韓秋革，員浬，劉孟敏?，郭楊，馬勇，孫杰，王禮寧，潘婭嵐

（1. 南京中醫(yī)藥大學(xué)，江蘇 南京 210023；2. 南京中醫(yī)藥大學(xué)骨傷修復(fù)與重建新技術(shù)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 南京 210023）

原發(fā)性骨質(zhì)疏松癥（primary osteoporosis，POP）是一種以低骨量、骨組織退化和骨微結(jié)構(gòu)破壞為特征，由多種病因引起的骨代謝障礙類疾病，它會(huì)導(dǎo)致骨強(qiáng)度受損并且增加骨折的風(fēng)險(xiǎn)［1］。全球骨質(zhì)疏松癥患者已超過2 億，病發(fā)率超過25%［2］，已成為嚴(yán)重影響人們身體健康的慢性疾病之一。目前，治療骨質(zhì)疏松癥的藥物主要有兩大類：一是促進(jìn)骨形成的藥物，如雙膦酸鹽、雌激素、降鈣素等；二是抑制骨吸收的藥物，如甲狀旁腺激素、合成類固醇等。盡管這些藥物均在治療骨質(zhì)疏松方面發(fā)揮一定療效，但都存在著不良反應(yīng)［3-6］。

中醫(yī)學(xué)認(rèn)為，POP 屬本虛標(biāo)實(shí)之證，病位在腎，本虛以腎為主，涉及肝陰、脾氣和氣血不足；標(biāo)實(shí)多為氣滯血瘀?；诖?，馬勇等提出在治療上應(yīng)以補(bǔ)腎通絡(luò)為主，兼以益氣化瘀、活血通絡(luò)［7］。溫腎通絡(luò)止痛方具有溫陽、通絡(luò)、除痹、止痛等功效，已在江蘇省中醫(yī)院應(yīng)用十余年，臨床療效較好［8］。課題組已申請(qǐng)發(fā)明專利［9］（申請(qǐng)公布號(hào)：CN 107823493 A），并建立了溫腎通絡(luò)止痛方質(zhì)量控制方法［10］，且研究發(fā)現(xiàn)該方能夠明顯增加去卵巢大鼠血清生化指標(biāo)OPG/RANKL 比值，抑制破骨細(xì)胞活性，促進(jìn)脂肪細(xì)胞分泌外泌體，影響骨髓內(nèi)BMSC 的成骨與成脂分化，發(fā)揮抗骨質(zhì)疏松作用［7，10］。但該復(fù)方組分較多，作用機(jī)制尚不明確?；诖?，本研究采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的方法，通過建立“溫腎通絡(luò)止痛方-活性成分-交集靶點(diǎn)-通路-原發(fā)性骨質(zhì)疏松癥”關(guān)系，挖掘其潛在的分子作用機(jī)制并進(jìn)行驗(yàn)證，以期為POP的治療及后續(xù)研究提供依據(jù)。

1 網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)

1.1 溫腎通絡(luò)止痛方活性成分及其潛在靶點(diǎn)的篩選

分別以“附子”“山茱萸”“骨碎補(bǔ)”“淫羊藿”“蛇床子”“薏苡仁”“獨(dú)活”“羌活”“白芍”“白術(shù)”“細(xì)辛”“甘草”為關(guān)鍵詞，利用TCMSP（Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database and Analysis Platform，TCMSP，https：//tcmspw. com/tcmsp. php）檢索各味中藥的活性成分，借助人體藥物代謝動(dòng)力學(xué)參數(shù)ADME預(yù)測(cè)篩選，設(shè)定參數(shù)生物利用度（Oral bioavailability，OB）≥30%，類藥性（Drug likeness，DL）≥0.18；利用TCMID（Traditional Chinese Medicines Integrated Database，TCMID，http：//119.3.41.228：8 000/tcmid/）與BATMANTCM 數(shù)據(jù)庫（http：//bionet. ncpsb. org/batman-tcm/）篩選出狗脊與天麻活性成分及其相關(guān)靶點(diǎn)。利用Uniprot將靶點(diǎn)名稱標(biāo)準(zhǔn)化。

