崔利利,李婧瑜,徐鶴,楊子賢,馬云淑,4,5

(1.云南中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院,云南 昆明 650500;2.南京中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院,江蘇 南京 210023;3.云南省疾病預(yù)防控制中心,云南 昆明 650000;4.云南省傣彝學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,云南 昆明 650500;5.云南省南藥可持續(xù)利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,云南 昆明 650500)

克班寧(Crebanine,Cre)提取自防己科千金藤屬植物云南地不容StephaniayunnanensisLo塊根中[1],屬于異喹啉類阿樸菲型生物堿。阿樸菲型生物堿對(duì)離子通道、神經(jīng)系統(tǒng)、腎上腺受體等有一定的生物活性[2],其中離子通道作用主要表現(xiàn)為對(duì)Na2+通道、K+通道、Ca2+通道的阻滯。馬云淑等[3-7]對(duì)克班寧的抗心律失常作用做過(guò)深入研究,結(jié)果表明克班寧具有顯著的抗心律失常作用,具有較好的開發(fā)研究前景。目前研究表明，克班寧?kù)o注抗心律失常治療指數(shù)小,安全范圍窄,劑量不當(dāng)易導(dǎo)致中毒或死亡,且經(jīng)靜注或灌胃給藥的克班寧抗心律失常雖起效快,但持續(xù)時(shí)間短且作用不穩(wěn)定。

因此本研究將克班寧制備成透皮貼劑,以延長(zhǎng)作用時(shí)間,降低毒副作用。通過(guò)對(duì)比克班寧經(jīng)透皮和灌胃2種不同給藥方式的藥動(dòng)學(xué)參數(shù),比較經(jīng)皮和胃腸道吸收的差別。建立氯化鋇(BaCl2)致大鼠心律失常模型,考察克班寧貼劑抗心律失常的作用,在分子水平上探究克班寧抗心律失常的機(jī)制,為滿足臨床多途徑給藥及藥物增效減毒提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料

1.1 儀器

高效液相色譜儀(Agilent，1260);生物機(jī)能實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)(成都泰萌科技有限公司,BL-420E);氮吹儀(天津市恒奧科技發(fā)展有限公司,HSC-12A);微量紫外分光光度計(jì)(Eppendorf，D30)；數(shù)模轉(zhuǎn)換器(Axon，1550B)；信號(hào)放大器(Axon，200B)；電極拋光儀(Narishige，MF-830)；水平程控電極拉制儀(SUTTER Instrument，P97)；玻璃電極(World Precision Instrument，P97)。

1.2 試藥

克班寧(實(shí)驗(yàn)室自制,含量96.17%);克班寧標(biāo)準(zhǔn)品[8]:實(shí)驗(yàn)室自制(純度98%);丁香(Flos Caryophyllii)購(gòu)于昆明市螺螄灣中藥材專業(yè)市場(chǎng),經(jīng)鑒定為桃金娘科番櫻桃屬植物丁香EugeniacaryophyllataThunb.的干燥花蕾,按照2020版《中國(guó)藥典》揮發(fā)油測(cè)定法提取丁香揮發(fā)油,收率為9.63%,經(jīng)GC-MS檢測(cè),主要含丁香酚(66.10%)、β-石竹烯(25.02%)、乙?；∠惴?4.17%);鹽酸維拉帕米(中國(guó)食品藥品檢定研究院,批號(hào)：100223-200102)；甲醇(色譜純,MERCK);乙酸乙酯(分析純,天津市大茂化學(xué)試劑廠,批號(hào)：20150513)。

1.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

SD大鼠,SPF級(jí),體質(zhì)量250～300 g,雌雄各半,購(gòu)于湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司,許可證號(hào):SCXK(湘)2013-0004,倫理號(hào):No.R-062016002。

2 方法

2.1 克班寧貼劑的制備[9]

精密稱取處方量Eudragit EPO(0.625 g)、鄰苯二甲酸二乙酯(0.187 5 g)、丁二酸(0.031 25 g)、甘油(0.125 g)于燒杯中,加入克班寧(0.125 g),加入適量70%乙醇攪拌使完全溶解,而后分別加入基質(zhì)比1%的氮酮、基質(zhì)比3%的丁香揮發(fā)油制備含不同促滲劑的貼劑。將上述溶液均勻涂布于30 cm2的模具,45 ℃烘箱干燥1 h,取出,冷卻至室溫,覆合保護(hù)膜,即得克班寧貼劑。

