關(guān)云, 高彥晨, 張興, 滕偉

1廣州中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院、廣東省中醫(yī)院口腔科(廣東廣州 510120)；2中山大學(xué)光華口腔醫(yī)學(xué)院、中山大學(xué)附屬口腔醫(yī)院修復(fù)科、中山大學(xué)口腔醫(yī)學(xué)研究所(廣東廣州 510055)

細(xì)胞表面的糖蛋白和糖脂存在含負(fù)電的唾液酸殘基，裸基因表面呈多陰離子電性，基因自發(fā)進(jìn)入體細(xì)胞是一個(gè)低效的過程[1-2]，因此，陽離子脂質(zhì)介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移已成為研究最廣泛和最常用的非病毒基因傳遞方法[3]。以聚乙烯亞胺(polyethylenimine,PEI)為代表的陽離子聚合物基因載體轉(zhuǎn)染效率與N/P(PEI中的氨基與DNA磷磷酸基團(tuán)的摩爾比值)有關(guān)，N/P越高，載體結(jié)合、壓縮DNA的能力越強(qiáng)，形成的復(fù)合物的粒徑越小，利于細(xì)胞胞吞，進(jìn)而有利于提高轉(zhuǎn)染效率[4]。然而N/P的增加也會(huì)帶來更強(qiáng)的正電性，導(dǎo)致細(xì)胞毒性增加，且不利于入胞后DNA的釋放，進(jìn)而影響轉(zhuǎn)染效率[5]。我們采用了一種新型的非病毒載體，由低分子量1.8 kD的PEI、疏水性的膽固醇(cholesterol, Cho)和親水性良好的陰離子氧化海藻酸鈉(anionic oxidized sodium alginate, OA)合成，新合成的陽離子聚合物叫做海藻酸鈉-聚乙烯亞胺-膽固醇嵌段共聚物脂多糖胺(lipopolysaccharide-amine, LPSA)。合成的LPSA可溶于水，并能在水中通過靜電作用形成可溶于水的納米囊泡載體。在口腔臨床工作中，由于遺傳因素、腫瘤、外傷等引起的，先天性或獲得性的頜骨缺損十分常見。2019年2—10月課題組應(yīng)用新型的LPSA陽離子脂質(zhì)納米顆粒，與骨形態(tài)生成蛋白2(bone morphogenetic protein 2, BMP2)質(zhì)粒(后文簡稱為pDNA)結(jié)合，以期構(gòu)成LPSA/pDNA復(fù)合物，為后續(xù)成骨誘導(dǎo)的相關(guān)研究奠定基礎(chǔ)。本研究探討不同N/P時(shí)，新型非病毒載體LPSA與pDNA構(gòu)建的復(fù)合物理化性能的變化。

1 材料與方法

1.1 主要試劑及儀器 非融合表達(dá)的人源性真核表達(dá)質(zhì)粒(產(chǎn)品編號：EX-A0241-M61；Gene-Copoeia公司，美國)；快速濾過法無內(nèi)毒素質(zhì)粒大提試劑盒(OMEGA公司，美國)；紫外分光光度計(jì)(Thermo公司，美國)，支鏈型聚乙烯亞胺(PEI；相對分子質(zhì)量1.8×103Da)、PEI 25 kD(相對分子質(zhì)量25×103Da)(Sigma公司，美國)；LPSA(由中山大學(xué)心血管循環(huán)輔助實(shí)驗(yàn)室合成并惠贈(zèng))；Lipofectamine 2000(Sigma公司，美國)；原子力顯微鏡(AFM, Shimadzu SPM-9500J3)；納米粒度及電位分析儀Zeta sizer Nano-ZS90 Nano series(Malvern Instruments公司，英國)；氨芐青霉素鈉(MDBio Inc，中國)；透射電鏡(JEOL公司，日本)；動(dòng)態(tài)光散射(dynamiclight scattering, DLS)儀(Malvern公司，英國)。

