張慧, 劉玲, 賀育蘭, 湯鮮, 李卓敏, 謝巍偉, 廖婷, 李路茜, 賀彩霞, 張先平

南華大學(xué)附屬婁底醫(yī)院生殖醫(yī)學(xué)中心(湖南婁底 417099)

據(jù)統(tǒng)計(jì)，全球約有15%的育齡夫婦存在不孕不育癥，其中約有40%～50%的不孕原因與男方因素有關(guān)[1-2]。若夫妻間經(jīng)1年無(wú)保護(hù)性措施的性生活后，未能使女方自然受孕者即為不育癥[3]。目前對(duì)于男性生育力的評(píng)估主要依靠精液常規(guī)分析。但有研究表明，仍有15%的男性不育癥患者精液常規(guī)分析結(jié)果提示正常，而精液常規(guī)參數(shù)提示異常者卻仍能使其配偶自然受孕[4]。另有研究發(fā)現(xiàn)，男性生殖細(xì)胞對(duì)DNA損傷極其敏感，精子DNA損傷是造成男性不育的主要原因之一[5]。精子DNA碎片指數(shù)(DNA fragmentation index，DFI)被認(rèn)為是反映精子DNA完整性的重要指標(biāo)，其是指在精子發(fā)生及成熟過(guò)程當(dāng)中，由于各種原因?qū)е戮覦NA完整性被破壞并產(chǎn)生斷裂碎片的程度。近年來(lái)，精子DFI評(píng)估精子內(nèi)在質(zhì)量及預(yù)測(cè)體外受精-胚胎移植/卵胞漿內(nèi)精子注射(in vitro fertilization and embryo transfer/intracytoplasmic sperm injection，IVF-ET/ICSI)助孕妊娠的研究結(jié)果仍存爭(zhēng)議[6-7]。本研究旨在探討精子DFI對(duì)IVF-ET/ICSI助孕后受精情況、胚胎發(fā)育及妊娠結(jié)局的影響，并分析精子DNA碎片產(chǎn)生的可能機(jī)制。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2019年8月至2021年4月于南華大學(xué)附屬婁底醫(yī)院行IVF-ET/ICSI助孕的61周期不孕不育癥夫婦。本研究經(jīng)過(guò)南華大學(xué)附屬婁底醫(yī)院倫理委員會(huì)審批同意[2019-倫審(科研)-044]，所有研究對(duì)象均自愿簽署知情同意書(shū)。納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)符合IVF-ET/ICSI助孕指征的女方盆腔、輸卵管因素或男方因素所致不孕不育癥患者；(2)女方年齡25～40歲，竇卵泡數(shù)(antral follicle count，AFC)≥5枚，基礎(chǔ)卵泡刺激素(basal follicle stimulating hormone，bFSH)≤10 mIU/mL，抗苗勒管激素(anti-mullerian hormone，AMH)≥1.2 ng/mL；(3)男方年齡25～50歲；(4)夫妻雙方染色體、生殖器官及性功能均正常。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)自然周期取卵助孕者；(2)女方合并Ⅲ～Ⅳ期子宮內(nèi)膜異位癥者；(3)男方為無(wú)精子癥、凍精解凍或睪丸/附睪穿刺取精者；(4)男方合并睪丸萎縮、生殖道畸形或泌尿生殖系統(tǒng)感染急性期；(5)夫妻雙方任何一方合并染色體異常及其他IVF-ET/ICSI助孕禁忌。

1.2 精子DFI檢測(cè)及實(shí)驗(yàn)分組 男方禁欲2～7 d，手淫法取精，嚴(yán)格按照精子DNA碎片檢測(cè)試劑盒(深圳博銳德生物科技有限公司)說(shuō)明書(shū)檢測(cè)精子DFI。根據(jù)精子DFI值分為對(duì)照組(DFI<25%，n=35)和觀察組(DFI≥25%，n=26)。精子DFI(%)=(存在精子DNA碎片的精子數(shù)/被觀察的精子總數(shù))×100%(正常參考值：DFI<25%)。