2.2 溶液配制

2.2.1 對(duì)照品溶液的配制 精密稱取15 mg克班寧對(duì)照品于10 mL容量瓶中,甲醇溶解并定容至刻度線,得到1.5 mg·mL-1的克班寧對(duì)照品溶液,進(jìn)一步稀釋為0.033、0.833、1.667、3.333、6.667、16.667 μg·mL-1系列的克班寧對(duì)照品溶液,-20 ℃密封保存?zhèn)溆谩?/p>

2.2.2 內(nèi)標(biāo)溶液的配制 精密稱取維拉帕米10 mg至10 mL容量瓶中,用甲醇定容至刻度,進(jìn)一步稀釋得到100 μg·mL-1維拉帕米內(nèi)標(biāo)液,-20 ℃密封保存?zhèn)溆谩?/p>

2.2.3 克班寧溶液配制 稱取克班寧對(duì)照品100 mg于10 mL容量瓶中,加入1%檸檬酸水溶液適量超聲溶解,用飽和NaOH水溶液調(diào)節(jié)pH至6～7,再用生理鹽水定容至刻度,即得10 mg·mL-1的克班寧溶液。

2.3 血漿樣品的處理方法

精密吸取大鼠血漿樣品200 μL,加入100 μg·mg-1維拉帕米甲醇溶液20 μL,加入1 200 μL乙酸乙酯,渦旋振蕩3 min,4 000 r·min-1離心10 min,吸取上清液于50 ℃水浴上氮?dú)饬鞔蹈?加入150 μL甲醇渦旋3 min復(fù)溶,經(jīng)0.22 μm微孔過(guò)濾器過(guò)濾,HPLC進(jìn)樣分析。記錄色譜圖與峰面積。

2.4 方法學(xué)考察

2.4.1 色譜條件 Agilent 1260高效液相色譜系統(tǒng)。色譜柱:Agilent ZORBAX Extend-C18(5 μm,4.6 nm×250 nm);流動(dòng)相:甲醇-0.01%三乙胺(75∶25);流速:1 mL·min-1;檢測(cè)波長(zhǎng):280 nm;柱溫:30 ℃;進(jìn)樣量:25 μL。

2.4.2 專屬性考察 空白血漿，空白血漿中加入內(nèi)標(biāo)和克班寧溶液(由180 μL空白血漿、20 μL內(nèi)標(biāo)、20 μL克班寧甲醇溶液組成)以及克班寧貼劑給藥2 h后的血漿樣品分別按照“2.3”項(xiàng)處理方法(空白血漿內(nèi)標(biāo)溶液以同體積甲醇替代)處理進(jìn)樣,記錄色譜圖。分離度大于1.5,拖尾因子皆在0.95～1.05,理論塔板數(shù)大于4 000,克班寧與內(nèi)標(biāo)分離度好,均大于1.5,且內(nèi)源性物質(zhì)無(wú)干擾。結(jié)果見圖1。

注：A.空白血漿；B.空白血漿+內(nèi)標(biāo)+克班寧溶液;C.克班寧貼劑給藥；1.維拉帕米;2.克班寧

2.4.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線 精密吸取200 μL大鼠空白血漿,分別加入25 μL克班寧對(duì)照品溶液和20 μL內(nèi)標(biāo)溶液,按照“2.3”項(xiàng)處理方法處理進(jìn)樣。以克班寧和維拉帕米峰面積比值作為縱坐標(biāo)(Y),克班寧濃度(X)作為橫坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸。得標(biāo)準(zhǔn)曲線為:Y=0.543 5X-0.102 1(R2=0.999 3)。結(jié)果表明:克班寧血漿溶液在0.033～16.667 μg·mL-1之間線性關(guān)系較好。

2.4.4 精密度 于1 d內(nèi)3個(gè)不同時(shí)間精密吸取空白血漿200 μL,加入高(100 μg·mL-1)、中(50 μg·mL-1)、低(10 μg·mL-1)劑量克班寧甲醇溶液25 μL,n=3。按照“2.3”項(xiàng)處理方法處理進(jìn)樣,計(jì)算日內(nèi)精密度RSD分別為6.54%、7.53%、12.93%。連續(xù)3 d內(nèi)測(cè)定并處理進(jìn)樣,計(jì)算日間精密度RSD分別為5.57%、8.96%、10.44%。