1.2 原發(fā)性骨質(zhì)疏松癥潛在靶點(diǎn)的及藥物和疾病交集靶點(diǎn)的獲取

以“primary osteoporosis”為關(guān)鍵詞，檢索OMIM（Online Mendelian Inheritance in Man，OMIM，https：//www. omim. org/）和GeneCards（https：//www. genecards.org/）數(shù)據(jù)庫，設(shè)置GeneCards 中相關(guān)性分?jǐn)?shù)≥6，整合、去重后靶點(diǎn)即為原發(fā)性骨質(zhì)疏松癥潛在靶點(diǎn)。利用R語言VennDiagram 數(shù)據(jù)包獲取藥物與疾病潛在靶點(diǎn)的交集。

1.3 構(gòu)建溫腎通絡(luò)止痛方防治原發(fā)性骨質(zhì)疏松癥網(wǎng)絡(luò)關(guān)系圖與PPI網(wǎng)絡(luò)視圖

建立復(fù)方、藥物活性成分以及藥物與疾病交集靶點(diǎn)信息文件，將其導(dǎo)入Cytoscape 3.7.2繪制“溫腎通絡(luò)止痛方-活性成分-交集靶點(diǎn)-原發(fā)性骨質(zhì)疏松癥”網(wǎng)絡(luò)視圖，并進(jìn)行網(wǎng)絡(luò)拓?fù)鋵W(xué)分析。將藥物與疾病交集靶點(diǎn)輸入至在線數(shù)據(jù)庫STRING 中，選擇種屬信息為“Homo sapiens”，設(shè)置置信度為0.4，獲得“stringinteraction. tsv”文件。將其導(dǎo)入Cytoscape 3.7.2 軟件中，進(jìn)行網(wǎng)絡(luò)拓?fù)鋵W(xué)分析，設(shè)定度值（Degree）≥50（度值中位數(shù)2倍），篩選核心靶點(diǎn)，并繪制網(wǎng)絡(luò)圖。

1.4 基因本體論和通路富集分析

將藥物與疾病交集靶點(diǎn)輸入至DAVID 數(shù)據(jù)庫中，選擇種屬信息“Homo Sapiens”，選擇GO 富集過程中的生物學(xué)過程（biological process，BP）、細(xì)胞組成（celluar components，CC）與分子生物學(xué)功能（molecular function，MF）以及KEGG 通路，篩選具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）的條目，利用微生信在線網(wǎng)站繪圖，并進(jìn)行分析。

2 驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)

2.1 材料與儀器

SPF 級(jí)雌性C57BL/6J小鼠21只，體質(zhì)量（18±2）g，由南京市青龍山動(dòng)物繁殖場提供，動(dòng)物合格證號(hào)：SCXK（浙）2019-0002。動(dòng)物購進(jìn)后飼養(yǎng)于南京中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，適應(yīng)性飼養(yǎng)1 周后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，SPF 級(jí)條件常規(guī)喂養(yǎng)，12 h/12 h 光暗交替，恒溫、恒濕，動(dòng)物自由攝取飼料和飲用水。本項(xiàng)目動(dòng)物實(shí)驗(yàn)方案經(jīng)南京中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)審查通過（批準(zhǔn)號(hào)：202107A006）。

蘇木素-伊紅（HE）染液（南京建成生物工程研究所，批號(hào)：D006-1-1）；JNK（CST #9252）、p-JNK（abcam ab76572），ERK、p-ERK 抗體、內(nèi)參抗體GAPDH、辣根過氧化物酶（HRP）標(biāo)記羊抗兔免疫球蛋白（Ig）G（美國Proteintech公司，批號(hào)分別為11257-1-AP、28733-1-AP、18165-1-AP、SA00001-2）；總RNA提取試劑盒，逆轉(zhuǎn)錄試劑盒，實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（Real-time PCR）試劑盒（南京諾唯贊生物科技有限公司，批號(hào)分別為RC101-01、R223-01、Q711-02）；非變性組織/細(xì)胞裂解液（北京Solarbio 公司，批號(hào)：R0030）；IL-6、TNF-α ELISA 試劑盒（南京金益柏生物科技有限公司，批號(hào)分別為LA128802H、LA1288 01H）。

