王舒慧,楊明,朱衛(wèi)豐,陳麗華,李哲,吳文婷,管詠梅

(江西中醫(yī)藥大學/現(xiàn)代中藥制劑教育部重點實驗室,江西 南昌 330004)

天麻為蘭科植物天麻GastrodiaelataBl.的干燥塊莖,含苷類、酚類、甾醇、有機酸及糖類等多種成分,天麻素是天麻的主要活性成分[1]。天麻素藥理作用廣泛,不良反應小,在預防和治療中樞神經(jīng)系統(tǒng)相關疾病中發(fā)揮著積極作用。目前,天麻素臨床上主要給藥方式為口服和注射給藥。口服后由于其首過效應明顯,生物利用度較低,且有胃腸道不良反應;注射劑由于直接注射入血液中,毒副作用較大且患者耐受性差[2-5]。中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病的特點是患者精神壓力較大,且一般病程較長,往往需要多次給藥[6]。將天麻素開發(fā)成經(jīng)皮制劑則更加安全有效,能夠將其血藥濃度穩(wěn)定在治療窗,避免了肝首過效應,減少胃腸道副反應,提高生物利用度;具有一定緩釋作用,能夠減少給藥次數(shù),提高患者順應性[7-9]。

微針是指多個長度小于1 mm的細小針尖以陣列方式連接在基座上組成的貼片[10]。微針作為一種新型經(jīng)皮遞藥技術,能突破皮膚角質層的屏障作用,提供一種將藥物輸送到皮膚的微創(chuàng)途徑,可以使親水性小分子藥物、生物大分子藥物以及疫苗等原本不適合于經(jīng)皮給藥的藥物通過皮膚吸收[11-12]。其中可溶性微針因其載藥量高、生物相容性好、制備簡單等優(yōu)點而備受關注[13-14]。相比于僅針尖或背襯載藥可溶性微針,全載藥可溶性微針可實現(xiàn)針尖和背襯全方位載藥,提高藥物的載藥量和皮膚透過量,實現(xiàn)藥物透皮遞送[15]。因此,本研究進行天麻素全載藥可溶性微針制備工藝研究,以實現(xiàn)天麻素經(jīng)皮給藥的目的,為天麻素和此類水溶性小分子藥物經(jīng)皮給藥提供借鑒。

1 材料

微針模具(臺州微芯醫(yī)藥科技有限公司);BS124S電子分析天平(德國Sartorius公司);TGL-20MC臺式高速冷凍離心機(湖南湘鑫儀器儀表有限公司);KQ3200E超聲波清洗器(昆明市超聲儀器有限公司);EPED-ESL-10TH實驗室級超純水器(南京易普易達科技發(fā)展有限公司),Agilent 1260高效液相色譜儀(美國Agilent公司);QUANTA 250掃描電子顯微鏡(美國FEI公司);TA.newplus物性分析儀(美國ISENSO公司)；GZX-9140 MBE數(shù)顯鼓風干燥箱(上海博訊實業(yè)有限公司醫(yī)療設備廠)。

天麻素對照品(批號:JOT-10053,質量分數(shù)98.47%,成都普菲德生物技術有限公司);聚乙烯吡咯烷酮K30(PVP K30,批號:JO629A,大連美侖生物技術有限公司);透明質酸(HA,批號:C12295411,上海麥克林生化科技有限公司);氯化鈉注射液(批號:2009220721,辰欣藥業(yè)股份有限公司);乙腈(色譜級,批號:DW194121201,湖北弗頓科學技術有限公司);超純水[電阻率:18.2 MΩ·cm(25 ℃),南京易普易達科技發(fā)展有限公司];臺盼藍(批號:1019JO53，北京索萊寶科技有限公司)。

SPF級健康SD大鼠,體質量(200±20)g,購自江西中醫(yī)藥大學實驗動物中心,許可證號：SCXK(贛)2019-0004。所有動物實驗遵循江西中醫(yī)藥大學動物實驗倫理委員會有關實驗動物管理和使用的規(guī)定,均符合3R原則，實驗動物倫理批號：JZLLSC20220534。