2.4.5 回收率 精密量取空白血漿200 μL,分別加入配制的高(100 μg·mL-1)、中(50 μg·mL-1)、低(10 μg·mL-1)劑量克班寧甲醇溶液25 μL,n=3。按照“2.3”項(xiàng)處理方法處理進(jìn)樣,計(jì)算平均方法回收率,分別為(91.85±0.027)%、(96.90±0.016)%、(99.99±0.097)%,RSD分別為3.20%、2.34%、10.64%。計(jì)算平均回收率,分別為(105.75±0.038)%、(96.19±0.046)%、(98.50±0.160)%,RSD分別為3.39%、4.04%、11.11%。

2.4.6 穩(wěn)定性 精密量取空白血漿200 μL,室溫放置12 h,加入高(100 μg·mL-1)、中(50 μg·mL-1)、低(10 μg·mL-1)劑量克班寧甲醇溶液25 μL各3份,按照“2.3”項(xiàng)處理方法處理進(jìn)樣,計(jì)算室溫放置12 h穩(wěn)定性RSD分別為5.13%、4.89%、3.56%。另取上述高、中、低劑量克班寧甲醇溶液的血漿樣品各3份,于-20 ℃保存72 h后取出,按照“2.3”方法處理進(jìn)樣,計(jì)算-20 ℃凍融穩(wěn)定性RSD分別為4.94%、4.22%、2.42%。

2.5 克班寧貼劑給藥

取大鼠18只,體質(zhì)量250～300 g,雌雄各半,禁食24 h,不禁水。分別在給藥前一天脫去大鼠腹部毛,脫毛面積30 cm2,洗凈、飼養(yǎng)、待用。給藥劑量400 mg·kg-1。隨機(jī)分成克班寧貼劑陰性組(不含促滲劑的克班寧貼劑)、陽(yáng)性組(含1%氮酮的克班寧貼劑)、實(shí)驗(yàn)組(含3%丁香揮發(fā)油的克班寧貼劑)。給藥時(shí)貼劑黏貼于大鼠脫毛皮膚上,并用醫(yī)用膠帶固定。各組在給藥后0.5、1、2、4、6、8、10、12、24、30、36、48、60、72 h眼后叢靜脈采血于肝素鈉抗凝管中,離心后取上層血漿。

2.6 克班寧灌胃給藥

取大鼠6只,雌雄各半,禁食24 h,不禁水。給藥劑量為40 mg·kg-1?？税鄬幑辔附o藥后分別在0.083、0.25、0.5、1、2、4、6、8、10、12 h眼后叢靜脈采血于肝素鈉抗凝管中,離心后取上層血漿。

2.7 克班寧貼劑對(duì)BaCl2誘發(fā)大鼠心律失常模型的藥效學(xué)研究

SD大鼠60只,雌雄各半，于實(shí)驗(yàn)前一天將大鼠腹部毛去除干凈(30 cm2),禁食不禁水待用，分別為空白對(duì)照組(給予不含克班寧的空白基質(zhì)貼劑)、陽(yáng)性組(30 mg·kg-1維拉帕米灌胃)、陰性組(腹部脫毛后醫(yī)用膠帶給予束縛處理)、克班寧低劑量組(79 mg·kg-1)、克班寧中劑量組(158 mg·kg-1)、克班寧高劑量組(316 mg·kg-1)。陽(yáng)性對(duì)照組給藥30 min后、其他各組給藥10 h后,麻醉并仰臥固定于鼠板上,連接BL-420E生物機(jī)能實(shí)驗(yàn)系統(tǒng),穩(wěn)定5 min后記錄正常Ⅱ?qū)?lián)心電圖,2 min后舌下靜脈注射0.4%BaCl24 mg·kg-1,觀察記錄心律失常心電圖和恢復(fù)的心電圖。

2.8 膜片鉗Whole Cell記錄方法

選擇T-type和L-type兩種鈣通道,利用Patch Clamp技術(shù),Whole Cell記錄檢測(cè)克班寧對(duì)這些通道電流的影響。選取邊緣清晰、形態(tài)飽滿、細(xì)胞膜平滑的細(xì)胞,控制微電極操作儀使玻璃電極輕觸到所選細(xì)胞的細(xì)胞膜,給予負(fù)壓抽吸,當(dāng)封接電阻Rt值達(dá)到GΩ封接時(shí),補(bǔ)償快慢電容。破膜成功后將加藥管中空氣排出,使加藥管滴速保持在1～2滴·s-1,在顯微鏡下動(dòng)作輕且慢地將加藥管尖端放入胞外液中并懸至待測(cè)細(xì)胞上方。打開刺激程序,開始記錄。

