標(biāo)、異辛烷(色譜純)、正庚烷(色譜純)、石油醚(60～90 ℃)、正己烷、乙酸乙酯、氫氧化鉀、硫酸氫鈉、甲醇均為分析純。

1.1.2 儀器與設(shè)備

7890A/5975C GC-MS聯(lián)用儀，Syncore Plus平行濃縮儀，MM400混合球磨儀。

1.2 方法

1.2.1 標(biāo)準(zhǔn)及內(nèi)標(biāo)溶液的配制

內(nèi)標(biāo)液的制備：準(zhǔn)確稱取50 mg十九烷酸乙酯，取正庚烷溶解并定容至10 mL，配制成5 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)品溶液。

脂肪酸甲酯混標(biāo)儲備液制備：取25 mg脂肪酸甲酯混標(biāo)，正庚烷溶解并定容至5 mL，配制成5 mg/mL的混標(biāo)溶液。

1.2.2 樣品前處理

取適量新鮮的葡萄籽，經(jīng)液氮冷凍后研磨成粉末，精密稱取1 g粉末于離心管中，加入20 mL石油醚，密封，超聲30 min后離心，取上清液于平行濃縮儀中真空濃縮，再105 ℃烘1 h以除雜，所得葡萄籽油留存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 樣品的甲酯化

準(zhǔn)確量取葡萄籽油15 mg(精確到0.1 mg)，加2 mL異辛烷溶解油脂，試樣溶解后加入2 mol/L的氫氧化鉀甲醇溶液200 μL進(jìn)行甲酯化，蓋上蓋子猛烈振搖30 s后靜置5 min，加入5 mg/mL內(nèi)標(biāo)溶液50 μL，混勻，再加入約1 g硫酸氫鈉，猛烈振搖，中和氫氧化鉀，待鹽沉淀后取上清液稀釋至合適濃度，經(jīng)0.22 μm微孔濾膜過濾待測。

1.2.4 儀器條件

色譜柱為HP-88 毛細(xì)管柱(100 m×0.2 mm×0.25 μm)；進(jìn)樣口溫度250 ℃；柱箱升溫程序初始溫度為75 ℃，10 ℃/min升至165 ℃，保持1.5 min，再1.5 ℃/min升至185 ℃，保持5 min, 再1.5 ℃/min升至195 ℃，保持5 min再3.2 ℃/min升至240 ℃，保持8 min。離子源為EI源，溫度230 ℃。載氣為He，流速為1.0 mL/min；進(jìn)樣方式為分流模式，分流比10∶1；進(jìn)樣量為0.5 μL。定性分析為全掃描模式(SCAN)，掃描范圍為50～500m/z，定量分析為選擇離子模式(SIM)，以豐度最高的碎片離子作為定量離子。

1.2.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

本方法對標(biāo)準(zhǔn)溶液采用保留時(shí)間與特征選擇離子雙重定性，所得數(shù)據(jù)通過質(zhì)譜標(biāo)準(zhǔn)庫NIST庫進(jìn)行鑒定。脂肪酸含量通過內(nèi)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)曲線法進(jìn)行定量。SPSS 26.0對數(shù)據(jù)進(jìn)行T檢驗(yàn)，SIMCA 14.0軟件進(jìn)行聚類分析。

注：1∶C12∶0；2∶C14∶0；3∶C15∶0；4∶C16∶0；5∶C16∶1；6∶C17∶0；7∶C18∶0；8∶C18∶1n9c；9∶C18∶2n6t；10∶C19∶0(內(nèi)標(biāo))；11∶C18∶2n6c；12∶C20∶0；13∶C18∶3n3；14∶C20∶1；15∶C21∶0；16∶C20∶2；17∶C22∶0；18∶C20∶3n6；19∶C23∶0；20∶C24∶0。圖1 樣品中脂肪酸甲酯色譜圖

2 結(jié)果與分析

2.1 色譜條件的確定

在該色譜條件下，內(nèi)標(biāo)物十九烷酸乙酯及37種脂肪酸甲酯混合標(biāo)準(zhǔn)品顯示出較好的分離效果，基本達(dá)到基線分離。圖1是樣品的總離子流色譜圖，除內(nèi)標(biāo)外，可檢測出19種脂肪酸，葡萄籽油中含量較高的脂肪酸主要是棕櫚酸(C16∶0)、硬脂酸(C18∶0)、油酸(C18∶1n9c)和亞油酸(C18∶2n6c)4種，集中在20～40 min被分離。

2.2 提取方法的確定與優(yōu)化

2.2.1 提取方式考察

精密稱取5.0 g葡萄籽粉末于索氏抽提器中，注入200 mL石油醚，保持微沸狀態(tài)回流提取8 h。提取所得液體于40 ℃下減壓濃縮并105 ℃烘1 h。所得葡萄籽油進(jìn)行衍生并上機(jī)測試。