1.3 卵巢刺激和取卵 根據(jù)女方年齡、體重及體質(zhì)指數(shù)(body mass index，BMI)、AMH、AFC及既往卵巢刺激相關(guān)病史等擬定卵巢刺激方案進(jìn)行卵巢刺激。當(dāng)存在2～3個(gè)≥17 mm的主導(dǎo)卵泡、血雌激素(estradiol，E2)水平在每個(gè)主導(dǎo)卵泡平均≥200 pg/mL時(shí)，當(dāng)晚予注射人絨毛膜促性腺激素扳機(jī)，扳機(jī)34～38 h后B超引導(dǎo)下取卵。

1.4 精液標(biāo)本收集與精液常規(guī)分析 男方禁欲2～7 d，取卵當(dāng)日(oocyte pick-up day，OPU日)手淫法收集精液。待精液樣本充分液化后，按照WHO《人類(lèi)精液檢查與處理實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)》(第5版)標(biāo)準(zhǔn)行精液常規(guī)分析，使用密度梯度離心+上游法進(jìn)行優(yōu)化處理。

1.5 Western Blot檢測(cè)Bcl-2、Caspase-3蛋白表達(dá) 提取精子總蛋白，使用蛋白質(zhì)定量試劑盒(BCA法)測(cè)定蛋白濃度，取5 μL蛋白樣品行聚丙烯酰胺凝膠電泳，轉(zhuǎn)膜，5%脫脂牛奶封閉，加入一抗于4℃搖床孵育過(guò)夜，洗膜，加入二抗常溫?fù)u床孵育，洗膜，電化學(xué)發(fā)光(ECL)法檢測(cè)，凝膠圖像分析。

1.6 授精及體外培養(yǎng) 卵母細(xì)胞體外培養(yǎng)2～4 h后進(jìn)行授精，授精16～18 h觀察受精情況，42～44 h觀察卵裂情況，66～68 h進(jìn)行胚胎評(píng)分并酌情行囊胚培養(yǎng)或新鮮卵裂胚移植。參考《輔助生殖實(shí)驗(yàn)室技術(shù)》(第1版)標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行胚胎評(píng)分。

1.7 IVF-ET/ICSI妊娠結(jié)局隨訪(fǎng) 胚胎移植12～14 d測(cè)尿HCG及血清β-HCG確定是否生化妊娠。若確定生化妊娠者則在移植26～28 d陰道超聲檢查，以觀察到孕囊確定臨床妊娠，臨床妊娠者隨訪(fǎng)持續(xù)至胎兒分娩。

1.8 各種計(jì)算公式 (1)IVF 2PN受精率(%)= 2PN受精數(shù)/加精卵子數(shù)×100%,ICSI 2PN受精率(%)=2PN受精數(shù)/注射MII卵子數(shù)×100%;(2)2PN卵裂率(%)= 2PN卵裂胚胎數(shù)/2PN受精數(shù)×100%;可移植胚胎率(%)=可移植胚胎數(shù)/卵裂胚胎數(shù)×100%;優(yōu)質(zhì)胚胎率(%)=優(yōu)質(zhì)胚胎數(shù)/2PN卵裂胚數(shù)×100%;囊胚形成率(%)=形成囊胚數(shù)/培養(yǎng)囊胚數(shù)×100%;著床率(%)=孕囊數(shù)/移植胚胎數(shù)×100%;臨床妊娠率(%)=臨床妊娠周期數(shù)/移植周期數(shù)×100%;早期流產(chǎn)率(%)=妊娠12周前流產(chǎn)周期數(shù)/臨床妊娠周期數(shù)×100%;分娩率(%)=孕28周后分娩周期數(shù)/移植周期數(shù)×100%;活產(chǎn)率(%)=活產(chǎn)的分娩周期數(shù)/移植周期數(shù)×100%

2 結(jié)果

2.1 兩組基本資料比較 兩組雙方年齡、BMI以及女方bFSH、AFC、AMH、Gn總用量差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見(jiàn)表1。

表1 兩組患者基本資料比較

2.2 兩組OPU日精液優(yōu)化處理前、后精液常規(guī)參數(shù)比較 與對(duì)照組比較，觀察組OPU日優(yōu)化處理前精子活力和PR均下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。但OPU日優(yōu)化處理前精子濃度差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。此外，OPU日優(yōu)化處理后精子濃度、活力及PR均略下降，但差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見(jiàn)表2。