2.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

3 結(jié)果

3.1 克班寧貼劑及灌胃給藥的藥動(dòng)學(xué)結(jié)果

克班寧貼劑給藥在大鼠體內(nèi)消除慢,具有緩釋作用。在克班寧貼劑陰性組(克班寧貼劑)、陽(yáng)性組(含1%氮酮的克班寧貼劑)、實(shí)驗(yàn)組(含3%丁香揮發(fā)油的克班寧貼劑)中，克班寧貼劑實(shí)驗(yàn)組的克班寧吸收程度最大,在大鼠體內(nèi)的停留時(shí)間最長(zhǎng)，給藥后迅速進(jìn)入大鼠體內(nèi),消除慢,且血藥濃度較高。與經(jīng)皮給藥比較,克班寧灌胃給藥在大鼠體內(nèi)血藥濃度變化符合一室模型,達(dá)峰時(shí)間顯著縮短,達(dá)峰濃度顯著提高,但血藥濃度下降快,維持時(shí)間短,結(jié)果見圖2～3、表1。

圖2 克班寧貼劑給藥血藥濃度-時(shí)間曲線

圖3 克班寧灌胃給藥血藥濃度-時(shí)間曲線

表1 克班寧經(jīng)皮、灌胃給藥在大鼠體內(nèi)的房室模型參數(shù)

3.2 克班寧透皮給藥與灌胃給藥對(duì)BaCl2致大鼠心律失常的影響

與陰性組比較,克班寧低、中、高劑量組恢復(fù)竇性心律所需的時(shí)間縮短(P<0.01)，給藥后10 min內(nèi)恢復(fù)竇性心律的鼠數(shù)增多(P<0.01，P<0.001),給藥后20 min內(nèi)恢復(fù)竇性心律的鼠數(shù)明顯增多(P<0.001)，恢復(fù)竇性心律后維持時(shí)間大于20 min的鼠數(shù)也顯著增多P<0.01)。結(jié)果見表2。

表2 克班寧貼劑經(jīng)皮與灌胃給藥對(duì)BaCl2致大鼠心律失常的影響

3.3 克班寧對(duì)心肌鈣通道的作用

結(jié)果顯示,30 μmol·L-1克班寧對(duì)T型鈣通道和L型鈣通道均有抑制作用,且這種抑制作用有劑量依賴性。對(duì)L-type鈣通道：3 μmol·L-1克班寧的抑制率為26%，10 μmol·L-1的抑制率為31%，30 μmol·L-1的抑制率為46%，100 μmol·L-1的抑制率為96%，300 μmol·L-1的抑制率為100%,通過(guò)Hill方程擬合出其IC50為46.62 μmol·L-1。對(duì)T-type鈣通道：3 μmol·L-1克班寧的抑制率為11%，10 μmol·L-1的抑制率為16%，30 μmol·L-1的抑制率為31%，50 μmol·L-1的抑制率為39%，100 μmol·L-1的抑制率為69%，300 μmol·L-1的抑制率為89%,通過(guò)Hill方程擬合出其IC50為72.70 μmol·L-1,結(jié)果見圖4～5。

圖4 30 μmol·L-1克班寧對(duì)L-type、T-type Ca2+通道的抑制作用

圖5 克班寧對(duì)L-type、T-type Ca2+通道的劑量效應(yīng)關(guān)系

4 討論

克班寧灌胃給藥在大鼠體內(nèi)血藥濃度變化符合一室模型,在胃腸道中吸收快,可以迅速進(jìn)入體內(nèi),但藥效結(jié)果表明灌胃給藥作用時(shí)間不夠持久,易反復(fù)。汪紅梅等[7]提出克班寧灌胃可對(duì)抗BaCl2致大鼠實(shí)驗(yàn)性心律失常。從本研究藥動(dòng)學(xué)結(jié)果可知,克班寧貼劑可長(zhǎng)時(shí)間持續(xù)緩慢釋放藥物,相對(duì)灌胃組可減少給藥次數(shù),延長(zhǎng)給藥時(shí)間?？税鄬幑辔附o藥的Cmax=(8.991±2.343)mg·L-1,克班寧貼劑實(shí)驗(yàn)組Cmax=(1.968±0.147)mg·L-1；且藥效學(xué)實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示，克班寧貼劑雖起效時(shí)間有延遲,但恢復(fù)竇性心律后大部分大鼠均不再出現(xiàn)心律失常反復(fù)。克班寧貼劑實(shí)驗(yàn)組AUC0-∞、Cmax明顯高于克班寧貼劑陰性組和陽(yáng)性組,提示含有3%丁香揮發(fā)油的克班寧貼劑實(shí)驗(yàn)組有較好的促滲作用,在體內(nèi)的吸收程度大,生物利用度高。綜上所述可知,與灌胃給藥相比,克班寧貼劑給藥在較低血藥濃度下就可發(fā)揮抗心律失常作用,且能長(zhǎng)時(shí)間保持一定血藥濃度水平,延長(zhǎng)作用時(shí)間,達(dá)到了減毒增效預(yù)期目標(biāo)。