該方法下所得油樣可測得21種脂肪酸，總含量為59.20 g/100 g油。超聲波輔助提取法所得油樣可測得19種脂肪酸，總含量為73.62 g/100 g油。與前者相比，超聲波輔助提取法所得油樣無法檢測到六烷酸(C6∶0)及八烷酸(C8∶0)，但二者總含量僅為0.06 g/100 g油。綜合考慮，超聲波輔助提取法可測得的脂肪酸總含量更高，且方便高效，更適宜于批量樣品的檢測，因而可以選用超聲波輔助提取法進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

2.2.2 前處理?xiàng)l件優(yōu)化

精密稱取1 g葡萄籽粉于離心管中，加入石油醚，超聲提取一定時(shí)間后離心，取上清液真空濃縮并高溫除雜。固定其他因素，分別考察不同提取溶劑(石油醚、乙酸乙酯、正己烷)，料液比(m/V為1∶10、1∶15、1∶20、1∶25)，提取時(shí)間(15、30、45、60 min)對37種脂肪酸提取影響。

3種提取溶劑所得油樣均可檢測到19種脂肪酸，其中飽和脂肪酸有11種，單不飽和脂肪酸3種，多不飽和脂肪酸5種。肪酸總含量的結(jié)果在不同提取溶劑中分別為，乙酸乙酯(79.53 g/100 g油)>石油醚(73.62 g/100 g油)>正己烷(73.34 g/100 g油)，乙酸乙酯所得油樣較渾濁，易造成定量不準(zhǔn)確，綜合考慮選擇石油醚作為提取劑。4種料液比下所得油樣均可檢測到19種脂肪酸，料液比1∶20時(shí)測得總含量最高，為71.05 g/100 g。4種提取時(shí)間下所得油樣均可檢測到19種脂肪酸，超聲時(shí)間為30 min時(shí)測得總含量最高，為71.28 g/100 g。因此，確定石油醚作為提取劑，料液比1∶20，超聲時(shí)間30 min為葡萄籽油最優(yōu)提取條件。

2.3 方法學(xué)考察

將原混合標(biāo)準(zhǔn)溶液分別稀釋成不同濃度水平的標(biāo)樣上機(jī)檢測，各脂肪酸甲酯與內(nèi)標(biāo)峰面積比值為y，各脂肪酸甲酯與內(nèi)標(biāo)濃度比為x，進(jìn)行線性回歸。結(jié)果中，內(nèi)標(biāo)物及37種脂肪酸甲酯在60 min內(nèi)均被良好分離，各回歸方程的決定系數(shù)R2為0.999 0～0.999 8，線性范圍為0.02～23.67 μg/mL。

取合適濃度脂肪酸甲酯混標(biāo)溶液連續(xù)檢測6次以考察儀器精密度，各組分含量的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差值(RSD)在3.1%～3.9%之間。另檢測6份平行處理得到的樣品以考察實(shí)驗(yàn)方法的重復(fù)性，測得結(jié)果RSD值在0.12%～4.34%之間。取其中1份樣品，分別于0、6、12、24、36、48、72 h時(shí)檢測，72 h時(shí)檢測與第1次檢測結(jié)果的RSD值小于5.0%，說明該樣品在72 h內(nèi)可保持穩(wěn)定。向樣品中添加一定量標(biāo)準(zhǔn)品以考察方法的加標(biāo)回收率，設(shè)置6個平行，計(jì)算得各組分平均回收率在74.09%～107.52%之間，RSD值在1.12%～5.28%之間。該方法可行。