Allsheng 型全自動(dòng)多功能酶標(biāo)儀（杭州奧盛儀器有限公司）；VE-180型垂直電泳槽、凝膠成像系統(tǒng)（上海天能科技有限公司）；MAX-TL 型高速冷凍離心機(jī)（美國BeckMan 公司）；SCIENTZ-950E 型超聲波細(xì)胞粉碎機(jī)（寧波新芝生物科技公司）；DM1000 型生物顯微鏡（德國Leica 公司）；mini Trans-blot cell 型電轉(zhuǎn)印槽系列（美國BioRad 公司）；QuantStudio3 型Realtime PCR 儀（美國ABI 公司）；5200CE 型全自動(dòng)化學(xué)發(fā)光圖像分析系統(tǒng)（中國Tanon 公司）；Mastercycler nexus型PCR 儀（德國Eppendorf 公司）；Nano-300 型微量分光光度計(jì)（山東萊索科技有限公司）。

2.2 實(shí)驗(yàn)方法

2.2.1 實(shí)驗(yàn)藥物及制備

溫腎通絡(luò)止痛方由附子8 g、山茱萸10 g、骨碎補(bǔ)30 g、淫羊藿10 g、蛇床子15 g、狗脊10 g、薏苡仁15 g、炒白術(shù)10 g、羌活10 g、獨(dú)活10 g、細(xì)辛3 g、天麻6 g、白芍15 g 和炙甘草6 g 組成。實(shí)驗(yàn)所用藥物均購于江蘇省中醫(yī)院，經(jīng)南京中醫(yī)藥大學(xué)吳德康教授鑒定，均符合2020年版《中華人民共和國藥典》的規(guī)定。按配伍比例取溫腎通絡(luò)止痛方飲片，加入10 倍量的水煎煮1 h。煎煮的藥渣再次加入8 倍量的水煎煮1 h。兩次提取的藥液合并后過濾，濾液通過旋蒸儀減壓濃縮至2 g/mL，4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2.2.2 去卵巢骨質(zhì)疏松癥動(dòng)物模型制備

21 只SPF 級(jí)C57BL/6J 雌性小鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1 周后，隨機(jī)分為假手術(shù)組（7 只）和造模組（14 只）。假手術(shù)組切除卵巢周圍相等質(zhì)量的脂肪組織，造模組均切除雙側(cè)卵巢。于術(shù)后1 周小鼠情況穩(wěn)定后開始連續(xù)給藥8 周。術(shù)后各組小鼠均在相同條件下飼養(yǎng)，自由飲水?dāng)z食。

2.2.3 分組及給藥

將造模組（14只）隨機(jī)分為模型組（7只）與溫腎通絡(luò)止痛方組（7只），根據(jù)人與小鼠體表面積換算法［11］確定小鼠給藥劑量為22 g/kg。給藥灌胃體積為15 mL/kg，假手術(shù)組與模型組給予同等體積生理鹽水。連續(xù)給藥8周。

2.3 觀測(cè)指標(biāo)

2.3.1 HE染色法觀察股骨組織形態(tài)學(xué)變化情況

采集股骨組織，放置4%多聚甲醛中固定24 h 后將其轉(zhuǎn)移至10%EDTA 脫鈣液中脫鈣4 周。二甲苯溶液透明，常規(guī)石蠟包埋。切取5 μm 厚的薄片后，蘇木素染色，1%鹽酸-乙醇分化，1%氨水反藍(lán)，伊紅染色，中性樹脂封片，在倒置顯微鏡下觀察骨組織的病理結(jié)構(gòu)。