1.2 質(zhì)粒擴(kuò)增與檢測 質(zhì)粒擴(kuò)增：配置溶菌肉湯(lysogeny broth, LB)培養(yǎng)基，用平板劃線法，挑取pDNA大腸桿菌(GeneCopoeia公司，美國)單克隆菌落，接種于氨芐青霉素鈉濃度為30 μg/mL的溶菌肉湯培養(yǎng)液中，37℃搖床培養(yǎng)16 h，用Fastfilter Endo-Free Plasmid Maxi Kit(OMEGA公司，美國)提取、純化質(zhì)粒。DNA濃度采用紫外分光光度計(jì)(Thermo公司，美國)在260 nm紫外吸收法測定。用PBS(pH 7.4)分別將質(zhì)粒DNA稀釋至40 mg/mL，保存于-80℃?zhèn)溆谩?/p>

質(zhì)粒檢測：配制0.9%的瓊脂糖凝膠，置于TBE緩沖液中，將pDNA稀釋至40 ng/μL，37℃分別進(jìn)行Xho Ⅰ單酶切及Xho Ⅰ+Hind Ⅲ雙酶切2 h，與上樣緩沖液混合均勻后，110 V電泳0.5 h，紫外線照射下，拍攝圖片。

1.3 LPSA/pDNA復(fù)合物構(gòu)建 用無菌超純水將LPSA(1.85 mg/mL)稀釋成所需濃度，與pDNA(40 mg/mL)溶液等體積混合，輕輕吹打并渦旋混合3～5 s，25℃靜置30 min后立即使用。

1.4 LPSA/pDNA阻滯能力與N/P的關(guān)系 分別配制N/P(LPSA中的氨基與DNA磷酸基團(tuán)的摩爾比)為0(裸DNA)、2、4、8、10、60的LPSA/pDNA溶液；設(shè)置陰性對照PEI 25k/pDNA復(fù)合物(N/P為2)。制備0.9%的瓊脂糖凝膠(含0.1 μg/mL溴化乙錠)取10 μL樣本與2 μL上樣緩沖液混合均勻后，置于Tris-boric acid-EDTA(TBE)緩沖液中，上樣，110 V電泳0.5 h，紫外線顯影。

1.5 LPSA/pDNA粒徑及zeta電位與N/P變化關(guān)系 25℃，按前述步驟分別配制N/P為0、1.5、3、6、12、25、60的LPSA/pDNA溶液1.5～2 mL，置于Nano-ZS90型粒徑分析儀測定復(fù)合物的粒徑和ζ-電位。

1.6 LPSA/pDNA形貌觀察 形貌觀察：配制0.5 mg/mL的LPSA和LPSA/pDNA(N/P為60)各50 μL，25℃磷鎢酸負(fù)染30 min后，透射電鏡下觀察LPSA和LPSA/pDNA形態(tài)并測量直徑。

1.7 LPSA/pDNA體外耐酶降解實(shí)驗(yàn) 配制N/P為60的LPSA/pDNA溶液10 μL，與等體積1 U的DNase Ⅰ混合均勻，37℃分別放置1、2、4、6 h后，加入5 μL EDTA(100 mmol/mL)終止酶解反應(yīng)，37℃水浴10 min后，加入10 μL肝素(12 mg/mL)，25℃放置2 h置換DNA，取樣行凝膠電泳分析。陽性對照組為LPSA/pDNA未加DNase Ⅰ組；陰性對照組為pDNA加DNase Ⅰ孵育15 min。制備0.9%的瓊脂糖凝膠(含0.1 μg/mL溴化乙錠)取10 μL樣本與2 μL上樣緩沖液混合均勻后，置于Tris-boric acid-EDTA(TBE)緩沖液中，上樣，110 V電泳0.5 h，紫外線顯影[6]。

2 結(jié)果

2.1 質(zhì)粒制備 pDNA提純濃度為805.37 ng/μL。OD260/280為1.86，介于1.8～1.9之間，表明pDNA所含蛋白質(zhì)及RNA成分較少；OD260/230為2.14，接近正常范圍(2.0～2.5)下限，表明pDNA中小分子及鹽類物質(zhì)含量較少，證實(shí)所獲pDNA純度較高。

pDNA酶切實(shí)驗(yàn)結(jié)果示：Xho Ⅰ單酶切后，位于DNA marker約6 500+ bp處可見熒光條帶，Xho Ⅰ+Hind Ⅲ雙酶切后，1 000 bp marker條帶附近可見插入為人源性BMP2基因片段，大小為1 191 bp(圖1)。pDNA質(zhì)粒大小為7 748 bp(圖1)。