表2 兩組OPU日精液優(yōu)化處理前與精液優(yōu)化處理后精液常規(guī)參數(shù)比較

2.3 兩組OPU日精子細(xì)胞中Bcl-2、Caspase-3蛋白表達(dá)比較 與對(duì)照組比較，觀察組 OPU日精子Bcl-2 蛋白表達(dá)下降、Caspase-3 蛋白表達(dá)上升，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)表3、圖1。

圖1 兩組OPU日精子細(xì)胞中Bcl-2、Caspase-3蛋白表達(dá)

表3 兩組OPU日精子細(xì)胞中Bcl-2蛋白及Caspase-3蛋白表達(dá)比較

2.4 兩組IVF-ET/ICSI助孕后實(shí)驗(yàn)室和臨床結(jié)局比較 與對(duì)照組比較，觀察組2PN受精率、2PN卵裂率及囊胚形成率差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；可移植胚胎率、優(yōu)質(zhì)胚胎率、著床率、臨床妊娠率、分娩率及活產(chǎn)率均下降，早期流產(chǎn)率上升，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)表4。

表4 兩組IVF-ET/ICSI助孕后實(shí)驗(yàn)室和臨床結(jié)局比較 %(例)

2.5 精子DFI與OPU日精液優(yōu)化處理前、后精液常規(guī)分析參數(shù)相關(guān)性 精子DFI與OPU日精液優(yōu)化處理前精子活力呈輕度負(fù)相關(guān)(r=-0.285，P<0.05)，與禁欲時(shí)間、液化時(shí)間、精液優(yōu)化處理前精子濃度和PR均無(wú)相關(guān)性(r=-0.040、-0.023、-0.124、-0.210，P>0.05)；此外，精子DFI與OPU日精液優(yōu)化處理后精子濃度、活力、PR均無(wú)相關(guān)性(r=-0.213、-0.102、-0.124，P>0.05)。見(jiàn)表5。

表5 精子DFI與OPU日精液優(yōu)化處理前及處理后精液常規(guī)參數(shù)相關(guān)性分析

2.6 精子DFI與OPU日精子中Bcl-2和Caspase-3蛋白表達(dá)相關(guān)性 精子DFI與OPU日精子中Bcl-2蛋白表達(dá)水平呈負(fù)相關(guān)(r=-0.672，P<0.05)、與Caspase-3蛋白表達(dá)水平呈正相關(guān)(r=0.627，P<0.05)。

3 討論

據(jù)報(bào)道，精子DNA的完整性與精子質(zhì)量相關(guān)，高精子DFI可能影響男性生育力[8-9]。精子DFI可一定程度反映精子活力，且可能與精子濃度呈負(fù)相關(guān)[10-12]。但有學(xué)者指出，精液常規(guī)分析結(jié)果具有波動(dòng)性、容易受禁欲時(shí)間和生活作息等影響，且精子DNA損傷的病因錯(cuò)綜復(fù)雜，并不一定可從精子活力的異常上得以如實(shí)反映其導(dǎo)致的男性不育[13]。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，精子DFI異常升高時(shí)，優(yōu)化處理前的精子活力降低，且兩者呈現(xiàn)輕度負(fù)相關(guān)。因精子頭部控制精子運(yùn)動(dòng)，精子根據(jù)尾部鞭毛的擺動(dòng)方式產(chǎn)生直線(xiàn)或曲線(xiàn)運(yùn)動(dòng)，并由尾部中段外側(cè)包裹的線(xiàn)粒體鞘提供能量、調(diào)節(jié)精子運(yùn)動(dòng)。當(dāng)精子頭部DNA損傷時(shí)，可導(dǎo)致精子線(xiàn)粒體結(jié)構(gòu)和功能異常，從而使精子活力下降[14]。然而，通過(guò)密度梯度離心+上游法對(duì)精液進(jìn)行優(yōu)化處理之后，兩組精液常規(guī)分析結(jié)果無(wú)明顯差別，故推測(cè)即使依據(jù)OPU日精液常規(guī)分析結(jié)果，對(duì)IVF-ET/ICSI妊娠結(jié)局的獨(dú)立預(yù)測(cè)價(jià)值可能仍較為局限。