2.4 不同品種葡萄籽油中脂肪酸組成及含量的測定

從40個品種葡萄籽油的脂肪酸成分及含量測定結(jié)果中可以看出，脂肪酸總含量在65.98～99.75 g/100 g之間，亞油酸、油酸、棕櫚酸和硬脂酸為葡萄籽油脂肪酸的主要成分。多不飽和脂肪酸(PUFA)占總脂肪酸的66.59%～83.09%，單不飽和脂肪酸(MUFA)為11.24%～25.09%，飽和脂肪酸(SFA)為5.23%～9.32%。所測葡萄籽油中脂肪酸含量關(guān)系均為多不飽和脂肪酸最高，飽和脂肪酸含量最少，這與之前的相關(guān)報(bào)道一致[17,18]。這些葡萄籽油中有14個品種的脂肪酸總含量在90 g/100 g以上，同時(shí)，這些品種的不飽和脂肪酸總含量均在87.50 g/100 g以上。40個品種中赤林的總脂肪酸含量和不飽和脂肪酸含量均最低，總脂肪酸含量為65.98 g/100 g，不飽和脂肪酸含量為60.25 g/100 g。沈農(nóng)金皇后總脂肪酸含量最高，是赤林的1.51倍，為99.75 g/100 g。巨玫瑰的不飽和脂肪酸含量最高，為93.10 g/100 g，是赤林的1.55倍。作為人體必需脂肪酸亞油酸，在灰比諾品種葡萄籽油中含量最高，其次是赤霞珠?；冶戎Z品種葡萄籽油中亞油酸為79.45 g/100 g，是赤林的1.69倍，占總脂肪酸含量的81.42%。其多不飽和脂肪酸含量為79.73 g/100 g，在40個品種中含量也是最高的。這些品種的葡萄籽適宜作為良好的油源進(jìn)行后續(xù)的加工利用，其中灰比諾可作為生產(chǎn)富含亞油酸葡萄籽油的優(yōu)質(zhì)品種。

葡萄籽油中可檢測到的主要的反式脂肪酸(TFA)為反油酸(C18∶2n6t)，植物油氫化是TFA的主要來源[19]。TFA攝入過多易誘導(dǎo)血脂異常，促進(jìn)氧化應(yīng)激，從而增加心血管疾病發(fā)生的危險(xiǎn)[20,21]。40種葡萄籽油反油酸的含量為總脂肪酸含量的0.03%～0.14%，普遍低于市面常見的食用植物油[22]。

油中脂肪酸總含量較低的葡萄籽品種有赤林、蛇龍珠、大巨峰、晚紅蜜、紅達(dá)拉伊利，總含量均在70 g/100 g以下。這些品種的葡萄籽油中推測含有較高濃度的親脂性化合物，如生育酚和植物甾醇等[5,6]，這類化合物同樣具有一定生物活性。在制藥、食品和化妝品工業(yè)中，這類品種的葡萄籽可以應(yīng)用于富含此類化合物產(chǎn)品的開發(fā)利用。從而更好地提高各品種葡萄籽的應(yīng)用價(jià)值。

2.5 脂肪酸聚類分析

為了進(jìn)一步通過脂肪酸含量分析不同品種葡萄籽油之間的差異，使用SIMCA 14.1軟件對40個品種葡萄籽油進(jìn)行聚類分析。如圖2所示，樹狀圖中有2個明顯的主要分支，即40個品種的葡萄籽油可被明顯分為兩類，各分支下的品種脂肪酸成分組成相似，距離越近，則相似度越大。在實(shí)際生產(chǎn)過程中，以脂肪酸構(gòu)成相似的葡萄籽品種作為油源，有助于產(chǎn)品的一致性，而組成相差較大的品種則相反。根據(jù)樹狀圖結(jié)果將各葡萄籽油樣品分為兩組，即組1和組2，以飽和脂肪酸、單不飽和脂肪酸、多不飽和脂肪酸和反式脂肪酸含量為指標(biāo)，對兩組樣品間成分進(jìn)行T檢驗(yàn)，結(jié)果顯示兩組樣品的四類成分之間均有顯著差異(P<0.05)。

圖2 不同品種葡萄籽油的聚類分析圖

進(jìn)一步對組1和組2進(jìn)行有監(jiān)督的正交偏最小二乘判別分析，結(jié)果見圖3。OPLS-DA模型中R2X、R2Y和Q2分別為0.942、0.822和0.806，表明此模型擬合較好。結(jié)合S-plot圖和VIP>1的化合物可知，亞油酸和油酸對于品種間的分類具有較大貢獻(xiàn)率，可作為區(qū)分不同品種間葡萄籽油的差異性成分，為后續(xù)區(qū)分品種質(zhì)量提供初步參考依據(jù)。

圖3 不同品種葡萄籽油的OPLS-DA圖(a)和S-plot圖(b)

3 結(jié)論

本研究建立了GC-MS定性定量分析葡萄籽油中37種脂肪酸標(biāo)準(zhǔn)樣品中脂肪酸成分的檢測方法，相比于傳統(tǒng)的索式提取法，該方法前處理簡單，準(zhǔn)確可靠，更適用于對批量樣品中脂肪酸含量的測定。本實(shí)驗(yàn)確定了灰比諾、赤霞珠、沈農(nóng)金皇后、巨玫瑰等品種可作為富含脂肪酸的葡萄籽油提取的優(yōu)勢品種，其中灰比諾品種葡萄籽油中亞油酸含量最高，赤霞珠其次。亞油酸和油酸對不同品種葡萄籽油的分類具有較大貢獻(xiàn)作用，可為后續(xù)品種的比較研究及利用提供一定參考。