圖1 限制性內(nèi)切酶驗(yàn)證插入BMP2基因片段大小

2.2 LPSA/pDNA阻滯能力與N/P的關(guān)系 隨著N/P增加，當(dāng)N/P>4時(shí)，瓊脂糖凝膠電泳條帶熒光顯色逐漸變?nèi)?，阻滯在上樣孔中的DNA亮度增加，最終與陰性對照PEI 25k/pDNA一致；陰性對照組PEI 25k/pDNA只在上樣孔中可見DNA條帶熒光。表明，隨著N/P增加，LPSA/pDNA阻滯質(zhì)粒DNA能力增加；當(dāng)N/P>10時(shí)，LPSA可基本阻滯pDNA(圖2)。

注：A～G, LPSA/pDNA的N/P依次為：0，1，2，4，8，10，60；H, PEI 25k/pDNA

2.3 LPSA/pDNA粒徑及zeta電位與N/P變化關(guān)系 LPSA/pDNA復(fù)合物的粒徑隨著N/P比的增加先減小后增大，當(dāng)N/P>3時(shí)，LPSA/pDNA粒徑<150 nm；當(dāng)N/P為12～25時(shí)，LPSA/pDNA粒徑穩(wěn)定于65 nm左右，LPSA/pDNA表面zeta電位呈正電性，電荷值為9～35 mV。見表1。

表1 LPSA/pDNA粒徑及zeta電位隨N/P增加的變化

2.4 LPSA/pDNA的形貌觀察 透射電鏡下可見LPSA呈類球形、橢球形，直徑約10～25 nm(圖3-A)；LPSA/pDNA呈球形或橢球形空心囊泡狀，直徑約40～120 nm(圖3-B、C)。

注：A: LPSA; B、C: LPSA/pDNA

2.5 LPSA/pDNA抗酶解能力實(shí)驗(yàn) 當(dāng)N/P為60時(shí)，隨DNaseⅠ處理時(shí)間增加，4 h內(nèi)瓊脂糖凝膠電泳條帶亮度無明顯變化(圖4-C～E)，與陽性對照組(圖4-A)LPSA/pDNA條帶一致；6 h時(shí)瓊脂糖凝膠電泳條帶亮度稍微減弱(圖4-F)；陰性對照組pDNA與DNaseⅠ酶混合孵育6 h，可見B泳道模糊小分子DNA條帶泳出(圖4-B)；陽性對照組LPSA/pDNA未加DNaseⅠ酶孵育6 h仍可見清晰條帶。因此，在4 h內(nèi)LPSA/pDNA抗DNaseⅠ酶解，6 h 時(shí)LPSA對pDNA保護(hù)能力稍有下降(圖4)，見圖5。

注：A:LPSA/pDNA無DNaseⅠ在25℃孵育6 h；B:pDNA與DNaseⅠ混合6 h；C～F:LPSA/pDNA與DNaseⅠ混合時(shí)間依次為：1 h、2 h、4 h、6 h

圖5 LPSA/pDNA復(fù)合物粒徑及Zeta電位隨N/P比變化關(guān)系

3 討論

PEI是研究最深入的非病毒基因載體之一[7]。大量研究表明，分子量影響PEI的轉(zhuǎn)染效率和細(xì)胞毒性，這與PEI帶正電荷的胺基數(shù)量有關(guān)，因此，隨著分子量的增加PEI毒性也隨之增加。高分子量PEI(如PEI 25 kD)具有較高的轉(zhuǎn)染效率和轉(zhuǎn)染效率高細(xì)胞毒性，低分子量PEI(如PEI 2 000 Da)具有低功率細(xì)胞毒性和較低的轉(zhuǎn)染效率[8]，其DNA濃縮能力也相應(yīng)減弱[9]。各國學(xué)者通過在PEI上接枝生物可降解的鏈段，如：氧化海藻酸鹽、聚乙二醇及其衍生物、氨基酸片段等[10]，希望達(dá)到提高轉(zhuǎn)染效率并降低毒性的目的。曾有學(xué)者[8]將膽固醇接枝到PEI(1.8 kD)上，通過膽固醇受體通路介導(dǎo)的胞吞作用，提高復(fù)合物入胞能力，進(jìn)而提高轉(zhuǎn)染效率。經(jīng)膽固醇修飾后的載體既具有親水基團(tuán)有具有疏水基團(tuán)，在提高基因載體的血清穩(wěn)定性的同時(shí)，可使載體/pDNA復(fù)合物免受血清中脂肪酶、核酸酶和高密度脂蛋白的降解[9]。