細(xì)胞凋亡與維持機(jī)體內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)、免疫以及各種疾病發(fā)生密切相關(guān)，是機(jī)體細(xì)胞程序性死亡必不可少的表現(xiàn)形式[15]。Bcl-2蛋白家族和Caspase蛋白家族在細(xì)胞凋亡中起重要作用。Bcl-2蛋白家族包括Bcl-2、Bax及Bcl-XL等，其家族成員可通過(guò)增加線(xiàn)粒體外膜通透性，調(diào)節(jié)線(xiàn)粒體凋亡途徑[16-17]。本研究發(fā)現(xiàn)，高精子DFI時(shí)，精子Bcl-2表達(dá)降低、Caspase-3表達(dá)上升，且均呈線(xiàn)性相關(guān)改變。當(dāng)Bcl-2表達(dá)降低時(shí)，精子線(xiàn)粒體膜平衡狀態(tài)被打破，線(xiàn)粒體通透性改變，促使細(xì)胞色素C(cytochrome C，CytC)和凋亡誘導(dǎo)因子等被轉(zhuǎn)運(yùn)至線(xiàn)粒體膜外，級(jí)聯(lián)激活Caspase家族，最終激活Caspase-3[15，18]?；罨蟮腃aspase-3可通過(guò)解切割DNA依賴(lài)的蛋白激酶和聚腺苷二磷酸核糖聚合酶等，進(jìn)一步影響DNA復(fù)制轉(zhuǎn)錄和損傷修復(fù)[19]。而CytC可與細(xì)胞質(zhì)中凋亡酶激活因子形成凋亡小體，進(jìn)一步降解細(xì)胞內(nèi)蛋白，使細(xì)胞發(fā)生不可逆死亡[20]。通過(guò)誘導(dǎo)Bax和線(xiàn)粒體外膜通道蛋白表達(dá)、抑制Bcl-2表達(dá)，可能加速精子凋亡[21]。

有研究表明，精子DFI對(duì)IVF-ET/ICSI助孕結(jié)局無(wú)明顯影響[13，22]。但有學(xué)者指出，精子DFI異常升高時(shí)，可能影響精卵結(jié)合及胚胎發(fā)育，降低受精率和優(yōu)質(zhì)胚胎率、增加早期流產(chǎn)率[23-27]。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，精子DFI異常升高時(shí)，2PN受精率、2PN卵裂率無(wú)明顯影響，但可移植胚胎率、優(yōu)質(zhì)胚胎率、著床率、臨床妊娠率、分娩率及活產(chǎn)率均明顯降低，且早期流產(chǎn)率明顯升高。分析原因可能為：精子本身、卵母細(xì)胞及受精后形成的受精卵對(duì)于精子DNA的損傷具有一定的修復(fù)作用；且父源性基因可能更多地是在胚胎4～8細(xì)胞階段才逐漸表達(dá)，故精子DFI異常升高對(duì)受精及合子卵裂并無(wú)明顯影響。

綜上所述，精子DNA碎片含量高可能降低IVF-ET/ICSI臨床妊娠率。精子DNA碎片發(fā)生機(jī)制可能與Bcl-2表達(dá)下調(diào)及Caspase-3表達(dá)上調(diào)有關(guān)，但其具體機(jī)制處于探索階段、目前尚不明確，仍需進(jìn)行更深入、多中心的研究。

利益相關(guān)聲明：所有作者均無(wú)利益沖突。

作者貢獻(xiàn)說(shuō)明：張先平負(fù)責(zé)尋找項(xiàng)目資金支持參與實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)、監(jiān)督及領(lǐng)導(dǎo)；張慧負(fù)責(zé)實(shí)驗(yàn)開(kāi)展、實(shí)驗(yàn)結(jié)果可視化及論文初稿撰寫(xiě)；劉玲、湯鮮、李卓敏負(fù)責(zé)病例收集及實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)的核實(shí)；賀育蘭、李路茜負(fù)責(zé)實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)及數(shù)據(jù)收集；謝巍偉、廖婷負(fù)責(zé)統(tǒng)計(jì)分析及數(shù)據(jù)整理；賀彩霞負(fù)責(zé)編輯及論文校對(duì)。所有作者均對(duì)論文進(jìn)行了批判性的修改。