2.3.2 ELISA法檢測(cè)小鼠血清IL-6、TNF-α水平

所得血清按照ELISA 試劑盒說明書操作步驟檢測(cè)IL-6、TNF-α的表達(dá)水平。

2.3.3 Real-time PCR 法檢測(cè)脛骨組織中相關(guān)mRNA表達(dá)

取骨組織20 mg，液氮下充分研磨至粉末，使用離心柱提法取骨組織提取總RNA，提取的總RNA 首先去除基因組中的DNA，然后進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，引物序列見表1。以上步驟均按照產(chǎn)品說明書進(jìn)行操作。并按諾唯贊試劑盒說明擴(kuò)增cDNA。使用2-ΔΔct方法計(jì)算mRNA 的相對(duì)表達(dá)量。

表1 PCR引物序列

2.3.4 蛋白免疫印跡法（Western blot）檢測(cè)脛骨組織中蛋白表達(dá)

提取小鼠脛骨組織中總蛋白，BCA測(cè)定蛋白含量。BCA 試劑盒測(cè)定各組蛋白濃度。后續(xù)進(jìn)行電泳，轉(zhuǎn)膜，5%奶粉封閉2 h，一抗ERK（1∶1 000）、p-ERK（1∶1 000）、JNK（1∶1 000）、p-JNK（1∶1 000）、GAPDH（1∶10 000）4 ℃過夜，洗膜后分別加入對(duì)應(yīng)的二抗（1∶10 000，室溫孵育2 h，ECL上機(jī)顯影，使用Image J軟件對(duì)圖像進(jìn)行灰度值分析，以目的蛋白灰度值/內(nèi)參蛋白灰度值表示蛋白相對(duì)表達(dá)量并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

2.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 19.0 對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料以±s表示，多組間比較行單因素方差分析（oneway ANOVA），組間兩兩比較采用 Student-NewmanKeuls（SNK）檢驗(yàn)，P ＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)結(jié)果

3.1.1 溫腎通絡(luò)止痛方防治原發(fā)性骨質(zhì)疏松癥的活性成分與靶點(diǎn)的篩選結(jié)果

經(jīng)TCMSP、TCMID、BATMAN-TCM 數(shù)據(jù)庫檢索并篩選后，發(fā)現(xiàn)溫腎通絡(luò)止痛方防治原發(fā)性骨質(zhì)疏松癥活性成分共203 個(gè)。其中附子3 個(gè)，山茱萸6 個(gè)，骨碎補(bǔ)12個(gè)，淫羊藿17個(gè)，蛇床子11個(gè)，狗脊19個(gè)，羌活7個(gè)，獨(dú)活5個(gè)，細(xì)辛4個(gè)，薏苡仁4個(gè)，炒白術(shù)3個(gè)，白芍13個(gè)，炙甘草83個(gè)，天麻16個(gè)。溫腎通絡(luò)止痛方中各味中藥重復(fù)成分信息見表2。

表2 溫腎通絡(luò)止痛方各味中藥中重復(fù)成分信息

通過GeneCards 與OMIM 數(shù)據(jù)庫檢索、篩選、去重后共獲得1 817 個(gè)疾病靶點(diǎn)，其中GeneCards 數(shù)據(jù)庫中篩選相關(guān)性分?jǐn)?shù)≥6 的疾病靶點(diǎn)共1 428 個(gè)，OMIM 數(shù)據(jù)庫中共389 個(gè)。利用R 語言VennDiagram 數(shù)據(jù)包篩選獲得藥物與疾病交集靶點(diǎn)共154個(gè)。