在本實(shí)驗(yàn)中,貼劑藥動(dòng)學(xué)與藥效學(xué)給予的劑量不一致,是由于貼劑經(jīng)皮給藥劑量低,進(jìn)入血液含量較低,采用HPLC檢測(cè)不到藥物,故采用400 mg·kg-1給藥進(jìn)行藥動(dòng)學(xué)研究;而在藥效學(xué)實(shí)驗(yàn)過(guò)程中,通過(guò)預(yù)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)給予較低劑量即可發(fā)揮抗心律失常作用。克班寧來(lái)源于實(shí)驗(yàn)室自提,提取過(guò)程中需要大量的試劑及原藥材,出于節(jié)約資源等方面考慮,在藥效研究中選取低(79 mg·kg-1)、中(158 mg·kg-1)、高(316 mg·kg-1)三個(gè)給藥劑量。

據(jù)前期實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果,克班寧的靜脈注射半數(shù)致死量(LD50)是9.382 mg·kg-1,鹽酸克班寧氰基丙烯酸正丁酯微粒LD50是9.984 mg·kg-1,鹽酸克班寧PLGA納米粒LD50是13.619 mg·kg-1，鹽酸克班寧PELGE納米粒LD50是14.839 mg·kg-1,克班寧脂質(zhì)體LD50是16.085 mg·kg-1。而本研究中克班寧經(jīng)皮貼劑吸收穩(wěn)定且血藥濃度峰谷波動(dòng)小,經(jīng)預(yù)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)在較大載藥量與給藥面積(400 mg·kg-1)下也未觀察到大鼠中毒跡象,其呼吸、飲食、二便、日?；顒?dòng)、精神狀態(tài)均表現(xiàn)正常,無(wú)一例死亡,故未能求出經(jīng)皮給藥LD50。顯示了克班寧貼劑經(jīng)皮給藥安全高,毒性不明顯。

心律失常是一種常見病、多發(fā)病,分為快速性心律失常和緩慢性心律失常。臨床上治療快速性心律失常最有效的方法是導(dǎo)管消融。安裝起搏器仍是治療緩慢性心律失常唯一有效的治療措施,但這種治療措施會(huì)對(duì)身體造成創(chuàng)傷且費(fèi)用昂貴,不能廣泛使用。藥物治療還是患者首選的治療方案[10]。然而當(dāng)前臨床上用于治療心律失常的藥物仍是舊品種,常具有不良反應(yīng)[11-12]。劉景文等[13]提出胺碘酮和異丙腎上腺素聯(lián)用抗心律失常療效確切,有效率可達(dá)81.25%,但對(duì)緩慢性心律失常的治療效果不好。因此,開發(fā)治療效果好、副作用少的抗心律失常藥物是非常必要的。結(jié)合課題組前期研究可知,克班寧對(duì)KCNQ1/KCNE1、Kv1.5、T-type、L-type、Nav1.5這5個(gè)通道都有比較明顯的抑制作用,屬于多靶點(diǎn)抑制劑,對(duì)N型鈣離子通道和P/Q型離子通道沒有作用,這2種通道主要分布于神經(jīng)而不存在于心臟中。同樣值得關(guān)注的是克班寧對(duì)TRP通道的作用,克班寧能夠激活TRPA1通道而抑制TRPM8通道。初步探究的結(jié)果證實(shí)克班寧符合新Ⅲ類抗心律失常藥物的特點(diǎn),且制備為經(jīng)皮給藥后,對(duì)大鼠心律失常有明顯抑制作用,毒副作用顯著降低、安全性高,具有較好的開發(fā)研究前景。