2 方法與結果

2.1 HPLC方法學考察

2.1.1 色譜條件 色譜柱為ACE Excel C18(250 mm×4.6 mm,5 μm),流動相為乙腈-0.1%磷酸水溶液(5∶95),柱溫25 ℃;檢測波長為280 nm;體積流量1.0 mL·min-1;進樣量10 μL。

2.1.2 對照品溶液的制備 精密稱取天麻素對照品25 mg,加入超純水溶解,定容至25 mL,得1 mg·mL-1天麻素對照品溶液。

2.1.3 供試品溶液的制備 將制得的可溶性微針,分別加15 mL超純水使其完全溶解,過0.22 μm微孔濾膜,即得。

2.1.4 專屬性檢驗 將對照品、空白可溶性微針及全載藥可溶性天麻素微針制得的溶液進樣分析,記錄色譜圖(圖1)。

圖1 空白可溶性微針(A)、天麻素對照品(B)、全載藥天麻素可溶性微針(C)HPLC圖

2.1.5 線性關系考察 取“2.1.2”項下對照品溶液,用超純水稀釋成4、25、50、100、250、400、500 μg·mL-1的系列對照品溶液,在“2.1.1”項色譜條件下進樣測定,以進樣質量濃度為橫坐標(X),峰面積為縱坐標(Y),進行線性回歸,得回歸方程為Y=17.909X-5.347 2,r=0.999 9,結果表明天麻素在4～500 μg·mL-1時,質量濃度與峰面積具有良好的線性關系。

2.1.6 精密度試驗 取低、中、高3個濃度標準品溶液(25、200、400 μg·mL-1),在“2.1.1”項色譜條件下進行測定,連續(xù)進樣6次,記錄峰面積,結果表明,天麻素低、中、高質量濃度溶液的精密度RSD分別為0.15%、0.14%、0.05%,表明儀器精密度良好。

2.1.7 重復性試驗 取天麻素可溶性微針6份,分別溶解配制成質量濃度約為146.21 μg·mL-1的供試品溶液,過0.22 μm微孔濾膜,按“2.1.1”項下色譜條件測定質量濃度,結果表明,天麻素實際質量濃度平均值為(146.47±0.21)μg·mL-1,RSD為0.14%,該方法重復性良好。

2.1.8 穩(wěn)定性試驗 取供試品溶液,于0、2、4、6、8、10、12、24 h進樣,按“2.1.1”項下色譜條件測定質量濃度。結果顯示,24 h之內樣品的RSD為0.06%,表明供試品溶液在24 h內穩(wěn)定性良好。

2.1.9 加樣回收率試驗 取9份供試品溶液,分別加入同體積質量濃度為25、100、200 μg·mL-1對照品溶液,渦旋混合,過0.22 μm微孔濾膜,按“2.1.1”項下色譜條件測定質量濃度。以計算的質量濃度值和真實質量濃度值之比計算加樣回收率。結果顯示低、中、高質量濃度的加樣回收率分別為(100.52±1.17)%、(97.86±0.54)%、(99.01±0.04)%,RSD分別為1.17%、0.55%、0.04%,結果表明加樣回收率符合方法學要求。

2.2 天麻素全載藥可溶性微針的制備

通過預試驗最終篩選出PVP K30為制備微針針尖的最佳材料,HA為制備微針背襯層的最佳材料。

品牌的資產(chǎn)評估有比較成熟的模型可以借鑒，在沒有統(tǒng)一的閱讀推廣評估系統(tǒng)情況下，品牌資產(chǎn)評估不失為閱讀推廣服務直觀的評估方式。

采用兩步離心法制備可溶性微針。針尖材料的制備:按一定比例分別稱取天麻素與PVP K30于燒杯中,并加入一定量的超純水,配制質量分數(shù)為50%的PVP K30溶液。背襯材料的制備:按一定比例分別稱取天麻素與HA于燒杯中,并加入一定量的超純水,配制成質量分數(shù)為10%的HA溶液。將背襯材料倒入微針模具中,3 000 r·min-1離心10 min,刮去針尖外多余的基質溶液,干燥器室溫干燥30 min后,倒入背襯材料,3 000 r·min-1離心10 min,將模具置于干燥器內30 ℃干燥24 h后脫模即得。