3.1.2 溫腎通絡(luò)止痛方防治原發(fā)性骨質(zhì)疏松癥網(wǎng)絡(luò)關(guān)系圖

利用Cytoscape 3.7.2繪制“溫腎通絡(luò)止痛方-活性成分-交集靶點(diǎn)-原發(fā)性骨質(zhì)疏松癥”網(wǎng)絡(luò)視圖，共有329 個(gè)節(jié)點(diǎn)（包括復(fù)方與疾病名稱，173 個(gè)活性成分，154個(gè)靶標(biāo)基因），1 175條邊，網(wǎng)絡(luò)密度為0.018，網(wǎng)絡(luò)異質(zhì)性為2.681。除復(fù)方和疾病節(jié)點(diǎn)外，該網(wǎng)絡(luò)圖度值平均值為6.2，其中29個(gè)靶標(biāo)基因、18個(gè)活性成分大于度值平均值，靶標(biāo)基因中ESR1的節(jié)點(diǎn)度最高，其次為AR、PPARG、ESR2等?；钚猿煞种猩借头拥墓?jié)點(diǎn)度最高，其次為槲皮素、β-谷甾醇、木犀草素等。見圖1。

圖1 溫腎通絡(luò)止痛方-活性成分-交集靶點(diǎn)-原發(fā)性骨質(zhì)疏松癥網(wǎng)絡(luò)視圖

3.1.3 PPI網(wǎng)絡(luò)視圖構(gòu)建

利用STRING 在線數(shù)據(jù)庫分析藥物與疾病交集靶點(diǎn)，并利用插件Network Analyzer進(jìn)行網(wǎng)絡(luò)拓?fù)鋵W(xué)分析。PPI 網(wǎng)絡(luò)中共153 個(gè)節(jié)點(diǎn)（置信度≥0.4），2 196 條邊。核心靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖中共有25個(gè)節(jié)點(diǎn)，282條邊，見圖2。按照度值由高到低核心靶標(biāo)基因包括INS、GAPDH、AKT1、IL6等，見表3。度值越大表示與溫腎通絡(luò)止痛方防治原發(fā)性骨質(zhì)疏松癥的關(guān)系越緊密。

表3 核心靶點(diǎn)信息

圖2 PPI網(wǎng)絡(luò)圖節(jié)點(diǎn)拓?fù)浜Y選過程

3.1.4 基因本體論與通路富集分析

GO 富集分析結(jié)果表明具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的功能注釋過程共646個(gè)。其中分子生物學(xué)功能（MF）有104個(gè)條目，細(xì)胞組成（CC）有63 個(gè)條目，生物學(xué)過程（BP）有479 個(gè)條目，見圖3。BP 占較大比例，發(fā)揮主要作用（圖3A）。按照P值由小到大排列，對(duì)BP、CC、MF前十位注釋過程進(jìn)行作圖（圖3B），并對(duì)BP 前20 個(gè)功能注釋過程繪制條形圖（圖3C），顏色越淺表示P值越小，各生物學(xué)過程差異越顯著；條形長度越長表示富集在此過程的基因數(shù)目越多。

在KEGG 富集分析中，共有90 條差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）的信號(hào)通路。其中65條信號(hào)通路具有顯著性差異，共有32 條通路與原發(fā)性骨質(zhì)疏松癥有關(guān)。包括PI3K/Akt、TNF 信號(hào)通路、MAPK 信號(hào)通路等。并將其按照P值由小到大進(jìn)行排列，對(duì)前二十條通路繪制氣泡圖（圖3D）。圖3D 中圓的顏色越深表示P值越小，通路差異越顯著，圓的直徑越大表示富集在這一通路上的基因數(shù)目越多。

圖3 GO與KEGG分析

3.2 溫腎通絡(luò)止痛方對(duì)原發(fā)性骨質(zhì)疏松癥小鼠的作用

3.2.1 HE染色結(jié)果比較

假手術(shù)組小鼠股骨骨小梁形態(tài)完整，排列緊密規(guī)整，小梁間連接呈網(wǎng)狀，骨髓腔較小，骨髓細(xì)胞數(shù)量豐富。模型組小鼠骨小梁形態(tài)結(jié)構(gòu)稀疏，數(shù)量明顯減少，排列紊亂，骨髓腔變大。溫腎通絡(luò)止痛方組小鼠骨小梁結(jié)構(gòu)較前完整，數(shù)量增多，排列尚規(guī)則，連續(xù)完整性較好，骨小梁間隙略有增大。見圖4。