LPSA通過在PEI(1.8 kD)上接枝Cho，形成疏水側(cè)鏈；帶負(fù)電荷的OA作為主鏈，與PEI接枝形成親水基團(tuán)，形成三嵌段兩親兩性脂質(zhì)共聚物L(fēng)PSA(OA-PEI-Cho)。選擇低分子量PEI是在最大程度降低共聚物毒性，保留其正電性及PEI固有的“質(zhì)子海綿效應(yīng)”[7, 10]。Cho作為側(cè)鏈的陽離子基因載體可有效提高了載體的膜流動(dòng)性、穩(wěn)定性；有效促進(jìn)基因藥物的釋放并降低毒性[9]；具有較強(qiáng)的DNA、siRNA結(jié)合能力[8]；疏水基團(tuán)的引入能幫助LPSA在水溶液或體內(nèi)環(huán)境形成納米粒子結(jié)構(gòu)，并介導(dǎo)LPSA通過膽固醇受體模式進(jìn)行胞吞，提高入胞效率，減少與細(xì)胞膜的接觸時(shí)間，進(jìn)而達(dá)到降低毒性并提高轉(zhuǎn)染效率的目標(biāo)。OA由帶陰離子醛糖環(huán)組成，用以屏蔽PEI的部分正電荷，降低載體毒性；OA醛糖環(huán)之間鏈接的糖苷鍵在體內(nèi)環(huán)境下可斷裂進(jìn)而降解，使其具有良好的生物相容性和可降解性。我們期望OA的引入，能克服陽離子脂質(zhì)體與表面電荷有關(guān)的缺點(diǎn)，如毒性和非特異性電荷干擾等[11]；能有效降低LPSA的表面正電荷，增加復(fù)合物穩(wěn)定性，具備陰離子特性，良好的生物相容性和體內(nèi)可降解性，最終能達(dá)到降低 LPSA 的細(xì)胞毒性的目的。

LPSA與DNA的結(jié)合能力，是評價(jià)其作為基因載體介導(dǎo)基因傳遞的先決條件，LPSA在合成過程中引入的Cho和OA降低了伯胺的密度，在一定程度上降低了其DNA結(jié)合能力，但是因?yàn)長PSA作為陽離子聚合物，具有親水核和被親水電暈包圍的封閉疏水膜，這一特有的納米囊泡結(jié)構(gòu)與其他具有固體核的納米載體不同，增加了載體表面可用的伯胺數(shù)量，能補(bǔ)償引入Cho和OA對LPSA的 DNA結(jié)合能力的影響。通過DNA凝膠電泳阻滯實(shí)驗(yàn)不難看出，在N/P為4～60時(shí)，上樣孔中的熒光條帶亮度增強(qiáng)，可自由泳出的DNA條帶亮度減弱(圖1)。說明，隨著N/P增加，底物中LPSA所占比例不斷增加，形成的LPSA/pDNA復(fù)合物隨之增加，而復(fù)合物在凝膠中的泳動(dòng)速率明顯低于DNA分子，從而，阻滯在上樣孔中的DNA量也隨之增多。當(dāng)N/P為10～60時(shí)，基本僅在上樣孔中看到熒光條帶，泳道中DNA條帶熒光基本消失，上樣孔條帶亮度與對照組PEI 25k/pDNA電泳圖像一致(圖1)。意味著，當(dāng)N/P>10時(shí)，底物中的LPSA已基本將DNA結(jié)合并阻滯在上樣孔中，形成LPSA/pDNA復(fù)合物能明顯阻滯 DNA移動(dòng)。由此可知，當(dāng)N/P>10時(shí)，LPSA可基本阻滯pDNA，有良好的DNA結(jié)合能力。