2.3 天麻素全載藥可溶性微針的表征

參照“2.2”項下方法制備天麻素全載藥可溶性微針,用HPLC法測定其載藥量,并進行形態(tài)學、機械性能、皮膚穿刺性能和恢復性能考察。

2.3.1 形態(tài)學考察 將所制備的微針置于掃描電子顯微鏡下,觀察其形態(tài)學特征,見圖2。結果發(fā)現(xiàn),微針整體排列整齊,分布均勻,針體呈四棱錐狀、粗細均勻,長度為800 μm,底部直徑為410 μm,中心間距為800 μm。

圖2 天麻素可溶性微針掃描電鏡圖

2.3.2 微針含藥量測定 取6片制得的天麻素全載藥可溶性微針,分別溶于15 mL超純水中,按“2.1.1”項下色譜條件測定質量濃度,結果顯示所得每片微針含藥(5.45±0.14)mg。

2.3.3 機械性能檢查 利用物性分析儀來表征可溶性微針機械性能,選擇1/2探頭,設置測前速率為0.5 mm·s-1,測時速率為0.5 mm·s-1,測后速率為15 mm·s-1;觸發(fā)力為0.049 N[16]。通過物性分析儀測量微針針尖在探頭下壓過程中所受的應力與探頭位移之間的關系,所得的壓變曲線見圖3。隨著物性分析儀探頭的移動,所受的應力逐漸變大,力與位移曲線并未出現(xiàn)中斷或突然下降的情況,說明微針在受力過程中并未出現(xiàn)斷裂[17]。由圖3可知,當位移壓縮至0.8 mm時,應力可達(1.215±0.05)N。微針刺破皮膚所需的刺入力需大于0.05 N[18],本研究制得的天麻素全載藥可溶性微針的斷裂力要遠大于皮膚的刺入力,表明微針有較好的力學力度保證順利刺入皮膚。

圖3 天麻素全載藥可溶性微針壓變-應力曲線(n=3)

2.3.4 皮膚穿刺性能 離體皮膚的處理:取健康SD大鼠,腹腔注射10%水合氯醛,麻醉后用剃毛器剔干凈腹部的毛,取下皮膚,剝離脂肪組織和筋膜,用生理鹽水反復清洗后,用濾紙吸干,再用錫箔紙包裹,然后放入-20 ℃冰箱中保存。實驗結束后,處死大鼠。

圖4 經(jīng)微針扎過后皮膚臺盼藍染色結果

(2)組織學檢查 將SD大鼠用水合氯醛麻醉,腹部去毛擦干后,將載藥微針快速壓入脫毛的皮膚處按壓30 s后移除微針,1 min內立即剝離微針穿刺后的皮膚,放到4%多聚甲醛中固定24 h,脫水、浸蠟、包埋、切片、干燥、HE染色后,拍照觀察離體皮膚的刺入情況。如圖5所示,皮膚最外層呈深紫色的部分為薄薄的一層角質層,中間較薄的紫色為表皮層,最下面很厚的淡紫色部位為真皮層。天麻素可溶性微針可以成功刺破了皮膚角質層,進入到表皮層,表明微針突破了角質層的屏障,且未觸及到真皮層神經(jīng)末梢,能夠起到無痛給藥的效果。

圖5 微針刺入大鼠皮膚后的組織切片圖(×100)

2.3.5 皮膚恢復考察 對大鼠進行麻醉并固定四肢,將微針壓入大鼠背部脫毛處皮膚,并用醫(yī)用膠布固定。5 min后,拔出微針,觀察皮膚的恢復情況,期間每隔0.5 h對微針扎入的皮膚部位拍照,直至皮膚完全恢復,結果見圖6。皮膚恢復實驗結果顯示,微針拔出后可以明顯地在皮膚表面看到規(guī)則排列的微小針孔。微針在拔出1 h內皮膚恢復較快,針孔逐漸變得模糊。2 h后,微針扎過的皮膚部位幾乎觀測不到針孔,與周圍的皮膚紋理一致,已經(jīng)完全恢復。因此,本研究制備的微針生物相容性好,對皮膚無明顯損傷。