圖4 各組小鼠股骨組織HE染色圖（×100）

3.2.2 ELISA檢測(cè)IL-6、TNF-α表達(dá)水平

與假手術(shù)組比較，模型組小鼠IL-6、TNF-α 表達(dá)水平明顯升高（P＜0.01），溫腎通絡(luò)止痛方可降低模型組小鼠IL-6、TNF-α 的表達(dá)水平（P＜0.01）。見表4。

表4 各組小鼠血清IL-6、TNF-α表達(dá)水平的比較（±s，n=3）

表4 各組小鼠血清IL-6、TNF-α表達(dá)水平的比較（±s，n=3）

注：與假手術(shù)組比較，2）P ＜0.01；與模型組比較，4）P ＜0.01。

組別假手術(shù)組模型組溫腎通絡(luò)止痛方組TNF-α（pg/mL）261.41±6.80 658.42±9.562）245.36±6.014）劑量——22 g/kg IL-6（pg/mL）65.89±4.60 110.58±4.182）81.66±4.154）

3.2.3 qPCR檢測(cè)IL-6、TNF-α、Runx2 mRNA的水平

與假手術(shù)組比較，模型組小鼠IL-6、TNF-α mRNA水平升高（P＜0.01），Runx2 mRNA水平降低（P＜0.01）；溫腎通絡(luò)止痛方能夠降低模型組小鼠IL-6、TNF-α mRNA 水平（P＜0.01），升高Runx2 mRNA 表達(dá)水平（P＜0.01）。見表5。

表5 各組小鼠IL-6、TNF-α、Runx2 mRNA表達(dá)水平的比較（±s，n=3）

表5 各組小鼠IL-6、TNF-α、Runx2 mRNA表達(dá)水平的比較（±s，n=3）

注：與假手術(shù)組比較，2）P ＜0.01；與模型組比較，4）P ＜0.01。

Runx2 1.00±0.10 0.45±0.042）0.72±0.014）組別假手術(shù)組模型組溫腎通絡(luò)止痛方組劑量——22 g/kg IL-6 1.00±0.10 9.99±0.292）8.46±0.674）TNF-α 1.00±0.13 12.21±0.302）11.08±0.164）

3.2.4 Western blot 法檢測(cè)小鼠脛骨組織中p-ERK、ERK、p-JNK、JNK的蛋白表達(dá)水平

與假手術(shù)組比較，模型組p-ERK/ERK、p-JNK/JNK 相對(duì)表達(dá)水平升高（P＜0.05，P＜0.01），溫腎通絡(luò)止痛方可降低模型組小鼠p-ERK/ERK、p-JNK/JNK的蛋白表達(dá)水平。見表6，圖5。

圖5 各組小鼠ERK、p-ERK、JNK、p-JNK蛋白表達(dá)電泳圖

表6 各組小鼠脛骨ERK、p-ERK、JNK、p-JNK蛋白表達(dá)的比較（±s，n=3）

表6 各組小鼠脛骨ERK、p-ERK、JNK、p-JNK蛋白表達(dá)的比較（±s，n=3）

注：與假手術(shù)組比較，2）P ＜0.01；與模型組比較，3）P ＜0.05，4）P ＜0.01。

組別假手術(shù)組模型組溫腎通絡(luò)止痛方組p-ERK/ERK 0.98±0.03 1.18±0.042）1.09±0.023）劑量——22 g/kg p-JNK/GAPDH 0.69±0.00 1.27±0.012）0.85±0.004）JNK/GAPDH 0.32±0.00 0.34±0.002）0.32±0.003）p-JNK/JNK 2.12±0.01 3.75±0.042）2.71±0.024）p-ERK/GAPDH 1.44±0.44 2.22±0.072）1.68±0.044）ERK/GAPDH 1.54±0.03 1.88±0.442）1.48±0.034）