復(fù)合物粒徑大小與細(xì)胞內(nèi)吞過程有關(guān)，粒徑過大不利于細(xì)胞對復(fù)合物分子進(jìn)行胞吞，從而影響轉(zhuǎn)染效率[12]。基因轉(zhuǎn)染的過程中，通常要求復(fù)合物粒徑<150 nm[13-15]。LPSA/pDNA復(fù)合物的粒徑隨著N/P比的增加先減小后增大，當(dāng)N/P>3時(shí)，LPSA/pDNA復(fù)合物的粒徑約為均<150 nm，最小粒徑接近65 nm，滿足基因轉(zhuǎn)染載體的粒徑要求[6, 16]。圖5可看出，隨著N/P的不斷增加，LPSA/pDNA復(fù)合物粒徑先減小后緩慢增大，在N/P為12～25時(shí)，復(fù)合物粒徑趨于穩(wěn)定，約65 nm。隨著N/P的增加，LPSA作為陽離子基因載體對DNA的縮聚作用不斷增大，LPSA/pDNA復(fù)合物粒徑呈不斷減小的趨勢，此時(shí)復(fù)合物內(nèi)的縮聚作用占主導(dǎo)；隨著N/P進(jìn)一步增大，陽離子聚合物本身的正電性不斷增大，隨著電荷密度增大，LPSA/pDNA復(fù)合物粒徑呈緩慢增大的趨勢。

許多陽離子基因載體，在體外表現(xiàn)出很高的效率，但其表面通常有較高的電荷密度，因此在具有高轉(zhuǎn)染力的同時(shí)具有較強(qiáng)的細(xì)胞毒性。從文獻(xiàn)可知，陽離子聚合物基因載體的Zeta電位會(huì)對其基因負(fù)載能力和轉(zhuǎn)染效率產(chǎn)生很大影響[16-18]。復(fù)合物表面電荷會(huì)影響復(fù)合物被細(xì)胞胞吞的過程，從而進(jìn)一步影響載體的毒性及轉(zhuǎn)染效率。不同N/P對LPSA/pDNA復(fù)合物Zeta電位的影響列于表1，復(fù)合物表面始終呈正電性，間接證明了LPSA/pDNA表面是以帶正電性的基團(tuán)為外冠的，對細(xì)胞表面吸附及胞吞具有積極的促進(jìn)作用。當(dāng)N/P為1.5～25時(shí)，Zeta電位在一個(gè)較小的范圍(9.95～17.00 mV)波動(dòng)；隨著N/P進(jìn)一步增加，Zeta電位有進(jìn)一步增大的趨勢。由此可推測，pDNA表面所帶負(fù)電荷先被LPSA中和，電荷排斥作用減弱，并達(dá)到復(fù)合物縮聚的效果，隨著LPSA的增加，復(fù)合物表面的正電性增強(qiáng)。

陽離子聚合物/DNA復(fù)合物的表面電荷對其電穩(wěn)定性和對負(fù)電荷細(xì)胞膜的親和力非常重要。由實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知，在N/P>10時(shí)，LPSA與質(zhì)粒可完全復(fù)合，當(dāng)N/P<25時(shí)，Zeta電位穩(wěn)定在20 mV以內(nèi)，呈弱正電性，可極大降低其細(xì)胞毒性[16, 18-19]。以PEI為代表的陽離子聚合物/基因復(fù)合物隨著 N/P升高，載體結(jié)合、壓縮 DNA的能力越強(qiáng)，轉(zhuǎn)染效率轉(zhuǎn)染效率越高[7]；而復(fù)合物的正電性亦會(huì)越強(qiáng)，導(dǎo)致細(xì)胞毒性增加，且不利于入胞后 DNA的釋放，進(jìn)而影響轉(zhuǎn)染效率。在盡可能兼顧弱正電性及低細(xì)胞毒性的基礎(chǔ)上，我們選擇N/P為60的LPSA/pDNA作為進(jìn)一步觀察對象，此時(shí)，其粒徑大小符合基因轉(zhuǎn)染的需求，約為112 nm，LPSA 能夠較好地包裹 DNA 并形成粒徑較小的納米粒子。