圖6 皮膚經(jīng)微針扎過后的恢復情況

2.4 體外經(jīng)皮滲透試驗

向Franz透皮擴散試驗儀(有效擴散面積為1.13 cm2,接收室容積為15 mL)內注入生理鹽水作為接收液,另按“2.3.5”項下方法取下大鼠腹部皮膚,將鼠皮置于供給池與接收池之間,角質層朝向供給池,皮膚組織朝向接收室,封口后置于池中[水浴(37±0.2)℃,350 r·min-1]平衡30 min。將制備好的微針剪掉針尖周圍背襯[面積為0.9 cm×0.9 cm,載藥量為(1.92±0.14)mg],并施加一定力度的力使微針刺入鼠皮,同時設立溶液對照組(藥物含量同載藥微針),排除氣泡使藥物貼合皮膚上層,開始計時。此后于1、2、4、6、8、10、12 h取樣0.8 mL,同時補充等量的37 ℃接收液,將透皮接收樣品液用0.22 μm微孔濾膜濾過,按“2.1.1”項下色譜條件測定其中藥物含量。通過公式(1)計算累積滲透量(Qn),通過公式(2)計算累積滲透率。以累積滲透率為縱坐標、對應的時間(t)為橫坐標作圖,繪制藥物累積滲透曲線。對透皮實驗的數(shù)據(jù)進行模型擬合,求出的斜率即為穩(wěn)態(tài)透皮速率Jss,見表1。

(1)

累計滲透率(%)=Qn/載藥量×100%

(2)

式中Qn為第n個時間點的單位面積累計透過量,A表示有效透皮面積,Cn為第n個點測得的藥物濃度,V為接收池體積,Vi為每次取樣體積。

結果見圖7,微針組天麻素在前4 h內快速釋放,累積滲透率為(84.60±15.79)%,隨后釋藥速率變緩,12 h后累積滲透率為(87.98±9.84)%。而溶液對照組天麻素在前12 h的累積滲透率僅為(12.10±5.88)%。因此，天麻素可溶性微針可大大地提高天麻素的皮膚透過量,并能增加藥物經(jīng)皮滲透速率,顯著提高藥物的透皮效果。

圖7 天麻素全載藥可溶性微針及其溶液對照的透皮累積滲透曲線

3 討論

本研究通過兩步離心法,成功制備了天麻素全載藥可溶性微針。微針由針尖與背襯層2部分構成,針尖的主要組成材料為PVP K30,背襯層則由HA構成,其中針尖和背襯層均含有藥物天麻素。制成的微針呈四棱錐狀,針尖機械性能良好,可刺穿大鼠皮膚,背襯層柔韌平整,貼合皮膚。微針處理后的皮膚在2 h內即可恢復到原來的狀態(tài),安全性良好。體外透皮試驗表明,微針對天麻素經(jīng)皮遞藥具有極大的促進作用,全載藥微針前4 h內快速釋放天麻素，其累積滲透率已大于80%,在12 h內藥物基本釋放完全,藥物累積滲透率約為87%,而溶液對照組天麻素12 h內累積滲透率僅為12%。

本文所制備的天麻素全載藥可溶性微針能有效穿透皮膚,克服角質層屏障,經(jīng)皮遞送效率高,成功實現(xiàn)了水溶性藥物經(jīng)皮給藥,有望應用于親水性藥物高效精準、無痛微創(chuàng)的經(jīng)皮遞送,并為給藥劑量大、給藥次數(shù)頻繁、生物利用度低的藥物給藥方式設計提供了思路。此外,研究過程中發(fā)現(xiàn)由于制備微針的材料PVP K30極易吸潮,受外界環(huán)境濕度的影響大,所制備的可溶性微針必須密封儲存,故針尖層的設計有必要開展進一步研究。