4 討論

原發(fā)性骨質(zhì)疏松癥是現(xiàn)代臨床中常見的骨科疾病，歸屬于“骨痿”“骨痹”“骨枯”等范疇，《黃帝內(nèi)經(jīng)》載：“女子七歲，腎氣盛，齒更發(fā)長……七七，任脈虛，太沖脈衰少，天癸竭，地道不通，故形壞而無子也。丈夫八歲，腎氣實(shí)，發(fā)長齒更……七八，肝氣衰，筋不能動(dòng)，天癸竭，精少，腎臟衰，形體皆極”［12］。

本研究通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法對(duì)溫腎通絡(luò)止痛方治療原發(fā)性骨質(zhì)疏松癥的潛在作用機(jī)制進(jìn)行探究，共篩選出203個(gè)活性成分與154個(gè)靶標(biāo)基因，其中活性成分主要為山柰酚、槲皮素、木犀草素等，靶標(biāo)基因主要為IL-6、TNF-α 等。山柰酚能夠調(diào)節(jié)Ca2+代謝平衡，升高Ⅰ型原膠原羥基端延長肽（PICP），降低Ⅰ型膠原C端肽（ICTP）水平，促進(jìn)骨膠原生成，減少骨小梁丟失，起到對(duì)卵巢去勢(shì)大鼠的治療作用［13］。槲皮素能夠使去卵巢骨質(zhì)疏松癥組大鼠血液中CTX、TRACP-5b 含量顯著降低，有效抑制破骨分化，改善骨質(zhì)疏松癥［14］。木犀草素通過抑制ATF2，p38 MAPK 和NFATc1 的表達(dá)來抑制RANKL誘導(dǎo)的破骨細(xì)胞生成，發(fā)揮抗骨質(zhì)疏松作用［15］。

炎性因子IL-6、TNF-α 等在原發(fā)性骨質(zhì)疏松癥中扮演著重要的角色［16］。在骨微環(huán)境中有許多細(xì)胞能夠產(chǎn)生IL-6，包括成骨細(xì)胞、破骨細(xì)胞和巨噬細(xì)胞等。IL-6 缺失小鼠表現(xiàn)出卵巢切除誘導(dǎo)的骨丟失和破骨細(xì)胞形成減少［17］。TNF-α 被認(rèn)為是最強(qiáng)的抗腫瘤因子。各種類型的細(xì)胞均可產(chǎn)生TNF-α，包括巨噬細(xì)胞、NK細(xì)胞、肥大細(xì)胞等。TNF-α在分化的某些階段能抑制成骨細(xì)胞的活性，并刺激破骨細(xì)胞的增殖和分化，促進(jìn)造血干細(xì)胞向破骨細(xì)胞分化，增加巨噬細(xì)胞中RANK 和RANKL 水平，從而激活多個(gè)靶點(diǎn)如MAPK、TRAF2、JNK、NF-κB，介導(dǎo)破骨細(xì)胞的增殖和分化的因子［18］。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，在小鼠切除卵巢后血清中IL-6、TNF-α 的表達(dá)水平以及脛骨組織中IL-6、TNF-α的mRNA的表達(dá)水平顯著升高，由此提示雌激素能夠抑制IL-6、TNF-α的表達(dá)水平。本研究表明，溫腎通絡(luò)止痛方可抑制IL-6、TNF-α的表達(dá)，此外，溫腎通絡(luò)止痛方組TNF-α 的表達(dá)水平與假手術(shù)組表達(dá)水平相當(dāng)，甚至更低，這表明去卵巢小鼠血清中TNF-α的升高不僅來源于手術(shù)應(yīng)激，還來源于去卵巢引發(fā)的骨代謝失衡。溫腎通絡(luò)止痛方不僅可以糾正骨代謝失衡，還能減輕手術(shù)導(dǎo)致的炎癥反應(yīng)，這體現(xiàn)了中藥多靶點(diǎn)治療的特點(diǎn)，并可以為后續(xù)研究提供一個(gè)新的方向。