在水溶液中，LPSA形成囊泡依賴于兩個(gè)主動(dòng)驅(qū)動(dòng)力，一是疏水基團(tuán)Cho的相互作用，另一則是PEI與OA的靜電相互作用。結(jié)果(圖3)顯示：LPSA 與LPSA/pDNA復(fù)合物均以類球形或坍塌的足球形狀存在，而不是一個(gè)充盈的球體。這與透射電鏡制樣、觀察過程有關(guān)。因?yàn)橥干潆婄R樣品需要在真空無水條件下進(jìn)行觀察，觀察過程中水分的蒸發(fā)使得納米球內(nèi)部中空，納米球囊塌陷，形成了內(nèi)陷囊泡狀的形貌。然而動(dòng)態(tài)光散射粒徑儀是在水溶液中進(jìn)行，并且DLS測定的結(jié)果是對溶液內(nèi)所有納米粒徑進(jìn)行測量，取正態(tài)分布平均值，可對LPSA與LPSA/pDNA粒徑進(jìn)行更準(zhǔn)確的評估。

納米陽離子聚合物載體在實(shí)現(xiàn)基因傳遞的過程中，克服了與細(xì)胞表面的結(jié)合及內(nèi)吞作用等重重困難之后，則需要逃避溶酶體的消化破壞[6, 19]。溶酶體逃逸[20]后，所載目的基因或藥物才有機(jī)會(huì)釋放到胞質(zhì)中發(fā)揮其功能。耐酶解試驗(yàn)中，證實(shí)4h內(nèi)，LPSA對pDNA分子具有耐酶解保護(hù)力，為躲避細(xì)胞內(nèi)的酶解反應(yīng)，實(shí)現(xiàn)基因傳遞入核奠定了基礎(chǔ)[6]。

大量陽離子基因載體轉(zhuǎn)染試驗(yàn)表明：在陽離子/DNA復(fù)合物中N/P比越大，基因轉(zhuǎn)染效率越高，但細(xì)胞毒性也越強(qiáng)[21]。細(xì)胞毒性的大小與復(fù)合物入胞時(shí)的理化狀態(tài)密不可分，本研究探究了LPSA與pDNA在何種N/P條件下，形成的LPSA/pDNA復(fù)合物的理化性能可達(dá)到最佳平衡點(diǎn)(最佳N/P比)[5, 22]，為進(jìn)一步探討其作為高效基因載體的可行性奠定基礎(chǔ)。本研究以PEI 25 kD作為陽性對照，將攜帶BMP2基因的質(zhì)粒和LPSA縮合成不同N/P比的復(fù)合物，探究N/P對LPSA/pDNA復(fù)合物理化性能的影響，就LPSA加載DNA的最佳N/P比進(jìn)行初步探討。證實(shí)：N/P為12～25時(shí)，LPSA與pDNA形成直徑約65 nm的陽離子復(fù)合物納米囊泡。N/P為60時(shí)，LPSA可有效結(jié)合pDNA，LPSA/pDNA在4 h內(nèi)，耐DNaseⅠ酶解。LPSA在基因遞送治療方面有廣闊的應(yīng)用前景。

利益相關(guān)聲明：所有作者共同認(rèn)可論文無利益沖突。

作者貢獻(xiàn)說明：關(guān)云直接參與實(shí)施研究,采集數(shù)據(jù),分析/解釋數(shù)據(jù),起草論文,統(tǒng)計(jì)分析,支持性貢獻(xiàn)。高彥晨采集數(shù)據(jù)，起草論文，統(tǒng)計(jì)分析，行政、技術(shù)或材料支持，支持性貢獻(xiàn)。張興對論文的知識(shí)性內(nèi)容作批評性審閱，行政、技術(shù)或材料支持，支持性貢獻(xiàn)。滕偉醞釀和設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)，分析/解釋數(shù)據(jù)，對文章的知識(shí)性內(nèi)容作批評性審閱，獲取研究經(jīng)費(fèi)，行政、技術(shù)或材料支持，指導(dǎo)，支持性貢獻(xiàn)。