KEGG 富集分析可知，與POP 相關(guān)的信號(hào)通路主要有PI3K/Akt 信號(hào)通路、MAPK 信號(hào)通路與破骨細(xì)胞分化等。PI3K/Akt信號(hào)通路是細(xì)胞增殖、轉(zhuǎn)移、黏附及死亡過程中的重要調(diào)節(jié)者，在正常的生理?xiàng)l件下，PI3K/Akt 信號(hào)通路能夠選擇性地影響成骨、破骨細(xì)胞的生理功能，維持骨組織的動(dòng)態(tài)平衡。研究表明，調(diào)控PI3K/Akt 信號(hào)通路能夠促進(jìn)骨髓基質(zhì)細(xì)胞的增殖，阻止炎癥的發(fā)生和發(fā)展，促使骨礦化，提高骨生物力學(xué)，減輕絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥的臨床癥狀［19-20］。MAPKs通路能夠調(diào)控從增殖分化到細(xì)胞凋亡等多種過程，積極參與免疫防御和炎癥反應(yīng)，該通路主要有Erk1/2、p38 和JNK 三條途徑［21］。通過MAPK 激活將細(xì)胞外刺激信號(hào)傳遞給適當(dāng)?shù)募?xì)胞內(nèi)分子已被證實(shí)是調(diào)節(jié)破骨細(xì)胞分化和骨重建所必需的過程。破骨細(xì)胞階段阻斷JNK活性導(dǎo)致TRAP陽性細(xì)胞逆轉(zhuǎn)為TRAP陰性細(xì)胞（代表破骨細(xì)胞前體），即使在持續(xù)存在RANKL 的情況下也是如此，說明JNK 途徑是維持破骨細(xì)胞分化所必需的過程，直至融合［22］。有研究表明可通過抑制MAPK 信號(hào)通路抑制其下游因子NFATC1和c-fos，并促進(jìn)成骨相關(guān)因子Runx2等的表達(dá)發(fā)揮抗骨質(zhì)疏松作用［23］。本實(shí)驗(yàn)通過免疫蛋白印跡方法檢測(cè)p-JNK、JNK、p-ERK、ERK 的蛋白表達(dá)，結(jié)果顯示溫腎通絡(luò)止痛方能夠降低p-JNK/JNK、p-ERK/ERK 的相對(duì)表達(dá)。這也提示溫腎通絡(luò)止痛方能夠通過調(diào)節(jié)TNF-α、IL-6 因子，激活MAPK 信號(hào)通路，影響炎癥反應(yīng)治療骨質(zhì)疏松癥。此外，本實(shí)驗(yàn)也通過HE 染色與qPCR 檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)溫腎通絡(luò)止痛方能夠增加POP 小鼠骨小梁，使其排列較為規(guī)整且致密，骨髓細(xì)胞較模型組增加，骨髓腔間隙減小，升高Runx2 的mRNA 表達(dá)，證明該復(fù)方具有抗POP的作用。

綜上所述，溫腎通絡(luò)止痛方可通過多成分、多靶點(diǎn)、多通路的方式來調(diào)控骨代謝，維持機(jī)體骨穩(wěn)態(tài)，并通過降低IL-6、TNF-α的表達(dá)水平，調(diào)節(jié)MAPK信號(hào)通路影響炎癥反應(yīng)等過程，從而調(diào)節(jié)骨穩(wěn)態(tài)，發(fā)揮治療作用。本研究利用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)與實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，為原發(fā)性骨質(zhì)疏松癥的治療及溫腎通絡(luò)止痛方防治原發(fā)性骨質(zhì)疏松癥的后續(xù)深入研究提供了科學(xué)依據(jù)。